噬菌體在食品工業(yè)中的應(yīng)用綜述

楊金玉， 郭聃洋， 尤金娜·戴·蓋， 辛　雪， 裘紀瑩， 陳蕾蕾

(山東省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品研究所/山東省農(nóng)產(chǎn)品精深加工技術(shù)重點實驗室/農(nóng)業(yè)部新食品資源加工重點實驗室，山東濟南 250100)

噬菌體是一類普遍存在于自然界的細菌病毒，只要有細菌的地方，就會有相應(yīng)的噬菌體存在。噬菌體是極度宿主專一性的病毒，它們只能侵染特定種的細菌宿主，甚至是專一侵染種內(nèi)特定株系的細菌，在特定的宿主中增殖。但也有極少數(shù)例外，比如Listeria噬菌體A511，這一噬菌體可以侵染并殺死同一屬內(nèi)的細菌[1]?；诖颂攸c，法裔加拿大微生物學Félix d′Hérelle在巴斯德研究所工作期間開始推行將噬菌體療法應(yīng)用于人類疾病的臨床治療[2]，噬菌體療法的原理是利用噬菌體對宿主的專一性直接攻擊和殺害相應(yīng)致病菌[3]。

1　噬菌體療法的曲折發(fā)展

隨著抗生素的出現(xiàn)，噬菌體療法除了在蘇聯(lián)和東歐國家有少量研究外，在許多國家都已終止研究[4-5]。近些年來，抗生素濫用問題凸顯，抗生素耐受的細菌開始進入人們的食物鏈中，由于人們限制抗生素在動物產(chǎn)品中的使用，使得噬菌體在病原性細菌的衛(wèi)生控制中再次進入人們的視野。噬菌體可以用來控制經(jīng)典的“農(nóng)場—餐桌”這一連續(xù)的人類食品供應(yīng)鏈的食品生產(chǎn)所有階段的致病菌[6]。同時，在食品進入市場以前，利用噬菌體對食源性致病菌進行檢測，可以防止大面積的食物中毒事件發(fā)生。此外，噬菌體也可以作為生物防治劑或生物殺毒劑控制加工食品的致病菌，防止病原菌的轉(zhuǎn)移。另外，噬菌體還可以作為生物防腐劑延長加工食品的保質(zhì)期。因此，噬菌體在食品安全和食品加工行業(yè)中發(fā)揮著日益顯著的作用。

2　噬菌體的種類及其對應(yīng)用價值的影響

目前鑒定的噬菌體大多數(shù)屬于有尾噬菌體目(Caudovirales)，由攜帶遺傳物質(zhì)的對稱頭部和長度不一的尾部組成[7](圖1)。噬菌體頭部攜帶的核酸物質(zhì)有些是雙鏈DNA，有些是RNA；而尾部蛋白能夠識別不同易感細菌表面的受體，因此其尾部蛋白決定了它們的宿主特異性。

噬菌體按增殖方式的不同可分為2類，即溫和噬菌體和烈性噬菌體，它們經(jīng)歷完全不同的生命周期：溶源性周期和裂解性周期(圖2)[7]。溫和噬菌體感染宿主后進入溶源性周期，它將遺傳物質(zhì)注入宿主細胞以后，將其整合至宿主基因組中，隨著宿主細胞的分裂而不斷遺傳下去。但當宿主遇到惡劣環(huán)境諸如抗生素壓力、氧脅迫等生存壓力時，噬菌體遺傳物質(zhì)便從宿主基因組上脫落，溶源性周期終止，進入裂解性周期[8]。Erez等的研究表明，溫和噬菌體中存在一種獨特的小分子交流系統(tǒng)，以控制裂解—溶源的轉(zhuǎn)換[9]。

烈性噬菌體感染宿主后進入裂解性周期，其尾部蛋白與細菌宿主表面的受體特異性地結(jié)合并將其自身的遺傳物質(zhì)注入宿主細胞。宿主細胞為烈性噬菌體的增殖提供分子骨架以及核酸復(fù)制、蛋白質(zhì)合成所需的所有酶類。由烈性噬菌體基因編碼的蛋白如溶菌酶、穿孔素等從宿主細胞內(nèi)部溶解細菌。穿孔素是一類小分子蛋白，它們聚積在宿主質(zhì)膜附近發(fā)揮作用，導致細胞膜形成孔洞，使得溶菌酶能夠降解細胞壁上的肽聚糖，以此破壞細胞，將子代噬菌體釋放到環(huán)境中。由此可見，釋放到胞外環(huán)境的子代噬菌體又可以侵染周圍的細菌。因此，烈性噬菌體可以產(chǎn)生大量子代噬菌體的這一優(yōu)勢使得它們適于用來檢測目標病原細菌，并可以被應(yīng)用到噬菌體療法和生防試劑中[10]。而溫和噬菌體的基因在宿主基因組中的插入有時候會導致宿主表型的改變，甚至增加宿主細菌的致病性[11-13]，因此溫和噬菌體不適合用作去除細菌的生物防治試劑。

