大腸埃希菌與沙門菌紙基微流控聯(lián)合檢測試紙在沙門菌檢測中的應(yīng)用

鄭曉風(fēng)，鄭曉琴，石 莉，劉英玉，姚 剛，張曉紅

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052)

沙門菌(Salmonella)是一種常見的食源性致病菌[1]，主要通過養(yǎng)殖場及周圍的環(huán)境、肉及肉制品加工、運(yùn)輸及儲存、銷售等環(huán)節(jié)污染畜禽產(chǎn)品，當(dāng)人誤食沙門菌污染的食品，可引起惡心、發(fā)熱、腹痛、腹瀉及菌血癥等癥狀，甚至死亡[2]。據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，我國每年發(fā)生的細(xì)菌性食物中毒事件中，由沙門菌引起的食物中毒約占40%[3]。歐美和日本等國家沙門菌引起的食物中毒占細(xì)菌性食物中毒的第2位[4]。

目前，國內(nèi)外常用的沙門菌檢測技術(shù)包括傳統(tǒng)方法(GB 4789.4-2016)[5]、免疫學(xué)方法[6]及分子生物學(xué)方法[7]，其中，基于傳統(tǒng)沙門菌分離和鑒定方法是國內(nèi)認(rèn)可的金標(biāo)準(zhǔn)[8]，沙門菌陽性菌結(jié)果推測到病原體進(jìn)一步鑒定約需6 d～7 d時間，雖檢測結(jié)果準(zhǔn)確，但無法避免耗時耗力的缺點(diǎn)[9]?；诳乖贵w相結(jié)合產(chǎn)生特異性非放射性免疫反應(yīng)的方法，所需時間3 h～48 h即可完成樣品檢測，具有特異性強(qiáng)、敏感性高等優(yōu)勢[10]，但需要專業(yè)人員和設(shè)備完成多種類抗體的制備[11]。利用堿基配對原理的核酸探針雜交技術(shù)、快速擴(kuò)增目的基因為檢測原理的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)，具有高靈敏度、強(qiáng)特異性、結(jié)果清晰等優(yōu)勢[12]，但易在試驗操作過程中造成污染，從而產(chǎn)生假陰性或假陽性的結(jié)果。

多年來，沙門菌的快檢技術(shù)已成為研究熱點(diǎn)，如夏詩琪等建立一種同時聯(lián)檢5種典型沙門菌膠體金試紙條，成功檢出增菌16 h～20 h的沙門菌，最低檢測限為10 CFU/mL～100 CFU/mL[13]，具有操作過程簡便、結(jié)果判定清晰等優(yōu)勢。但其檢測靈敏度仍有待提高。邴欣等設(shè)計了只需目測法結(jié)合光熱效應(yīng)溫差法，用于沙門菌的快速檢測試紙條，最低檢測限達(dá)到2.4×104CFU/mL和2.4×103CFU/mL。當(dāng)前已有的食品中沙門菌檢測方法通常大于16 h培養(yǎng)物的富集，結(jié)果的報告時間至少需要12 h[14]。研發(fā)一種快速、準(zhǔn)確、便捷、低成本的實用檢測試紙，為畜產(chǎn)品生產(chǎn)和質(zhì)量安全控制一線的初步篩查及抽樣檢測提供一種“輕簡”新技術(shù)，應(yīng)用于生產(chǎn)一線。因此，本試驗擬采用姚剛團(tuán)隊研發(fā)的大腸埃希菌與沙門菌紙基微流控聯(lián)合檢測試紙(E.coli+S.en-μPADs)與市售食品沙門菌快速檢測試紙，用于檢測畜禽產(chǎn)品生產(chǎn)加工環(huán)節(jié)沙門菌污染結(jié)果，從而完成E.coli+S.en-μPADs臨床應(yīng)用效果評價。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 待檢樣品 從新疆庫爾勒市某農(nóng)貿(mào)市場上采集的牛肉、牛胴體拭子、牛肉刀具拭子、牛肉稱臺拭子、羊肉、羊胴體拭子、羊肉刀具拭子、豬胴體拭子、豬肉案板拭子、豬肉刀具拭子、豬肉稱臺拭子、驢胴體拭子、驢肉刀具拭子、雞肉案板拭子、雞肉刀具拭子，共計40份樣品。

1.1.2 菌株 標(biāo)準(zhǔn)腸炎沙門菌CVCC 3762菌株，購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心。

