蜱絲氨酸蛋白酶抑制分子Serpin研究進展

楊苗苗,周金林

(1.上海師范大學生命與環(huán)境科學學院,上海 200234; 2.中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所,上海 200241)

地球上生活著15 000多種吸血節(jié)肢動物，占總量約5%的蜱類卻備受人們關(guān)注，因為它們是動物疾病的第一大傳播媒介，在人類疾病傳播中是僅次于蚊子的第二大媒介節(jié)肢動物。長期以來，蜱傳病一直是困擾世界上眾多國家和我國畜牧業(yè)發(fā)展的重大疾病。目前，蜱及蜱傳病的控制主要依靠藥物滅蜱，但隨之出現(xiàn)的環(huán)境污染、食品安全和蜱的抗藥性等問題，迫切需要尋找新的可持續(xù)控制策略。因此，了解蜱的基本生理學分子基礎(chǔ)對于研究蜱及蜱傳病的新型防治策略十分重要。而絲氨酸蛋白酶抑制分子(serine proteinase inhibitors,Serpin)在包括食物消化[1]、血液凝固[2-6]、病原體傳播[7-8]、炎癥反應(yīng)[9-10]和免疫應(yīng)答[11]等多種生理過程中都發(fā)揮作用。目前，對蜱的Serpin分子結(jié)構(gòu)已有相對明確的研究，一些蜱體內(nèi)存在不同種類的Serpin分子也陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，功能被發(fā)掘，無疑這些研究將為Serpin分子在防治蜱及蜱傳病上的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 Serpin分子結(jié)構(gòu)

Serpin是一類蛋白酶抑制分子超家族，含有350個～500個氨基酸殘基，分子質(zhì)量范圍為40 ku～60 ku，其典型標志是含有反應(yīng)中心環(huán)，并有一個在P1和P1之間可被靶酶剪切的位點。因其活性中心必有1個絲氨酸殘基，所以被稱為絲氨酸蛋白酶抑制分子。Serpin是成員最多、分布最廣、功能多樣的蛋白酶抑制分子家族，目前在人類、動物、植物、細菌和病毒中已有超過1 500名成員陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)。因它們的活性部位都含有His、Asp和Ser，具有相同的催化機制，但它們與反應(yīng)底物結(jié)合部位的差異又決定了其專一性。Serpin抑制絲氨酸蛋白酶的機制是一旦與靶蛋白結(jié)合，Serpin發(fā)生構(gòu)像改變，與靶蛋白酶形成緊密復(fù)合物，兩者均失活，且反應(yīng)不可逆，因此Serpin被稱為“自殺性”抑制劑。

Serpin可分為2種不同的類型，即典型的抑制劑和非經(jīng)典的抑制劑。絲氨酸蛋白酶抑制劑和其靶蛋白酶之間的相互作用與底物結(jié)合相似，并且結(jié)合環(huán)中單個肽鍵的切割導致絲氨酸蛋白酶抑制劑的構(gòu)象變化。典型的抑制劑通過暴露的凸起的結(jié)合環(huán)結(jié)合酶，對接到導致蛋白酶失活的蛋白酶的活性位點。隨后典型抑制劑通過其N末端片段與靶蛋白酶相互作用，這是活性位點外的二級相互作用，以增強識別的親和力、速度和特異性[12]。

2 蜱 Serpin的多重功能

目前，在蜱中報道的約有120種Serpin分子[13]。波特及其同事通過在鈍眼蜱屬Amblyommamaculatum轉(zhuǎn)錄組中查找同源絲氨酸蛋白酶分子，發(fā)現(xiàn)了32個Serpin分子，除此之外,至少50種絲氨酸蛋白酶抑制分子在Amblyommasculptum[13]，36種絲氨酸蛋白酶抑制分子在Ixodesricinus的轉(zhuǎn)錄物被發(fā)現(xiàn)[14-15]。最近還報道了Hyalommaexcavatum唾液組織中10種不同的絲氨酸蛋白酶轉(zhuǎn)錄物[16]，顯示了其具有物種保守和特異性。Serpin在P1位點具有堿性或極性不帶電荷的氨基酸殘基保守性[17]。近年來，對蜱的基因組和轉(zhuǎn)錄組學研究，揭示了蜱體高豐度的Serpin編碼基因。例如，相比3 100 Mbp基因的人類基因組編碼36個Serpin基因，2 100 Mbp的肩突硬蜱基因組卻編碼45個Serpin基因[12]。迄今為止，通過高通量測序技術(shù)、基因克隆和生物信息學分析等手段，已在10多個蜱種發(fā)現(xiàn)Serpin分子編碼基因，如具尾扇頭蜱、美洲花蜱、長角血蜱和篦子硬蜱等。盡管確定的轉(zhuǎn)錄物數(shù)量很多，但只有少部分Serpin功能被深入探究。

