羊結(jié)腸小袋蟲(chóng)藥敏試驗(yàn)

劉俊偉，周 葉，宋開(kāi)放，楊樹(shù)宇，王文哲，姜金慶

(河南科技學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453003)

結(jié)腸小袋蟲(chóng)病(Balantidiosis)是由結(jié)腸小袋蟲(chóng)(Balantidiumcoli)引起的人畜共患寄生蟲(chóng)病，呈全球性分布，已報(bào)道包括豬、牛、羊、爬行類(lèi)等在內(nèi)的50多種動(dòng)物可感染該病[1-3]，其中，中國(guó)生物醫(yī)學(xué)研究中心檢測(cè)到靈長(zhǎng)類(lèi)食蟹猴感染率達(dá)到22.2%[4]，巴西學(xué)者在圈養(yǎng)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物糞便中檢測(cè)到高達(dá)56.7%的感染率[5]，該病可致痢疾樣腹瀉及腸外感染或者與其他病原體的合并感染，甚至引起腸壞死等癥狀，嚴(yán)重威脅人畜安全[6]。結(jié)腸小袋蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育分為2個(gè)階段，即滋養(yǎng)體期和包囊期[7]，在寄生蟲(chóng)處于滋養(yǎng)體時(shí)期進(jìn)行殺滅可達(dá)到最佳效果。羊結(jié)腸小袋蟲(chóng)病是由纖毛蟲(chóng)綱、毛口目、小袋蟲(chóng)科、小袋蟲(chóng)屬的結(jié)腸小袋蟲(chóng)寄生于羊的大腸內(nèi)所引起的以腹瀉、脫水、消瘦和貧血為特征的人獸共患原蟲(chóng)病。目前，文獻(xiàn)報(bào)道中治療豬結(jié)腸小袋纖毛蟲(chóng)的病例較多，并進(jìn)行了纖毛蟲(chóng)的體外培養(yǎng)試驗(yàn)[8]、豬結(jié)腸袋蟲(chóng)的分子鑒定[9]、藥物毒殺試驗(yàn)[10-11]和理化因素影響試驗(yàn)[12]等，而末見(jiàn)直接報(bào)道羊結(jié)腸小袋蟲(chóng)的病例分析。為了篩選抗羊結(jié)腸小袋蟲(chóng)病的有效藥物，需要對(duì)該寄生蟲(chóng)進(jìn)行體外培養(yǎng)，并探討不同藥物殺滅羊結(jié)腸小袋蟲(chóng)滋養(yǎng)體的效果，為防控羊結(jié)腸小袋蟲(chóng)病奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 羊結(jié)腸小袋蟲(chóng)的來(lái)源 羊結(jié)腸小袋蟲(chóng)采自新鄉(xiāng)市某杜泊綿羊養(yǎng)殖戶，該養(yǎng)殖戶飼養(yǎng)規(guī)模100只，放牧散養(yǎng)，其中30只患嚴(yán)重腹瀉為特征的結(jié)腸小袋蟲(chóng)病。

1.1.2 RPMI1640培養(yǎng)基 PRMI1640培養(yǎng)基用滅菌蒸餾水溶解至1 000 mL，加2.0 g NaHCO3，并調(diào)節(jié)pH為7.0，置4℃保存?zhèn)溆?。使用時(shí)，適量1 640培養(yǎng)基分別加入胎牛血清250 g/L，10 g/L玉米淀粉和10 000 U/mL的青霉素和鏈霉素，制成蟲(chóng)體培養(yǎng)液。

1.1.3 藥物種類(lèi) 丙硫苯咪唑片(50 mg/片)、鹽酸左旋咪唑片(25 mg/片)、甲硝唑片(200 mg/片)、痢特靈片(100 mg/片)和乳酶生片(100 mg/片)，以上藥品各加蒸餾水1 mL，制成混懸液；土霉素片(500 mg/片)、復(fù)方新諾明片(480 mg/片)、血蟲(chóng)凈(250 mg/支)和氨芐青霉素鈉(500 mg/瓶)，以上藥品各加蒸餾水2.5 mL，制成混懸液或溶液，4℃保存?zhèn)溆谩Ｉ鲜鏊幤肪鶃?lái)自正規(guī)制藥廠家，且均在有效期內(nèi)。