3　噬菌體在食品檢驗中的應(yīng)用

由于食源性病原菌引起的食物中毒事件呈逐年增多趨勢，食品和食品生產(chǎn)車間病原菌的快速檢測和鑒定方法的建立對于食品工業(yè)和食品檢驗部門都具有至關(guān)重要的作用。然而，快速檢測方法往往缺少所需的靈敏度，因此需要長時間的預(yù)富集步驟，使得這些檢測方法耗費更長的時間和人力、物力。而噬菌體只侵染特異宿主的特性使其成為檢測病原菌的理想工具。在一個相對復(fù)雜的環(huán)境下，噬菌體的整個感染過程從識別特異細菌到裂解細胞釋放子代噬菌體僅僅需要1～2 h，因此，噬菌體檢測技術(shù)使食品快速檢測方法得到了發(fā)展和壯大。

1983年，大腸桿菌(Escherichiacoli)O157 ∶H7首次被報道，當時被認為是一種不常見的血清類型[14]。然而，時至今日，E.coliO157 ∶H7被認為是食品工業(yè)中一個很常見的引起食物中毒的食源性病原菌，食用了被這種大腸桿菌污染的食物會引起出血性腸炎及溶血性尿毒綜合征。到目前為止，已分離出60多種特異性裂解這種病菌的噬菌體。當然，引起食物中毒事件暴發(fā)的其他病原微生物還有沙門氏菌、李斯特菌以及枯草芽孢桿菌等[10]，這些食源性病原菌嚴重威脅著食品的公共安全。噬菌體快速檢測技術(shù)在食品檢測中的應(yīng)用，對于減少食物中毒事件的發(fā)生起著積極的作用。

經(jīng)典的噬菌體介導的鑒定和檢測病原菌的方法稱為噬菌體分型，這種方法依賴于添加特異性噬菌體至待測培養(yǎng)基中觀察病原菌的裂解情況。如果待測樣品對噬菌體敏感，則會裂解不能生長，在固體平板上可以觀察到透明的噬菌斑，在液體培養(yǎng)基中可見菌濃度下降或菌液變清，這種方法簡單易行。液體培養(yǎng)的濁度檢測可使用分光光度計，也可使用自動濁度計來進行高通量檢測[15]。另一種方法是在培養(yǎng)基中添加大分子物質(zhì)，當細菌生長時會分解這些大分子化合物，導致培養(yǎng)液的電導率變化，若添加噬菌體后，細菌生長受到抑制，則電導率不發(fā)生改變，通過檢測電導率的變化即可檢測是否存在某種病原細菌。有研究者在山梨糖醇麥康凱培養(yǎng)基中添加大腸桿菌E.coliO157 ∶H7特異噬菌體AR1，檢測培養(yǎng)24 h后的樣品電導率以判斷是否含有大腸桿菌E.coliO157 ∶H7[16]。

為了增強檢測方法的靈敏度，熒光量子點(quantum dots，簡稱QDs)被用來標記噬菌體。量子點提供了1個非常強且穩(wěn)定的熒光信號，可供流式細胞儀和熒光顯微鏡檢測。在大腸桿菌T7噬菌體的頭部構(gòu)建1個生物素結(jié)合小肽，當噬菌體在宿主內(nèi)增殖時就會被生物素化。鏈霉抗生物素蛋白將量子點包裹于其中，可以與生物素化的噬菌體緊密結(jié)合。即使待測樣品中只有10個大腸桿菌，工程化的T7噬菌體裂解細胞釋放的子代噬菌體亦可被鏈霉抗生物素蛋白識別，形成的T7噬菌體-QD綴合物產(chǎn)生的熒光信號與背景信號明顯不同。利用此方法可以檢出1 mL水樣中的20個大腸桿菌，并可在1 h內(nèi)完成檢測[17-18]。

