異育銀鯽中鯉皰疹病毒Ⅱ型載量測定方法的建立

李雙 ，吳霆 ，2，顧偉 ，孟慶國 ，王文

（1.南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇省水生甲殼動物病害重點實驗室，江蘇 南京 210023；2.寶應(yīng)縣水生動物疫病預(yù)防控制中心，江蘇 寶應(yīng) 225800）

1 引言

鯽魚是我國重要的淡水養(yǎng)殖魚類之一[1]，其分布廣，肉質(zhì)鮮美，營養(yǎng)豐富，一直受到我國消費者的青睞，具有重要的經(jīng)濟(jì)價值，養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，近幾年來，鯽魚呈現(xiàn)出越來越大的養(yǎng)殖潛力。據(jù)統(tǒng)計，2012年我國養(yǎng)殖鯽產(chǎn)量已達(dá)340多萬噸，在我國淡水養(yǎng)殖中占有十分重要的地位[2]，而異育銀鯽是中國科學(xué)院水生生物研究所培育出來的鯽魚的一個品種[3-4]，具有個頭大、出肉率及成活率高[5-6]、肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)豐富等特點，越來越受到廣大養(yǎng)殖戶的喜愛，其產(chǎn)量持續(xù)增長，并帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。

然而，大規(guī)模病害的爆發(fā)阻礙了異育銀鯽養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，如寄生蟲病、細(xì)菌性疾病、真菌性疾病、病毒性疾病等。2012年來，異育銀鯽養(yǎng)殖區(qū)出現(xiàn)了越來越嚴(yán)重的鰓出血性疾病，造成了大規(guī)模的死亡，帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，經(jīng)鑒定引起這種疾病的是鯉皰疹病毒Ⅱ型（CyHV-2），引起了廣泛研究者的研究興趣。CyHV-2最早于1992年在日本的金魚中被發(fā)現(xiàn)[7，10]，稱為“金魚皰疹病毒性造血器官壞死癥”，將該病毒稱“金魚造血器官壞死病毒”(Goldfish haematopoietic necrosis virus，GFHNV)[7，10]。2012年中國江蘇出現(xiàn)的CyHV-2是第二個從鯉科魚中分離出的病毒，國際病毒系統(tǒng)分類與命名委員會命名其為鯉皰疹病毒Ⅱ型(cyprinid herpes virusⅡ，Cy－HV-2)[8-9]，因其可造成鯽魚造血組織器官壞死，所以又稱該病毒為“皰疹病毒性造血器官壞死癥病毒”，(Herpes viral haematopoietic necrosis virus，HVHNV)[9,25－26]。鯉科魚皰疹病毒目前分為三個型，分別為鯉痘瘡病毒 （Carp pox herpes virus，Cyprinid herpes virus，CyHV-1）；鯉皰疹病毒Ⅱ型（CyHV-2）及錦鯉皰疹病毒（Koi herpes virus，Cyprinid herpes virus 3，CyHV-3）。CyHV-2與CyHV-3關(guān)系較近，而與CyHV-1關(guān)系較遠(yuǎn)[9-10]；CyHV-2核衣殼呈六邊形，直徑為100～110 nm；CyHV-2病毒具有囊膜，呈橢圓形，直徑為 175～200 nm[11-12]。CyHV-2具有高致病性，病死率可達(dá)90%～100%，主要感染金魚，鯽魚及其變種，不感染鯉魚和錦鯉。該病發(fā)病水溫范圍為15～32 ℃，流行高峰為20～28℃[13-14]。魚發(fā)病時表現(xiàn)的病癥為活動緩慢，不活潑，鰓部和鰭基部有出血點，魚鰾有出血斑點，尾鰭末端發(fā)白等。