1.2 方法

1.2.1 羊結(jié)腸小袋蟲(chóng)的處理 30只患嚴(yán)重腹瀉為特征的結(jié)腸小袋纖毛蟲(chóng)病，糞便直接鏡檢發(fā)現(xiàn)有大量滋養(yǎng)體。將陽(yáng)性糞便接種于RPMI1640培養(yǎng)基，28℃進(jìn)行增殖，達(dá)到繁殖期時(shí)，用培養(yǎng)基將滋養(yǎng)體稀釋至約4×104個(gè)/mL，制成羊結(jié)腸小袋蟲(chóng)滋養(yǎng)體懸液備用。

1.2.2 絕對(duì)致死濃度(LC100)的估算 在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入PRMI1640培養(yǎng)基100 μL/孔至第12孔；移液器吸取200 mg/mL甲硝唑混懸液100 μL于第1孔，吹吸混勻后吸取100 μL至第2孔，依次倍比稀釋至第11孔，從第11孔棄去100 μL，留第12孔作陰性對(duì)照；每孔分別加入羊結(jié)腸小袋蟲(chóng)滋養(yǎng)體懸液100 μL，輕輕震蕩細(xì)胞培養(yǎng)板，使各孔混勻，蓋上蓋板膜，28℃培養(yǎng)箱中作用6 h，置顯微鏡下觀察羊結(jié)腸小袋蟲(chóng)滋養(yǎng)體的存活情況。本組試驗(yàn)3個(gè)重復(fù)。將200 mg/mL甲硝唑混懸液致羊結(jié)腸小袋蟲(chóng)滋養(yǎng)體全部死亡的最大稀釋倍數(shù)(最小濃度)，計(jì)作甲硝唑混懸液的絕對(duì)致死濃度(LC100)。

用50 mg/mL丙硫苯咪唑、25 mg/mL鹽酸左旋咪唑、100 mg/mL痢特靈、100 mg/mL乳酶生、200 mg/mL土霉素、192 mg/mL復(fù)方新諾明、100 mg/mL血蟲(chóng)凈和200 mg/mL氨芐青霉素鈉分別重復(fù)上述試驗(yàn)。根據(jù)LC100數(shù)值選取殺蟲(chóng)效果最好的3種藥物確定下一步試驗(yàn)濃度梯度，并測(cè)算其半數(shù)致死濃度(LC50)。

1.2.3 半數(shù)致死濃度(LC50)試驗(yàn)

1.2.3.1 甲硝唑2 h和12 h殺蟲(chóng)試驗(yàn) 根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，以200 mg/mL甲硝唑混懸液為母液，使用PRMI1640培養(yǎng)基將甲硝唑混懸液稀釋成0、200、300、400、500、600、700 mg/L等7個(gè)濃度梯度。將培養(yǎng)的羊結(jié)腸小袋蟲(chóng)滋養(yǎng)體懸液均勻加入21個(gè)10 mL青霉素瓶?jī)?nèi)，并補(bǔ)充培養(yǎng)基使每瓶的液體體積為3 mL，然后分成7組，每組3個(gè)平行。將不同濃度的甲硝唑混懸液加入相應(yīng)組別的青霉素瓶?jī)?nèi)，每瓶3 mL，甲硝唑最終濃度分別為0、100、150、200、250、300、350 mg/L。將上述青霉素瓶加蓋后置28℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)，2 h后取出，液體充分混勻，移液器吸取10 μL滴于載玻片上，加蓋玻片后顯微鏡檢。12 h毒性試驗(yàn)時(shí)，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，甲硝唑最終濃度確定為0、30、40、50、60、70、80 mg/L，其他步驟同2 h殺蟲(chóng)試驗(yàn)。

1.2.3.2 血蟲(chóng)凈2 h和12 h殺蟲(chóng)試驗(yàn)設(shè)計(jì) 使用PRMI1640培養(yǎng)基將100 mg/mL血蟲(chóng)凈母液稀釋后用于殺蟲(chóng)試驗(yàn)，具體分組和觀察方法同1.2.3.1。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，確定2 h殺蟲(chóng)試驗(yàn)的最終濃度分別為0、300、350、400、450、500、550 mg/L，12 h殺蟲(chóng)試驗(yàn)的最終濃度分別為0、80、90、100、110、120、130 mg/L，其他步驟同甲硝唑殺蟲(chóng)試驗(yàn)。