與小分子量的可逆性結(jié)合的絲氨酸酶抑制分子(如Kunitiz-type serine protease inhibitor)相比，Serpin分子作用快速高效。大部分Serpin都表現(xiàn)出蛋白酶抑制劑活性，在多種生理過程中發(fā)揮作用，包括食物消化，血液凝固，病原體傳播，炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答，部分人類Serpin還具有激素轉(zhuǎn)運、分子伴侶和腫瘤抑制功能[18]。對于一些節(jié)肢動物Serpin分子的研究表明，它們在調(diào)節(jié)內(nèi)源性蛋白酶平衡、先天性免疫反應(yīng)、發(fā)育和生殖等方面具有重要作用。

2.1 Serpin在免疫上的作用

研究發(fā)現(xiàn)節(jié)肢動物絲氨酸蛋白酶主要有免疫和止血功能，并且其主要通過血淋巴參與免疫調(diào)節(jié)。此外，在吸血節(jié)肢動物中，絲氨酸蛋白酶還可直接影響到宿主的免疫調(diào)節(jié)。事實上，已證實幾種昆蟲絲氨酸蛋白酶抑制分子起到抗補體蛋白和免疫抑制劑作用[11]。作為絲氨酸蛋白酶含量豐富的蜱，它們的功能之一就是調(diào)節(jié)宿主免疫系統(tǒng)。

篦子硬蜱免疫抑制劑(Ixodesricinussalivary serpin，Iris)是第1個對宿主免疫防御機制有影響而被命名的蜱Serpin分子。Iris具有3個顯著的特點：①Iris具有抑制T細胞和脾細胞增殖并改變外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)來源的細胞因子分泌水平的功能；②Iris顯示抗凝血活性，包括凝血和纖維蛋白溶解抑制；③Iris可結(jié)合于細胞/巨噬細胞并抑制TNF的分泌[19]。

微小扇頭蜱絲氨酸蛋白酶抑制分子3(Rhipicephalusmicroplusserine protease inhibitor 3， RMS-3)主要在微小扇頭蜱雌性成蜱的唾液腺中表達。 用蜱抗血清和易感的牛血清進行rRMS-3和預(yù)測的B細胞表位的免疫學識別測試，發(fā)現(xiàn)只有來自蜱抗性牛的血清識別B細胞表位AHYNPPPPIEFT(Seq7)。在酵母中表達重組RMS-3，制備的蜱抗性牛血清在ELISA篩選中表現(xiàn)出較高的識別能力。結(jié)果表明，RMS-3高度特異性地分泌到蜱咬傷部位。用抗AHYNPPPPIEFT綿羊血清的儀器喂養(yǎng)導致微小扇頭蜱的繁殖能力降低81.16%[20]。

2.2 Serpin在炎癥反應(yīng)上的作用

Iris在炎癥反應(yīng)上也起到重要作用，可誘導Th2型反應(yīng)并抑制促炎細胞因子的產(chǎn)生。然而該蛋白質(zhì)的抗炎特性是通過其外部結(jié)構(gòu)域介導，而與其蛋白水解活性無關(guān)。

篦子硬蜱(IRS-2)是第2個鑒定的蜱絲氨酸蛋白酶抑制劑，其特征在于IRS-2在其P1中含有的絲氨酸可通過晶體結(jié)構(gòu)確認[9]。IRS-2顯示對肥大細胞胃促胰酶和組織蛋白酶G的抑制特異性，兩種蛋白酶參與炎癥反應(yīng)，其抗炎功能通過體內(nèi)爪水腫試驗證實，其中IRS-2顯著降低治療動物中的爪腫脹和嗜中性粒細胞募集[9]。此外，IRS-2抑制樹突狀細胞中促炎細胞因子IL-6的產(chǎn)生和輔助T細胞中IL-6依賴性JAK/STAT3信號傳導受損，抑制促炎Th17細胞的成熟。 IRS-2還抑制由組織蛋白酶G誘導的血小板聚集，但對其他誘導劑如膠原或花生四烯酸衍生物沒有明顯抑制功能[9]。