快速檢出食源性病原微生物E.coliO157 ∶H7的方法對于世界范圍內(nèi)的公共食品安全非常重要。報告噬菌體技術(shù)以其獨特和靈敏度高的特性在快速檢出食源性病原微生物E.coliO157 ∶H7方面已經(jīng)成為一項重要的檢測手段。目標病原菌一旦感染噬菌體，工程噬菌體的報告基因就會得到表達。E.coliO157 ∶H7噬菌體ΦV10經(jīng)過改造后能表達從細角刺蝦(Oplophorusgracilirostris)衍生而來的NanoLuc熒光素酶。E.coliO157 ∶H7一旦被ΦV10感染，加入商業(yè)化的熒光素Nano-Glo?就會產(chǎn)生很強的生物熒光信號。使用在LB培養(yǎng)基中生長的E.coliO157 ∶H7和176 PFU/mL濃度的報告噬菌體富集試驗顯示，可以在7 h內(nèi)檢測到約5 CFU大腸桿菌。以絞細的牛肉作為檢測食物的代表，使用該方法也得到了類似的檢測效果。使用濃度為9 230 PFU/mL的報告噬菌體在選擇富集培養(yǎng)基上對絞細牛肉樣品所含的大腸桿菌進行檢測，在9 h內(nèi)也檢測到了大約5 CFU大腸桿菌。這說明NanoLuc報告噬菌體測定是一種快速、簡單和靈敏的病原微生物E.coliO157 ∶H7 的檢測手段[19]。

4　噬菌體在食品生物防治中的應(yīng)用

由于食用化學防腐劑的潛在危害以及耐藥性細菌新型菌株的不斷出現(xiàn)，亟需采用其他更接近天然的手段來消除食物病原菌。噬菌體以其安全性和天然性再次引起人們的重視。在食品工業(yè)中，以噬菌體來控制食品加工中的食源性病原菌污染的“生物防治”方法具有很大的應(yīng)用潛力[20]。許多公司和組織致力于發(fā)現(xiàn)和分離噬菌體以及商品化噬菌體產(chǎn)品來控制環(huán)境、食品加工過程以及醫(yī)療器械上的病原細菌，以期降低產(chǎn)品損失和控制生產(chǎn)成本[21]。在食品加工過程中，基于噬菌體的產(chǎn)品被用于去污染和去除食源性病原微生物，從而減少由細菌引起的食源性疾病。

在食品工業(yè)中，污染的雞肉、豬肉和牛肉易引起食物中毒及相關(guān)疾病。比如，豬從飼養(yǎng)場到加工廠的運輸過程中的污染會導致最終產(chǎn)品被沙門氏菌等病原菌污染。Wall等研究了這種現(xiàn)象，并利用一種抗沙門氏菌的雞尾酒噬菌體(phage cocktails)來防止這種感染。結(jié)果表明，在幼豬體內(nèi)使用抗沙門氏菌的噬菌體能有效地抵抗沙門氏菌的感染，并降低沙門氏菌的定殖作用，使幼豬扁桃體、回腸以及盲腸的沙門氏菌減少2～3個指數(shù)數(shù)量級[22]。這項在動物體內(nèi)的研究初步顯示了噬菌體療法的可靠性，證實利用雞尾酒噬菌體療法能有效降低病原菌引起的食源性疾病。

研究者利用3種混合的噬菌體(FFH1、FFH2和FFH3)對被大腸桿菌污染的牛肉進行試驗，結(jié)果表明，在室溫下保存24 h，混和噬菌體的處理可以使大腸桿菌的濃度下降 101.97CFU/mL。這說明噬菌體在牛肉類產(chǎn)品的加工中可以有效地降低病原菌的濃度[23]。

噬菌體除了應(yīng)用到肉類加工過程中，在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中也得到了一定的應(yīng)用。目前人們對魚類及貝類的需求量日益增長，而野生捕撈又受到嚴格的控制，因此水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類及貝類產(chǎn)品日益增加。然而，病原菌對人工養(yǎng)殖的海洋及淡水魚類及貝類的侵染給養(yǎng)殖場造成了巨大的財產(chǎn)損失[24]。研究者們對引起鮑貝類感染的哈氏弧菌使用噬菌體試劑進行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從哈氏弧菌分離得到的Siphoviridae噬菌體能顯著提高鮑貝類的存活率，說明噬菌體在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)抗弧菌感染中具有重要的應(yīng)用價值[25]。

除了烈性噬菌體可作為疾病防控的手段，利用溫和噬菌體可將基因整合至宿主基因組中的特性，改造后的溫和噬菌體也可用于食品污染的防治。Moradpour等構(gòu)建了修飾后的M13衍生噬菌體，即攜帶致死代謝基因激活蛋白的噬菌體，并證明了使用該噬菌體可使在污染的牛奶中和LB培養(yǎng)基中的E.coliO157 ∶H7數(shù)量大大降低，這為改造后的噬菌體于食品病原菌的清除中的應(yīng)用提供了一種新的方案[26]。