目前對該病毒的檢測方法主要有普通PCR[15]、巢式 PCR[16]、環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增[17-18]、電鏡觀察[19]、細(xì)胞培養(yǎng)分離法[20]等。實時熒光定量PCR技術(shù)具有靈敏度高、特異性好、快速準(zhǔn)確方便等優(yōu)點，既能定性檢測也能夠定量檢測，在水生病原微生物的檢測中得到了廣泛的應(yīng)用。定量檢測異育銀鯽體內(nèi)的CyHV-2有基于TaqMAN探針方法的熒光定量PCR方法的建立，但是沒有基于SYBR Green法建立的熒光定量PCR檢測方法，且利用熒光定量PCR來研究CyHV-2在魚體內(nèi)組織器官分布的報道還是一片空白?；赟YBR Green法簡單快捷等特點，本文建立了SYBR Green法實時熒光定量PCR定量方法，并研究了魚體內(nèi)各個器官的病毒載量，體現(xiàn)了不同器官CyHV-2的分布情況，為該病毒的免疫學(xué)研究提供了數(shù)據(jù)和奠定了研究基礎(chǔ)。

2 材料與方法

2.1 實驗魚和病毒來源

2.1.1 實驗健康魚 試驗用健康100尾異育銀鯽來自于江蘇省寶應(yīng)縣沒有發(fā)病史的養(yǎng)殖塘口，Cy－HV-2 PCR檢測陰性，體質(zhì)量為280～400 g，養(yǎng)殖在紫外殺菌水控溫增氧循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)（上海海圣）中，溫度控制在26～28℃，在處理前先暫時養(yǎng)殖1周。

2.1.2 病毒來源 CyHV-2病毒由江蘇省寶應(yīng)縣具有明顯出血病發(fā)病癥狀、且CyHV-2 PCR檢測陽性的異育銀鯽體內(nèi)分離得到，病魚來自江蘇寶應(yīng)縣養(yǎng)殖戶發(fā)病塘口，發(fā)病當(dāng)天將這些垂死新鮮病魚收集起來用于病毒液的提取。

2.2 生物實驗試劑

PBS配方：磷酸緩沖液PBS(pH 7.5)100 mL A液：2.53%NaH2PO4·2H2O 83 mL；B 液：2.52%NaOH 17 mL。

5%chelex-100配方：稱取5 g chelex-100固體顆粒放入100 mL ddH2O中，混勻，放于4℃冰箱保存。

Chelex-100、protease K、2 000 DNA Marker、2×EasyTay PCR Super Mix、滅菌雙蒸水等均購自南京百斯凱生物公司。SYBR premix Ex TaqⅡ購自Takara公司。RNAfree水購自北京全式金生物公司。

2.3 實驗方法

2.3.1 病毒的分離與純化 用75%酒精消毒病魚，解剖后取病魚的腎臟、鰓，放在勻漿器里，然后加5 mL PBS在冰上研磨3～5 min；將研磨液倒入50 mL離心管中放入離心機(jī)中4 000 r/min室溫離心10 min；將上清液轉(zhuǎn)移至另一支新的50 mL離心管中；在超凈工作臺中純化病毒粗提液，先用1 mL PBS潤濕0.22 μm濾器，然后病毒粗提液經(jīng)0.22 μm濾器后過濾至新的50 mL離心管中；將過濾的病毒液分裝在1.5 mL的離心管中放4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.2 病毒回感和病魚組織的獲取 取兩支病毒液1 mL，每尾健康魚進(jìn)行胸鰭注射100 μL，共回感20尾，之后每天觀察魚的發(fā)病特征和有無死亡。取有典型發(fā)病癥狀魚的腎、鰓、脾、肝、腸、肌肉和卵，用于DNA的提取。

2.3.3 DNA的提取 將獲取的組織（0.1～0.5 g）放入1.5 mL離心管中，然后用牙簽攪碎成勻漿狀；加入200 μL 5%chelex和20 μL蛋白酶K至組織勻漿液，旋渦儀振蕩混勻，56℃水浴鍋中水浴20 min，用漩渦器振蕩混勻后再99℃水浴鍋水浴8 min；之后4 ℃，12 000 r/min，離心 4 min，之后取上清，用移液槍輕輕轉(zhuǎn)移到另一新離心管中即為DNA粗提液，標(biāo)記好后置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.4 普通PCR檢測