RmS-3、RmS-6和RmS-17在微小扇頭蜱唾液腺中表達，現(xiàn)已有數(shù)據(jù)證實酵母表達的rRmS-3、rRmS-6和rRmS-17是促炎癥和促凝血蛋白酶的抑制劑。rRmS-3對糜蛋白酶和組織蛋白酶G的抑制化學指數(shù)(stoichiometry of inhibition，SI)為1.8和2.0，胰腺彈性蛋白酶SI高于10，rRmS-6抑制胰蛋白酶SI為2.6，糜蛋白酶和纖溶酶SI高于10，而rRmS-17分別抑制胰蛋白酶，組織蛋白酶G，胰凝乳蛋白酶，其SI分別為1.6、2.6、2.7[10]。另外，RRMS-6/RRMS-17與胰蛋白酶，rRmS-3/rRmS-17與組織蛋白酶G和rRmS-3與胰凝乳蛋白酶之間形成不可逆復(fù)合物，這與抑制性絲氨酸蛋白酶抑制劑的典型機制是一致的。胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶在神經(jīng)系統(tǒng)和上皮組織中表達，而胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶是這些部位是最主要的蛋白酶受體(recombinant protease activated receptor 2，PAR2)激活劑，即是皮膚中的炎癥和疼痛神經(jīng)原性的重要因子。因此，蜱喂養(yǎng)期間注射胰蛋白酶樣抑制劑如RmS-6、RmS-17會導致叮咬部分發(fā)生炎癥反應(yīng)。而中性粒細胞作為免疫細胞發(fā)揮重要作用，而rRmS-3和rRmS-17也可以有效地抑制中性粒細胞[10]。

2.3 Serpin在抗凝血上的作用

絲氨酸蛋白酶抑制劑已顯示具有調(diào)節(jié)血液凝固的功能，涉及酚氧化酶系統(tǒng)在昆蟲中激活，而其抑制分子在調(diào)節(jié)血液凝固方面發(fā)揮著巨大功能，除上文提到的IRS-2外，美洲花蜱絲氨酸抑制分子6(Amblyommaamericanumserpin 6， AamS6)、美洲花蜱絲氨酸抑制分子19(Amblyommaamericanumtick saliva serine protease inhibitor 19，AAS19)等也具有重要作用。

AamS6可通過以劑量依賴的方式抑制絲氨酸蛋白酶胰蛋白酶、糜蛋白酶、彈性蛋白酶、胃促胰酶和半胱氨酸蛋白酶木瓜蛋白酶。AamS6還可以抑制血小板聚集和延遲血漿凝血時間，表明這種Serpin分子促進血液供應(yīng)，但是補體激活途徑?jīng)]有受到影響[10]。

AAS19是一種已被證明可以抑制8種凝血因子中5種的抗凝血劑。赤酵母表達的重組rAAS19對胰蛋白酶、纖溶酶、凝血因子的活性(f)Xa和Xia的化學劑量抑制(SI)分別為5.1、9.4、23.8和28。類似于典型的Serpin分子，重組rAAS19分子與胰蛋白酶、fXa和fXIa形成不可逆復(fù)合物。fXIIa被抑制82.5%，凝血酶(fIIa)、fIXa、糜蛋白酶和類胰蛋白酶受到14%～29%抑制。AAS19抑制凝血酶，但不抑制組織蛋白酶G活化的血小板聚集。在抗凝血方面，在再鈣化和凝血酶時間測定中，凝血時間延長達250 s，活化時間延長40 s[3]。AAS19 RNA干擾后將導致蜱的血液攝入量減半，形態(tài)發(fā)生變化[4]。 在用AAS19免疫的兔子中，蜱血液攝取更快，但總吸血量降低，并且導致蜱產(chǎn)卵能力受損[4]。

在血液凝固測定中，rRmS-17在再鈣化時間測定中將血漿凝固延遲60 s，而rRmS-3和rRmS-6沒有任何影響。rRmS-6能抑制因子Xa，因子XIa且SI高于10，而rRmS-17分別抑制纖溶酶和因子XIa，SI為3.4和9.0。在血液凝固測定中，rRmS-17在再鈣化時間測定中將血漿凝固延遲了60 s，而rRmS-3和rRmS-6沒有任何作用。與抑制劑功能分析數(shù)據(jù)一致，2.0 mmol/L rRmS-3和rRmS-17以劑量響應(yīng)方式分別抑制組織蛋白酶G-激活的血小板聚集，分別高達96%和95%[21]。