5　噬菌體在食品工業(yè)應(yīng)用中的優(yōu)勢、存在的問題和相應(yīng)的解決方案

與傳統(tǒng)的抗生素、防腐劑相比，噬菌體在抵抗細菌方面有太多的優(yōu)勢。例如，噬菌體的分離速度快，并且相對簡單、經(jīng)濟。細菌對噬菌體的抗性演化速度比抗生素抗性低90%左右[27]。即使在非常惡劣的環(huán)境中，噬菌體仍然可以高效地發(fā)揮作用直至宿主細菌的數(shù)量大大降低[28]。噬菌體具有自我繁殖的特性，不需要重復(fù)使用或加大劑量，使用噬菌體的劑量比抗生素低得多。并且，噬菌體對于其宿主具有嚴格的專一性，它們的使用不會破壞自然環(huán)境的微生物群落，也不會像抗生素那樣產(chǎn)生副作用[27]。此外，噬菌體對真核細胞無作用，因此將其應(yīng)用于食品中，人們食用這些食物不會引起不良反應(yīng)。噬菌體已經(jīng)從各種各樣的食物中分離得到，像萵苣、生菜、豬肉、牡蠣、生蠔、貽貝、蘑菇、火雞、雞肉、奶酪、酸奶以及牛肉中都可以分離到相應(yīng)的噬菌體。因此，在人們的日常生活中，每天都會攝入噬菌體，噬菌體應(yīng)用到食品中是安全可靠的[29]。

盡管使用噬菌體消除病原菌是非常有利的，但是噬菌體作為主流抗細菌藥物的應(yīng)用也面臨著挑戰(zhàn)和一些不足。例如，噬菌體必須與宿主菌處于相同的場所才能發(fā)揮作用。比如在胞內(nèi)的沙門氏菌就無法用噬菌體來消除，因為噬菌體不能侵入真核生物，而這些胞內(nèi)寄生的病原菌在宿主細胞內(nèi)生長良好、毒力強，噬菌體根本無法接觸到它們，因而無法消滅這些病原菌[3]。

噬菌體應(yīng)用的另一個不足之處是它們可以通過基因水平轉(zhuǎn)移的方式轉(zhuǎn)移遺傳物質(zhì)，很有可能造成宿主菌的毒力增強[30]。尤其是轉(zhuǎn)移一些抗生素抗性基因和毒力因子基因。有研究表明，在一些噬菌體的基因組中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了抗生素抗性基因[31]，另有一些噬菌體裝配時包裹了宿主菌的毒素基因遺傳元件，導致噬菌體本身產(chǎn)生細菌毒素，比如內(nèi)毒素[32]。為了避免這些問題，不能裝配宿主DNA的工程噬菌體才是理想的噬菌體，在食品工業(yè)中的應(yīng)用才更為有利。

噬菌體由于其數(shù)量巨大以及可以快速進化出侵染宿主的超強能力，使得細菌的生存面臨巨大的挑戰(zhàn)，因此在演化過程中，細菌也在不斷地更新自身抵抗噬菌體的能力。比如某些細菌通過表面受體的修飾、超級外排體系的產(chǎn)生、限制性修飾系統(tǒng)的進化以及噬菌體感染的終止等方式來抵御噬菌體的侵染[33]。幾乎一半以上的細菌及大多數(shù)古細菌都擁有被稱為成簇規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列(簡稱CRISPR)的免疫系統(tǒng)以及CRISPR相關(guān)的序列，讓這些細菌具有抵抗外來可轉(zhuǎn)移的遺傳元件的特性，包括噬菌體、質(zhì)粒等[34]。有趣的是，研究者在弧菌特異噬菌體中也發(fā)現(xiàn)了類似的短回文重復(fù)序列[35]，至于噬菌體的短回文重復(fù)序列的來源尚無定論，但可見噬菌體和細菌是共同進化的。因此，分離鑒定新的噬菌體對于更好地利用噬菌體非常必要。

此外，若宿主菌為革蘭氏陰性菌，烈性噬菌體裂解這些病原菌以后，胞內(nèi)的內(nèi)毒素會釋放出來，若禽畜服用了噬菌體，那么這些被釋放出來的內(nèi)毒素將對活體造成影響，引起免疫反應(yīng)甚至死亡。因此，噬菌體被進一步改造，在針對大腸桿菌的T4噬菌體中，溶菌酶的基因被打斷，噬菌體可以利用病毒相關(guān)的肽聚糖水解酶(簡稱VAPH)破壞宿主菌的細胞壁從而侵入宿主，并利用穿孔素小分子蛋白在宿主菌的質(zhì)膜上打孔導致細菌死亡，但不裂解釋放子代噬菌體[36]。

為了避免上述噬菌體在食品工業(yè)應(yīng)用中出現(xiàn)的問題，有學者提出，應(yīng)用噬菌體的蛋白，比如VAPH和穿孔素，而不是應(yīng)用完整的噬菌體，就可以避免遺傳物質(zhì)的水平轉(zhuǎn)移問題、裂解后細菌釋放的內(nèi)毒素問題以及病原菌抗噬菌體等問題[37]?？傊?，隨著研究的進一步深入，噬菌體在食品工業(yè)中將有非常好的應(yīng)用前景[38]。

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