2.3.4.1 引物設(shè)計 引物設(shè)計參考文獻(xiàn)設(shè)計和合成引物：

CyHVpol-F:5'-CCCAGCAACATGTGC-GACGG-3'；

CyHVpol-R:5'-CCGTARTGA-GAGTTGGCGCA-3'。

擴(kuò)增CyHV-2特異性聚合酶基因362 bp片段。

2.3.4.2 PCR擴(kuò)增體系 上下游引物1μL，2×Easy－Tay PCR Super Mix 12.5 μL，滅菌雙蒸水 10 μl，DNA 模板 0.5 μL，總共 25μL，混勻。

2.3.4.3 PCR擴(kuò)增程序 PCR反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性 3 min；94℃變性 3 s、56 ℃退火 15 s、72℃延伸10 s，35次循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保溫。

2.3.4.4 瓊脂糖凝膠電泳 取5 μL PCR產(chǎn)物于1.2%的瓊脂糖凝膠電泳跑膠，120 V，25 min，并在紫外燈下查看擴(kuò)增效果，檢測有無目的基因片段的擴(kuò)增。

2.3.5 熒光定量PCR

2.3.5.1 引物設(shè)計 利用Primer 5設(shè)計引物如下：

CyHV-16-QF:5'-TTACTGGAGGTCGGTGAAGG-3'；

CyHV-16-QR:5'-CGTCTGGAAAGCGTGTGACT-3'。

2.3.5.2 實時熒光定量PCR體系 熒光定量PCR體系共 10 μL，上下游引物各 0.4 μL，SYBR Green核酸染料加 5μL，RNA free H2O 3.2 μL，DNA 模板1 μL。

2.3.5.3 實時熒光定量PCR反應(yīng)程序 預(yù)變性：95℃，5 min；擴(kuò)增 40個循環(huán)：95 ℃，10 s，60 ℃，30 s；溶解曲線：95 ℃，15 s，60 ℃，1 min，95 ℃，15 s。

3 實驗結(jié)果

3.1 普通PCR檢測結(jié)果

在實驗前，為了保證實驗順利進(jìn)行，在給健康魚注射病毒前，對用于提取病毒液的4條垂死病魚的腎組織進(jìn)行了普通PCR檢測，看這些病魚是否真正的感染上病毒，得到的結(jié)果如下圖1，可以看到這4條魚的檢測結(jié)果中，4條病魚的腎組織皆為陽性。總之，這些病魚提取的病毒液可以放心用于人工回感。另外，回感過后也對提取的病毒液進(jìn)行了PCR檢測，結(jié)果也呈陽性。

圖1用于提取病毒液的病魚組織PCR結(jié)果

3.2 疾病感染癥狀

圖2異育銀鯽人工感染鯉皰疹病毒Ⅱ型后的疾病癥狀和健康魚的對比（A：感染3d后有明顯病癥的病魚；B：健康魚作為對照）

與正常魚相比，回感的魚出現(xiàn)行動緩慢等反應(yīng)。從第2天開始魚出現(xiàn)了輕微病癥，第3天開始出現(xiàn)死亡，都有明顯的病癥：鰭基部有出血點、尾鰭末端發(fā)白、眼球突出、行動緩慢等，第7天90%回感魚死亡。

3.3 溶解曲線

在real-time PCR擴(kuò)增40個循環(huán)后，進(jìn)行了溶解曲線分析，表明該引物的的特異性較強(qiáng)。由得到的溶解曲線可以看出CyHV-2的溶解溫度為84.5℃（如圖3）。而陰性對照沒有擴(kuò)增信號。

圖3 CyHV-2 real-time PCR擴(kuò)增40個循環(huán)后產(chǎn)物的溶解曲線

3.4 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將獲取的DNA模板測定濃度后，10倍梯度稀釋，分別以 6.07×108～6.07×102copies/L 為模板，進(jìn)行熒光定量PCR檢測，檢測結(jié)果見表1、圖4，計算并得出標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=-3.6399x+36.941，R2=0.9998。3.5 QRT-PCR檢測CyHV-16的組織分布