RmS-15是存在于微小扇頭蜱唾液中的重要的抗止血分子，是成功進食所必需的。用動力學測定和體外分析酵母中表達的RmS-15。進行抑制酶測定顯示RmS-15化學計量抑制(SI)為1.5并且具有高抑制親和力的凝血酶。在再鈣化時間測定中測定的RmS-15以劑量依賴性方式延遲血漿凝血。蜱感染后第28天，ELISA檢測蜱抗性和敏感性牛中觀察到抗體滴度極顯著升高(P<0.001)。該數(shù)據(jù)表明RmS-15與蜱喂養(yǎng)部位的宿主免疫系統(tǒng)直接接觸[20]。本研究有助于了解寄生蟲與宿主相互作用期間微生物蛋白酶的生物學功能，有助于設(shè)計未來創(chuàng)新疫苗的研發(fā)。

IxscS-1E1是在肩突硬蜱唾液腺發(fā)現(xiàn)的一種絲氨酸蛋白酶抑制分子，研究表明酵母表達重組IxscS-1E1(rIxscS-1E1)可以將凝血酶和胰蛋白酶捕獲在SDS熱穩(wěn)定復(fù)合物中，并以劑量依賴方式降低2種蛋白酶的活性[5]。凝血可以通過3條途徑激活,即外部、內(nèi)部途徑及當形成纖維蛋白凝塊時達到共同途徑。體外試驗中血漿凝血酶原時間(prothrombin time,PT)、活化的部分凝血活酶時間(activated partial thromboplastin time，APTT)和凝血酶時間(thrombin time，TT)常規(guī)用于探究蜱唾液蛋白對外源性、內(nèi)源性和共同的血液凝固活化途徑的影響。結(jié)果表明，rIxscS-1E1影響內(nèi)源途徑和共同途徑，但不影響外源途徑[5]。其通過在蜱-宿主界面處抑制凝血酶、胰蛋白酶和其他未知的胰蛋白酶樣蛋白酶的作用來介導其抗凝血和潛在的炎癥功能。

鐮形扇頭蜱絲氨酸蛋白酶抑制分子1、2(RhipicephalushaemaphysaloidesSerpin1、2，RHS-1和rRHS-2)的抗凝血活性測定顯示,在PT測定中，與對照相比，rRHS-1和rRHS-2都不顯示任何抗凝作用。在APTT試驗中，當rRHS-1濃度高于1.6 μmol/L時，凝血時間顯著長于對照組，rRHS-1以劑量依賴的方式延長哺乳動物血漿的凝血時間，對凝血酶活性最大抑制率可達到65.5%[22]。

研究發(fā)現(xiàn)，蛋白Z依賴性蛋白酶抑制劑(protein Z (PZ)-dependent protease inhibitor ，ZPI)是一種血漿絲氨酸蛋白酶抑制劑，可在蛋白質(zhì)Z(PZ)、帶負電荷的磷脂和Ca2+存在下快速滅活因子Xa(fXa)和(FXa)和XIa(FXIa)。而抗凝血酶(antithrombin ，AT)作為具有調(diào)節(jié)血液凝固的另一種絲氨酸蛋白酶抑制劑，對所有凝血蛋白酶均顯示出抑制作用，同時也是凝血因子IXa(FIXa)的唯一生理抑制劑[6]。

2.4 Serpin在病原體傳播上的作用

Mulenga等提出由于內(nèi)肽酶和絲氨酸蛋白酶抑制劑在哺乳動物體內(nèi)平衡維持中起關(guān)鍵作用，所以假設(shè)蜱通過絲氨酸蛋白酶抑制劑來破壞宿主的平衡，促進蜱寄生，勢必會對蜱攜帶病原體的傳播造成一定影響。近來一些有關(guān)Serpin在病原體傳播方面的相關(guān)文獻也做了證實。以伯氏疏螺旋體為例，Serpin對伯氏疏螺旋體感染起到積極作用。伯氏疏螺旋體通過在其表面上結(jié)合蜱C1型絲氨酸蛋白酶抑制劑，在其感染時可以起到抑制炎癥浸潤部位，從而抑制補體活化[7]，起到促進病原體傳播的作用。