1.2.3.3 土霉素2 h和12 h殺蟲(chóng)試驗(yàn)設(shè)計(jì) 使用PRMI1640培養(yǎng)基將200 mg/mL土霉素母液稀釋后用于殺蟲(chóng)試驗(yàn)，具體分組和觀察方法同1.2.3.1。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，確定2 h殺蟲(chóng)試驗(yàn)的最終濃度分別為0、300、400、500、600、700、800 mg/L，12 h殺蟲(chóng)試驗(yàn)的最終濃度分別為0、80、100、120、140、160、180 mg/L，其他步驟同甲硝唑殺蟲(chóng)試驗(yàn)。

1.2.4 數(shù)據(jù)計(jì)算

1.2.4.1 滋養(yǎng)體存活性判定 載玻片置顯微鏡100倍暗視野下檢查，計(jì)算30個(gè)視野下樣品的蟲(chóng)體平均密度，蟲(chóng)體運(yùn)動(dòng)減弱、原地緩慢旋轉(zhuǎn)、纖毛小幅度擺動(dòng)者仍作活蟲(chóng)計(jì)數(shù)，蟲(chóng)體不運(yùn)動(dòng)、表膜脫出、萎縮、裂解或結(jié)構(gòu)破碎者，作死蟲(chóng)計(jì)數(shù)。

1.2.4.2 死亡率 以對(duì)照組(消毒劑濃度為0)3個(gè)平行樣品試驗(yàn)結(jié)束時(shí)所獲得的平均活蟲(chóng)數(shù)為x，以該試驗(yàn)系列相應(yīng)濃度組3個(gè)平行樣品試驗(yàn)結(jié)束時(shí)所獲得的平均活蟲(chóng)數(shù)為y，將(x-y)/x的數(shù)值換算成百分?jǐn)?shù)，就是該濃度條件下的羊結(jié)腸小袋蟲(chóng)滋養(yǎng)體的死亡率。

1.2.4.3 半數(shù)致死濃度(LC50)的計(jì)算 采用機(jī)率單位法計(jì)算LC50值，根據(jù)死亡百分率—機(jī)率單位換算表，將不同濃度下死亡百分率換算成死亡機(jī)率單位[10-11]。在Excel圖表中，以橫軸表示濃度對(duì)數(shù)，以縱軸表示死亡機(jī)率單位，作xy散點(diǎn)圖，順著所獲得的散點(diǎn)作一趨勢(shì)線，并自動(dòng)獲得該直線的回歸方程。經(jīng)x2檢驗(yàn)回歸線符合要求后，利用該方程式求出死亡機(jī)率單位5(50%死亡率)時(shí)的藥物濃度對(duì)數(shù)，查反對(duì)數(shù)表就可以獲得LC50值。

2 結(jié)果

2.1 羊結(jié)腸小袋蟲(chóng)滋養(yǎng)體對(duì)藥物的敏感性試驗(yàn)結(jié)果

羊結(jié)腸小袋蟲(chóng)滋養(yǎng)體對(duì)藥物的敏感性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。甲硝唑、血蟲(chóng)凈、土霉素、復(fù)方新諾明、鹽酸左旋咪唑、痢特靈和氨芐青霉素鈉對(duì)羊結(jié)腸小袋蟲(chóng)滋養(yǎng)體的絕對(duì)致死濃度(LC100，6 h)分別為0.195、0.391、0.391、0.75 、0.781、3.125、6.25 mg/mL，丙硫苯咪唑和乳酶生在小于等于12.5 mg/mL和25 mg/mL時(shí)對(duì)羊結(jié)腸小袋蟲(chóng)滋養(yǎng)體無(wú)效。甲硝唑、血蟲(chóng)凈和土霉素可作為治療羊結(jié)腸小袋蟲(chóng)病的首選藥物，用作下一步試驗(yàn)。