表1熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制相關(guān)數(shù)值

圖4熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線.橫坐標(biāo)為CyHV-16基因拷貝數(shù)的對數(shù)值；縱坐標(biāo)為起始擴(kuò)增的循環(huán)數(shù)

QRT-PCR檢測CyHV-16在發(fā)病異育銀鯽各個組織的表達(dá)分布，圖5結(jié)果顯示CyHV-16幾乎分布在被感染的異育銀鯽的各個組織和器官，如脾臟、腎臟、鰓、肝臟、腸道和肌肉組織等，但是卵巢中未檢測到。其中CyHV-16在脾臟組織中表達(dá)量最高，在腎、肝臟和鰓中次之，肌肉組織中表達(dá)量較少。

圖5 QRT-PCR檢測CyHV-16在不同組織中的表達(dá)分布差異分析

4 討論

鯽魚是我國重要的淡水養(yǎng)殖品種，而異育銀鯽因其生長快速，食性雜，易飼養(yǎng)，含肉率高，味道鮮美，營養(yǎng)價值高而廣受消費者的青睞，對我國淡水養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展起著重要的作用，而疾病對其造成了一定的經(jīng)濟(jì)損失，因此，對異育銀鯽病害的防治對淡水養(yǎng)殖業(yè)的越來越好的發(fā)展至關(guān)重要。CyHV-2是目前危害異育銀鯽養(yǎng)殖業(yè)最大的病原，可造成100%的病死率，因此，建立一種CyHV-2定量檢測技術(shù)對于有效預(yù)防控制該病毒具有重要的意義。

目前對病毒的檢測方法中，應(yīng)用最為廣泛的是PCR檢測。Goodwin等基于CyHV-2聚合酶基因建立的PCR方法將取自美國患鯉皰疹病毒Ⅱ型病的金魚組織中提取的DNA擴(kuò)增出目的基因片段，且目的基因序列與Waltzek等[11]報道的CyHV-2基因序列也有99%以上的一致性。薛忠儀等[8]建立了一種快速檢測CyHV-2的PCR檢測方法，該方法運用Chelex-100這一離子螯合劑快速粗提組織DNA[8]，該方法提取快速簡單，大大縮短了提取時間，僅僅需要1 h內(nèi)就可完成實驗，大大提高了CyHV-2檢測的效率。但是該方法只能粗略的檢測組織中有無CyHV-2，卻無法定量病毒數(shù)的多少。于力等[12]人建立的Taqman實時熒光PCR方法，他們依據(jù)CyHV-2的主要衣殼蛋白MCP基因，不僅設(shè)計了普通PCR引物，還設(shè)計了Taqman熒光探針引物，比較繁瑣，而且他們對所有病魚組織混在一塊提取DNA，只是對該病毒與其他病原菌做對比，進(jìn)行特異性和靈敏性驗證，并不能看出病魚各個組織中該病毒的分布情況；周勇等[21]雖然建立了Taqman實時熒光PCR定量CyHV－2的方法，是試驗中合成探針引物，過程較復(fù)雜，并且沒有進(jìn)一步研究CyHV-2在各組織的分布情況。而本文建立的Realtime PCR方法（SYBR Green法）在快速提取DNA的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改良，簡單快速，不需要設(shè)計合成探針引物等優(yōu)點，不僅能夠定性檢測，而且可以定量病毒載量的多少，是一種即快速準(zhǔn)確又能定量各個組織內(nèi)病毒拷貝數(shù)的有效的檢測方法，在此基礎(chǔ)上本文還調(diào)查了各組織中該病毒的不同分布。

綜上可知，本研究基于Chelex-100快速提取核酸的基礎(chǔ)上，建立了快速靈敏高效的Realtime PCR方法（SYBR Green法），可以定量異育銀鯽體內(nèi)Cy－HV-2拷貝數(shù)，這對以后研究該病毒的致病機(jī)理提供了一定的數(shù)據(jù)參考，為以后有效地預(yù)防和控制該病奠定了基礎(chǔ)。

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