IxodespersulcatusSchulze Serpin 1 即Ipis-1，作為Iris同源物在Ixodespersulcatus的唾液腺中被鑒定，它是日本萊姆病病原體的特異性載體。通過制備作為兔IgG Fc融合蛋白(Ipis-1-Ig)在COS-7細胞中表達的重組Ipis-1。細胞增殖測定和ELISA檢測IFN-γ顯示Ipis-1-Ig抑制牛外周血單個核細胞(PBMC)的增殖和IFN-γ產(chǎn)生。值得注意的是，即使CD14+T細胞耗盡，Ipis-1-Ig也顯示抑制了牛PBMC的細胞增殖和IFN-γ產(chǎn)生[8]，這表明Ipis可以直接與T細胞相互作用并抑制其功能?？傊?，Ipis-1可以通過抑制免疫細胞的功能，而建立適合于蜱吸血和病原體傳播的環(huán)境。

2.5 在消化功能上的研究進展

近期，從中國南方優(yōu)勢硬蜱鐮形扇頭蜱中克隆鑒定了2個Serpin分子，命名為RHS-1和RHS-2，結(jié)構(gòu)和酶活研究證明RHS-2為胰凝乳蛋白酶樣(chymotrypsin-like)絲氨酸酶抑制分子，蜱絲氨酸蛋白酶抑制分子(Serpin)是一類抗蛋白酶分子，其在消化上的作用主要表現(xiàn)在相關(guān)蛋白酶的抑制調(diào)控，主要表現(xiàn)在對絲氨酸蛋白酶、半胱天冬酶與一些半胱氨酸蛋白酶等具有消化作用的蛋白酶的抑制上。

絲氨酸蛋白酶是生物中普遍存在的酶，從細菌到哺乳動物，它們在很多已知的生物過程中發(fā)揮著重要作用。除了一些關(guān)鍵的生理作用外，蛋白酶還可進行無限次的水解反應(yīng)以分解蛋白質(zhì)，這種蛋白水解活性可能對生命系統(tǒng)存在潛在的危險。因此，蛋白酶活性必須嚴格和精確控制。調(diào)節(jié)蛋白酶過度活性有幾種不同的機制。最有效和直接的機制是通過蛋白酶抑制劑滅活蛋白酶。絲氨酸蛋白酶抑制劑(SPIs)已被廣泛研究。

許多抑制型Serpin 作用于胰凝乳蛋白酶等絲氨酸蛋白酶類。這類彈性蛋白酶在其催化位點都有1個親核的絲氨酸殘基，還有一些Serpin能抑制其他類型的蛋白酶，由此被稱為跨膜蛋白抑制劑。某些Serpin作用于半胱氨酸蛋白酶位點是親核的半胱氨酸殘基，但化學性質(zhì)是相似的，Serpin也是以相似的方式抑制這2類酶，如植物的Serpin能抑制金屬半胱天冬酶和木瓜蛋白酶等半胱氨酸蛋白酶的活性。

近十幾年以來，參與血液消化的半胱氨酸蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶，在若干種蜱中已經(jīng)完成基因克隆及蛋白純化和酶活測定[1]。寄生蟲中存在的半胱氨酸蛋白酶主要分為兩個大族，即CA族(clan CA)和CD族(clan CD)。在寄生蟲的相關(guān)研究報道，也證實了半胱氨酸蛋白酶參與寄生蟲的重要生理過程，在其生活史中有著不可或缺的重要作用。對于體表吸血的節(jié)肢動物而言，半胱氨酸蛋白酶參與消化、發(fā)育、組織穩(wěn)態(tài)等相關(guān)的各種生理過程。大多數(shù)的肽酶屬于半胱氨酸蛋白酶、木瓜蛋白酶超家族。

半胱氨酸蛋白酶在蜱生活史中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，主要涉及的有組織蛋白酶、天冬酰胺內(nèi)肽酶、半胱天冬氨酸蛋白酶以及自噬蛋白酶等，參與蜱血液消化、胚胎發(fā)育、天然免疫等關(guān)鍵性生理活動，對蜱穩(wěn)態(tài)的維持及生活史的完成起到必不可少的作用。