1.1.3 主要試劑與儀器設(shè)備 β萘酚辛酸酯(β-naphthyl caprylate)，Apollo Scientific公司產(chǎn)品；營養(yǎng)肉湯生物試劑、營養(yǎng)瓊脂生物試劑，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品；無水乙醇分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠產(chǎn)品；N，N-二甲基甲酰胺分析純，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；乳糖分析純，天津永晟精細(xì)化工廠產(chǎn)品；綠洲市售食品沙門菌快速檢測試紙，達(dá)元綠洲生化公司產(chǎn)品；E.coli+S.en-μPADs，新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院基礎(chǔ)教研室提供；DHG-9140A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；SW-CJ-2FD博迅凈化工作臺，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠產(chǎn)品；恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司產(chǎn)品；4℃ BCD-219D冰箱，青島海爾股份有限公司產(chǎn)品；PL203電子天平，梅勒特-托利多儀器(上海)有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集 新鮮牛羊肉樣品無菌采自從新疆庫爾勒市某農(nóng)貿(mào)市場上銷售的牛羊肉，迅速放入4℃運(yùn)輸箱保存，4 h內(nèi)返回實驗室進(jìn)行病原檢測。豬肉、驢肉、雞肉胴體表面拭子及加工用具拭子樣品從新疆庫爾勒市某農(nóng)貿(mào)市場上銷售的豬肉、驢肉、雞肉，用蘸有生理鹽水的棉簽無菌采集胴體、案板、刀具、稱臺表面，迅速放入裝有300 mL/L甘油肉湯保存。

1.2.2 樣品處理

1.2.2.1 新鮮牛羊肉樣品處理 將采集的新鮮牛羊肉等按GB4789.4-2016[15]進(jìn)行樣品的前處理。無菌稱取25 g肉樣，放入盛有225 mL生理鹽水的無菌錐形瓶內(nèi)，用手順時針搖勻樣品液時間持續(xù)1 min～2 min，制成1∶10的樣品勻液。根據(jù)試驗需求，依次將樣品制成10倍遞增系列稀釋度的勻液。嚴(yán)格按照無菌操作進(jìn)行，每遞增稀釋樣液1次，需更換1次無菌吸管。密封錐形瓶放入36℃±1℃恒溫箱，培養(yǎng)15 h。

1.2.2.2 豬肉、驢肉、雞肉胴體表面拭子及加工用具拭子樣品處理 將采集的300 mL/L甘油肉湯的胴體表面及加工用具拭子液體倒入225 mL營養(yǎng)肉湯中，用手順時針搖勻樣品液時間持續(xù)1 min～2 min，制成1∶10的樣品勻液。密封錐形瓶放入36℃±1℃恒溫箱，培養(yǎng)15 h。

1.2.3E.coli+S.en-μPADs檢測 根據(jù)E.coli+S.en-μPADs使用步驟：取培養(yǎng)15 h后的樣品處理液1 mL，加入到盛有5 mL營養(yǎng)肉湯的離心管中，置于37 ℃恒溫?fù)u床上，以190 r/min的轉(zhuǎn)速，培養(yǎng)5 h。將富集5 h后的菌液直接滴加在E.coli+S.en-μPADs上，置于37℃溫箱1.5 h，在加有沙門菌底物端滴加顯色劑固藍(lán)b鹽，反應(yīng)完成后，將試紙顯色結(jié)果掃描，用ImageJ 1.4 u讀取E.coli+S.en-μPADs的灰度值。結(jié)果判定結(jié)合試紙顯色判定：若E.coli+S.en-μPADs的灰度值大于空白對照的灰度值，則表示檢出沙門菌；若E.coli+S.en-μPADs的灰度值小于或等于每組空白對照，則表示未檢出沙門菌。

1.2.4 綠洲食品沙門菌快速檢測試紙檢測 參照綠洲食品沙門菌快速檢測試紙片使用說明書，將沙門菌測試片置于無菌操作臺內(nèi)，揭開覆蓋薄膜，用無菌吸管或移液槍吸取1 mL的樣品勻液于無紡布棉墊上。待液體完全被無紡布棉墊吸收后，蓋上覆蓋薄膜，保證測試片邊緣不出現(xiàn)褶皺，蓋上覆蓋薄膜后輕輕按壓測試片邊緣，保證覆蓋薄膜粘帖牢固。每個稀釋度須接種2張測試片，同時做1片空白陰性對照。將加樣后的測試片正置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)15 h～24 h。培養(yǎng)后的測試片上沙門菌顯紫紅色，而其他菌群顯藍(lán)色。

1.2.5 符合率計算 陽性符合率=E.coli+S.en-μPADs檢出陽性樣品與綠洲食品沙門菌快速檢測試紙檢出陽性樣品相符合數(shù)/綠洲食品沙門菌快速檢測試紙檢出陽性樣品總數(shù)×100%

2 結(jié)果

2.1 農(nóng)貿(mào)市場畜禽肉檢測結(jié)果

E.coli+S.en-μPADs與綠洲食品沙門菌快速檢測試紙具體檢測結(jié)果如表1所示。E.coli+S.en-μPADs與綠洲食品沙門菌快速檢測試紙在對農(nóng)貿(mào)市場畜禽肉檢測結(jié)果對比結(jié)果發(fā)現(xiàn)，檢測畜禽肉樣15份，E.coli+S.en-μPADs檢出10份大腸埃希菌和11份沙門菌，綠洲食品沙門菌快速檢測試紙檢出9份沙門菌，E.coli+S.en-μPADs與綠洲食品沙門菌快速檢測試紙二者的沙門菌陽性檢出符合率為100%。

表1 農(nóng)貿(mào)市場畜禽肉檢測結(jié)果

注：“+”表示檢出，“-”表示未檢出。

Note："+" indicates that a strain was detected, "-" indicates that a strain was not detected.