2.2 甲硝唑2 h和12 h殺蟲(chóng)試驗(yàn)結(jié)果

圖1和圖2顯示甲硝唑的濃度對(duì)數(shù)與死亡機(jī)率單位呈線性關(guān)系。2 h殺蟲(chóng)試驗(yàn)的回歸方程式為y=2.748x-1.396，R2=0.991，其回歸線符合要求，死亡機(jī)率單位為5時(shí)對(duì)應(yīng)的濃度對(duì)數(shù)值為2.327 5，查反對(duì)數(shù)表得其濃度為212.6 mg/L，即0.213 mg/mL。12 h殺蟲(chóng)試驗(yàn)的的回歸方程式為y=2.147x+1.253，R2=0.995，其回歸線符合要求，死亡機(jī)率單位為5時(shí)對(duì)應(yīng)的濃度對(duì)數(shù)值為1.745，查反對(duì)數(shù)表得其濃度為55.6 mg/L，即0.056 mg/mL。

表1 羊結(jié)腸小袋蟲(chóng)滋養(yǎng)體對(duì)藥物的6 h敏感性試驗(yàn)結(jié)果

注：無(wú)羊結(jié)腸小袋蟲(chóng)滋養(yǎng)體存活的孔標(biāo)記為(-)，有羊結(jié)腸小袋蟲(chóng)滋養(yǎng)體存活的孔標(biāo)記為(+)。

Note：Zero survival of trophozoite of sheepBalantidiumcoliis marked as (-),and the survival of trophozoite of sheepBalantidiumcoliis marked as (+).

圖1 甲硝唑2 h殺蟲(chóng)試驗(yàn)的濃度對(duì)數(shù)與死亡機(jī)率單位曲線

圖2 甲硝唑12 h殺蟲(chóng)試驗(yàn)的濃度對(duì)數(shù)與死亡機(jī)率單位曲線

2.3 血蟲(chóng)凈2 h和12 h殺蟲(chóng)試驗(yàn)結(jié)果

圖3和圖4顯示血蟲(chóng)凈的濃度對(duì)數(shù)與死亡機(jī)率單位呈線性關(guān)系。2 h殺蟲(chóng)試驗(yàn)的的回歸方程式為y=5.815x-10.24，R2=0.993，其回歸線符合要求，死亡機(jī)率單位為5時(shí)對(duì)應(yīng)的濃度對(duì)數(shù)值為2.62，查反對(duì)數(shù)表得其濃度為417.7 mg/L，即0.418 mg/mL。12 h殺蟲(chóng)試驗(yàn)的的回歸方程式為y=3.956x-3.035，R2=0.995，其回歸線符合要求，死亡機(jī)率單位為5時(shí)對(duì)應(yīng)的濃度對(duì)數(shù)值為2.031，查反對(duì)數(shù)表得其濃度為107.4 mg/L，即0.107 mg/mL。

2.4 土霉素2 h和12 h殺蟲(chóng)試驗(yàn)結(jié)果

圖5和圖6顯示土霉素的濃度對(duì)數(shù)與死亡機(jī)率單位呈線性關(guān)系。2 h殺蟲(chóng)試驗(yàn)的的回歸方程式為y=3.380x-4.188，R2=0.993，其回歸線符合要求，死亡機(jī)率單位為5時(shí)對(duì)應(yīng)的濃度對(duì)數(shù)值為2.718 3，查反對(duì)數(shù)表得其濃度為522.8 mg/L，即0.523 mg/mL。12 h殺蟲(chóng)試驗(yàn)的的回歸方程式為y=2.373x+0.159，R2=0.995，其回歸線符合要求，死亡機(jī)率單位為5時(shí)對(duì)應(yīng)的濃度對(duì)數(shù)值為2.174，查反對(duì)數(shù)表得其濃度為149.3 mg/L，即0.149 mg/mL。