3 Serpin分子的應(yīng)用和展望

3.1 抗蜱疫苗

對宿主抗蜱蟲感染的免疫作用是目前使用最廣泛的替代蜱控制方法，使用的殺蜱劑具有嚴重的局限性。蜱蟲科研的重點是鑒定，克隆和體外生產(chǎn)重組蜱疫苗候選抗原。目前已驗證了一些由寄生蟲編碼的serpin超家族成員在哺乳動物抗瘧原蟲防御模型中的作用，通過在宿主上應(yīng)用serpin讓抗蜱疫苗開發(fā)成為了可能。絲氨酸蛋白酶抑制劑可明顯影響許多細胞內(nèi)途徑，從而損害宿主免疫細胞的功能。

通過對AAS19的RNAi發(fā)現(xiàn)，試驗組的蜱吸血量為對照組的50%，在孵化期間，100%的蜱在形態(tài)上發(fā)生變化。rAAS19與TiterMax Gold佐劑各500 μg混合后接種具有高度的免疫原性可誘發(fā)的抗體滴度超過1∶320 000，將蜱接種到免疫動物，發(fā)現(xiàn)第一次接種的蜱吸血量明顯減少，而第二次接種蜱到免疫動物發(fā)現(xiàn)60%的蜱不產(chǎn)卵。無疑rAAS19可作為抗蜱疫苗的潛在組成部分。

用rRAS-1和rRAS-2的組合對牛進行疫苗接種顯示出了明顯的蜱保護性免疫，導致若蜱飽血率降低61.4%，成年雌性和雄性蜱的死亡率分別提高28%和43%。這是使用兩種不同serpins組合的抗蜱疫苗試驗的第一份報告。誘導蜱病理學死亡的抗體反應(yīng)效果一直很好，故抗rRAS-1和rRAS-2抗體成為防御感染的防御機制的重要組成部分。推測組合誘導抗蜱疫苗具有充分的可行性。

通過測定RHS-1和RHS-2RNAi蜱24 h上體率、附著時間和充血蜱體重。與螢光素酶注射蜱相比兩者均有明顯的抑制效果。dsRNA組的24 h上體率和充血率分別為RHS-1為42.5%、23.34%、RHS-2為35%、11.67%，對照組為71.67%和35.8%[22]。這表明在RHS-1或RHS-2基因破壞后，蜱的血液供應(yīng)受到顯著影響。

長角血蜱絲氨酸蛋白酶抑制分子2(serpin from ixodid tick haemaphysalis longicornis 2， HLS2)是一種蜱血淋巴特異性表達的絲氨酸蛋白酶抑制劑?；罨牟糠帜富顣r間和凝血酶抑制試驗顯示重組HLS2(rHLS2)表現(xiàn)出延長凝血時間和抑制凝血酶活性。接種具有rHLS2疫苗的兔子針對蜱具有顯著的保護性免疫，導致若蜱和成蜱的死亡率分別為44.6%和43.0%[23]。這些結(jié)果表明，rHLS2可能是作為抗蜱疫苗組分的重要候選者。

在長角血蜱中除發(fā)現(xiàn)HLS2外，在其中腸部位還檢測到另一種絲氨酸蛋白酶抑制劑HLS1。用原核表達重組HLS1(rHLS1)的疫苗接種兔子，導致喂養(yǎng)的若蜱和成蜱的死亡率分別為43.9%和11.2%[23]。然而蜱唾液的多克隆兔抗體與rHLS1無反應(yīng)，表明天然HLS1在蜱喂養(yǎng)期間未分泌到宿主中。rHLS1的發(fā)現(xiàn)也為抗蜱疫苗的研發(fā)提供了可能。

3.2 抗凝血制劑

除上述功能外，Serpin分子還可以干擾細胞外蛋白水解，從而抑制凝血。這些活動發(fā)生在附著部位，導致局部免疫抑制和血凝抑制。值得注意的是，不同的抑制劑可以通過靶向相同途徑、不同途徑或不同的組分而引起相似的表型。相反，對于單個抑制劑通常觀察到多于一種效應(yīng)。單抑制劑多功能，多種抑制劑相同功能可能是蜱與其宿主長期共同進化過程中藥物開發(fā)的策略。

研究表明，rAAS19在治療凝血障礙方面是潛在藥物。肝素廣泛用于治療和預(yù)防血液凝固性疾病，如防止血栓的形成。但其除了由于意外服用過量引起的潛在毒性外，還使患者處于危險，并誘導血小板減少癥，導致免疫系統(tǒng)介導的嚴重并發(fā)癥，威脅生命安全。據(jù)報道發(fā)生血小板減少的重癥患者高達58%?；趓AAS19與肝素相似的作用位點，且研究發(fā)現(xiàn)肝素將與rAAS19形成復(fù)合物[4]，可以使用較少的肝素達到顯著的血漿凝固延遲效果，表明這個分子在抗凝治療上具有很大的潛力。