2.2 農(nóng)貿(mào)市場畜禽肉加工用具檢測結(jié)果

E.coli+S.en-μPADs與綠洲食品沙門菌快速檢測試紙具體檢測結(jié)果如表2所示。E.coli+S.en-μPADs與綠洲食品沙門菌快速檢測試紙在對農(nóng)貿(mào)市場畜禽肉加工用具檢測結(jié)果對比結(jié)果發(fā)現(xiàn)，檢測25份農(nóng)貿(mào)市場畜禽肉加工用具，E.coli+S.en-μPADs檢出大腸埃希菌17份，沙門菌21份。綠洲食品沙門菌快速檢測試紙檢出沙門菌15份，二者沙門菌的陽性檢出符合率為93.3%。

3 討論

李小玲等建立的沙門菌內(nèi)標(biāo)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒，劉亞娟等[16]用夾心DNA雜交方法、王文彬等[17]發(fā)明金標(biāo)試紙傳感器等多種快檢食品中沙門菌方法，主要研究方法依靠血清學(xué)試驗方法或者分子生物學(xué)方法結(jié)合傳統(tǒng)方法，需4 d～5 d才能得出完整的檢測報告。除此之外，試驗所需的血清學(xué)試驗和分子生物學(xué)中相關(guān)實驗儀器都集中在大城市中的實驗室內(nèi)，無法實現(xiàn)生產(chǎn)一線病原菌的即時檢測。國內(nèi)外科研工作者所研究的熱門領(lǐng)域轉(zhuǎn)向全自動生物分析檢測系統(tǒng)，問世的有Vitek系統(tǒng)、Biolog系統(tǒng)、Soleris系統(tǒng)、焦磷酸測序技術(shù)等，具有實時性、準(zhǔn)確性、樣品量大等優(yōu)勢，但無法擺脫專業(yè)儀器和技術(shù)人員的依賴。因此，迫切需要“輕簡技術(shù)”來實現(xiàn)快速“篩查”、“抽檢”的需要，從而能實現(xiàn)沙門菌的有效和準(zhǔn)確檢測。

通過比較E.coli+S.en-μPADs與商品化的食品沙門菌快速檢測試紙在畜禽肉生產(chǎn)一線應(yīng)用效果顯示，兩種快檢試紙均可初步檢出食品中沙門菌的存在。從對樣品檢測周期上分析可知，商品化快檢試紙無需經(jīng)歷樣品前增菌培養(yǎng)，需15 h～24 h即可鑒定結(jié)果，E.coli+S.en-μPADs要求15 h初增菌，5 h增菌培養(yǎng)，1.5 h的顯色培養(yǎng)，但樣品的檢測時間只有21.5 h，較商品化快檢試紙縮短2.5 h。目前市售食品沙門菌快速檢測試紙價格為9元/片～45元/片，而E.coli+S.en-μPADs價格約1元/片。在完成樣品檢測時，需在市售食品沙門菌快速檢測試紙滴加液體1 mL，E.coli+S.en-μPADs僅需滴加液體90 μL，且顯色結(jié)果穩(wěn)定。

由于E.coli+S.en-μPADs與市售食品沙門菌快速檢測試紙比較而言，在農(nóng)貿(mào)市場畜禽肉檢測中陽性符合率較高，達(dá)到100%，但在農(nóng)貿(mào)市場畜禽肉加工用具陽性檢測符合率為93.3%，其主要原因可能在于畜禽肉加工用具中含菌量低，E.coli+S.en-μPADs不能檢測出，仍需要對E.coli+S.en-μPADs的靈敏度進(jìn)一步研究改進(jìn)。

表2 農(nóng)貿(mào)市場畜禽肉加工用具檢測結(jié)果

注：“+”表示檢出，“-”表示未檢出。

Note：“+” indicates that a strain was detected,“-” indicates that a strain was not detected.

與市售食品沙門菌快速檢測試紙檢測方法相比，E.coli+S.en-μPADs從增菌培養(yǎng)到報告結(jié)果時間短，節(jié)省樣品液消耗，僅需90 μL待檢樣品液即可呈現(xiàn)肉眼可見的顯色反應(yīng)。但與食品沙門菌快速檢測試紙相比，在檢測靈敏度方面尚需進(jìn)一步改進(jìn)提高。