圖3 血蟲(chóng)凈2 h殺蟲(chóng)試驗(yàn)的濃度對(duì)數(shù)與死亡機(jī)率單位曲線

圖4 血蟲(chóng)凈12 h殺蟲(chóng)試驗(yàn)的濃度對(duì)數(shù)與死亡機(jī)率單位曲線

圖5 土霉素2 h殺蟲(chóng)試驗(yàn)的濃度對(duì)數(shù)與死亡機(jī)率單位曲線

圖6 土霉素12 h殺蟲(chóng)試驗(yàn)的濃度對(duì)數(shù)與死亡機(jī)率單位曲線

3 討論

3.1 藥物半數(shù)致死濃度測(cè)定方法

本試驗(yàn)參考豬結(jié)腸小袋蟲(chóng)毒性試驗(yàn)方法[13]，建立了針對(duì)羊結(jié)腸小袋蟲(chóng)滋養(yǎng)體的藥物半數(shù)致死濃度(LC50)測(cè)定方法，該方法將藥液放在平底96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上進(jìn)行倍比稀釋?zhuān)缓蠹尤氲攘颗囵B(yǎng)的羊結(jié)腸小袋蟲(chóng)滋養(yǎng)體懸液，顯微鏡下觀察結(jié)果。由于羊結(jié)腸小袋蟲(chóng)體形較小，且蟲(chóng)體死亡后易碎裂，難以確定死亡后的準(zhǔn)確數(shù)據(jù)，因此本試驗(yàn)以對(duì)照組(不添加藥液)蟲(chóng)體數(shù)量為參考，其與各濃度組試驗(yàn)結(jié)束后活蟲(chóng)數(shù)之差，就是該濃度下的蟲(chóng)體死亡數(shù)量，并據(jù)此計(jì)算死亡率。此外，為防止藥物稀釋液影響滋養(yǎng)體存活比率，本試驗(yàn)采用培養(yǎng)基稀釋藥物濃度的辦法，減少其對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的干擾。

3.2 羊結(jié)腸小袋蟲(chóng)病的藥物治療

臨床上對(duì)結(jié)腸小袋蟲(chóng)病的控制主要是通過(guò)腸道給藥，殺死體內(nèi)的滋養(yǎng)體，減輕疫病癥狀和避免包囊的形成，進(jìn)而達(dá)到治愈的目的。因此，在結(jié)腸小袋蟲(chóng)滋養(yǎng)體轉(zhuǎn)化為抵抗力較強(qiáng)的包囊之前，使用藥物將其殺死，可有效避免健康羊群的感染，也可避免對(duì)飼養(yǎng)管理人員造成威脅。絕對(duì)致死濃度(LC100)試驗(yàn)結(jié)果顯示，甲硝唑、血蟲(chóng)凈、土霉素、復(fù)方新諾明和鹽酸左旋咪唑均具有較好的抗羊結(jié)腸小袋蟲(chóng)滋養(yǎng)體活性作用，其中甲硝唑、血蟲(chóng)凈和土霉素致體外培養(yǎng)基內(nèi)蟲(chóng)體全部死亡的最低濃度分別為0.195、0.391、0.391 mg/mL，是本試驗(yàn)中治療該病效果最好的3種藥物。

3.3 藥物殺蟲(chóng)半數(shù)致死濃度效果比較

選擇高效、低毒、價(jià)廉的藥物來(lái)殺死滋養(yǎng)體，是控制羊結(jié)腸小袋蟲(chóng)病的重要方法。就本次藥敏試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，甲硝唑?qū)οx(chóng)體影響最大，其次為血蟲(chóng)凈，第3為土霉素，其他藥物雖有影響，但對(duì)蟲(chóng)體的作用時(shí)間要長(zhǎng)些，效果不顯著。甲硝唑、血蟲(chóng)凈和土霉素的2 h半數(shù)致死濃度(LC50)分別為0.213、0.418、0.523 mg/mL，12 h半數(shù)致死濃度(LC50)分別為0.056、0.107、0.149 mg/mL，即藥物殺蟲(chóng)半數(shù)致死試驗(yàn)中，甲硝唑濃度最低、效果最好。由于甲硝唑是合成類(lèi)抗菌劑，多用于抗厭氧菌的感染及腸道原蟲(chóng)感染[10,14]，為緩解藥物對(duì)機(jī)體的毒副作用，采用甲硝唑小劑量給藥，是控制羊結(jié)腸小袋蟲(chóng)病的首要選擇。但本試驗(yàn)中另一種抗結(jié)腸小袋纖毛蟲(chóng)病的常用藥物痢特靈，殺蟲(chóng)效果較差，推測(cè)原因可能是羊群近期使用過(guò)痢特靈，且劑量和療程不當(dāng)，導(dǎo)致羊結(jié)腸小袋蟲(chóng)滋養(yǎng)體對(duì)其產(chǎn)生了耐藥性。臨床用藥過(guò)程中，還可以根據(jù)半數(shù)致死濃度，合理選擇用藥劑量和用藥間隔周期，以達(dá)到最佳的治療效果。