IRS-2可以抑制組織蛋白酶G和凝血酶誘導的血小板聚集的能力，說明外寄生物蛋白的藥理作用和靶特異性。IRS-2的嚴格特異性和生物活性與其結(jié)構(gòu)的知識結(jié)合可以作為未來藥物應(yīng)用發(fā)展的基礎(chǔ)。

3.3 藥物靶點

毫無疑問，從寄生層面而言，蜱唾液分泌有利于蜱蟲，對宿主有害。從這個角度來說，Serpin是一個開發(fā)抗蜱疫苗和蜱控制策略的重要研究領(lǐng)域。蜱絲氨酸蛋白酶抑制劑有助于宿主中病原體的建立?；谶@個原理活化纖溶酶原激活系統(tǒng)與上調(diào)血清抑制因子PAI-2對勃氏疏螺旋體感染的起到促進作用。感染的促進是由于直接增強伯氏疏螺旋體傳播和從抑制炎癥浸潤到暴露部位。伯氏疏螺旋體顯示其表面上結(jié)合宿主serpin-C1抑制劑，從而抑制補體活化[7]。

Serpin分子的典型作用為血液中蛋白水解級聯(lián)的結(jié)構(gòu)單元，中性粒細胞、肥大細胞、自然殺傷細胞和細胞毒性T細胞均產(chǎn)生絲氨酸蛋白酶，負責細胞外基質(zhì)重塑、微生物殺傷、細胞因子激活和通過蛋白酶激活受體的信號傳導，或白細胞的化學吸引。作為許多過程的監(jiān)管者，Serpin分子通常有助于疾病病癥。其中中性粒細胞蛋白酶，即組織蛋白酶G，彈性蛋白酶和蛋白酶3在中性粒細胞抗微生物活性中起關(guān)鍵作用，并且有助于清除一些病原體[24]。這些蛋白酶的含量發(fā)生變化時，導致多種肺部疾病、血管炎、類風濕性關(guān)節(jié)炎等。肥大細胞中的幾種絲氨酸蛋白酶，包括胃蛋白酶和類胰蛋白酶已被證明參與腹主動脈瘤的發(fā)病機制和動脈粥樣硬化。由于絲氨酸蛋白酶的這些多樣化和臨床相關(guān)的作用，它們作為治療靶點的潛在用途正被科學界深入討論[25]。蜱表達大量具有不同特異性的絲氨酸蛋白酶抑制劑，可用于治療上述蛋白酶表達異常的新藥。

Th17細胞構(gòu)成CD4 T淋巴細胞亞群，在抵御細胞外細菌和真菌方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。Th17細胞過度增殖與許多嚴重的自身免疫性疾病有關(guān)，如人類銀屑病、類風濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥、炎癥性腸病、哮喘，以及一些細菌和真菌感染。Th17亞型參與具有嚴重破壞性細菌的發(fā)育。已證實其與萊姆病患者的關(guān)節(jié)炎發(fā)生也有密切聯(lián)系。IRS-2除在抑制Th17淋巴細胞的成熟上發(fā)揮重要作用，絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族的蛋白質(zhì)還通過抑制IL-6/STAT-3信號傳導途徑參與基本的生物學過程，例如凝血、補體活化、纖維蛋白溶解、血管生成、炎癥和腫瘤抑制。顯而易見，IRS-2被描述為許多藥物應(yīng)用中的前瞻性分子。

除此之外，Serpin分子也在抗腫瘤方面具有重要作用，典型代表為上述提到的Iris。Iris與外周血單個核細胞相互作用的機制表明其可以與單核細胞/巨噬細胞作用，并有抑制其分泌TNF-α的能力，并且發(fā)現(xiàn)重組Iris分子在抗內(nèi)毒素休克中發(fā)揮重要作用[18]。

綜上所述，Serpin分子是在生物體廣泛分布，具有多重生物學功能的一類重要蛋白。蜱源Serpin分子的生物學功能研究相當有限，初步證實它們在免疫、血液凝集、病原體傳播等方面具有重要作用，但其具體作用機制還缺少深入研究。