核苷類及5'位磷酸酯修飾藥物的研究進(jìn)展

葛曉斌, 張曉輝

（大連大學(xué) 環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，遼寧 大連 116622）

1 背景介紹

在醫(yī)療健康領(lǐng)域中，癌癥讓每一個人都心驚膽戰(zhàn)，國家癌癥中心發(fā)布的《2017中國癌癥報告》顯示：癌癥是影響中國發(fā)病率和死亡率的主要原因，中國是癌癥大國，癌癥病人占全球癌癥病人總量的將近40%，近幾年，我國癌癥患者的發(fā)病率每年都在增加，2014年，世界新發(fā)病例約1409萬。在2000年到2011年之間，全球約22%的新發(fā)癌癥和27%的癌癥死亡發(fā)生在中國[1]。更加有效的抗癌藥物的研發(fā)刻不容緩。

在生命的發(fā)展過程中，核酸在生物大分子中起決定性的作用。除病毒外所有物種的遺傳物質(zhì)都是DNA，RNA的生物學(xué)功能在于轉(zhuǎn)錄和翻譯遺傳信息。當(dāng)DNA堿基和核苷受到損壞就會產(chǎn)生癌癥，癌癥已成為人類生命的最大威脅[2]。由于核苷類似物獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，并且可以參與、干擾細(xì)菌（病毒）的生物過程的作用，所以很有可能發(fā)展成為抗腫瘤、抗病毒的潛在藥物[3]。

一種抗皰疹病毒藥物—阿昔洛韋(Aciclovir)是由美國藥理學(xué)家Gertrude Belle Elion合成的，也因此于1988年獲諾貝爾生理學(xué)獎和醫(yī)學(xué)獎。引起了眾多化學(xué)家的廣泛關(guān)注，得到了許多經(jīng)修飾的核苷類似藥物[4-6]。例如，司他夫定(D4T)，齊多夫定(AZT)，恩曲他濱(NRTIs)等[7]。因此，核苷類似物已逐漸成為潛在的藥物[8-9]。

2 核苷類藥物的研究進(jìn)展

病毒的變異性以及繁殖能力讓它很難被消滅，免疫學(xué)能夠提供一些病毒的治療方法，但是有些病毒很難找到適合的疫苗，從而限制了此類方法的發(fā)展?？共《净瘜W(xué)療法取得極大進(jìn)展是在1962第一個核苷類藥物碘苷( IDU) 獲得成功之后,這種藥物是用于治療皰疹性角膜炎。到2002年，核苷類藥物有了很大發(fā)展，用于臨床治療的此類藥物達(dá)到19種之多[13]。如臨床使用的抗HIV-1藥物-恩曲他濱，由美國Emory大學(xué)研制，Gilead Science和Royalty Pharma公司于2003年7月聯(lián)合在美國申請上市；Atripla是2006年7月12日經(jīng)FDA快速審批通道批準(zhǔn)上市的一種抗艾滋病的新復(fù)方制劑，患者只需每天服用一次，每次1片。在核苷類化合物進(jìn)行5位取代產(chǎn)生新的核苷類藥物作為抗病毒、抗腫瘤藥物已被廣泛應(yīng)用于臨床[10]，如5-氟脫氧尿苷(FdU)、5-溴脫氧尿苷(BrdU)、5-碘脫氧尿苷(IdU)，可用作為抗病毒、抗腫瘤藥物的增敏劑[11,12]。如圖1。

圖1 幾種核苷類藥物

糖基和堿基是核苷類化合物的兩大組成部分，近年來對糖基和堿基的改造修飾成為一大熱點(diǎn)，主要原因是核苷類化合物與天然核苷在化學(xué)結(jié)構(gòu)上基本相似，進(jìn)入生物體內(nèi)很難被察覺，以達(dá)到代替天然核苷的作用。

2.1 糖基的修飾

通過對糖基的修飾改造可以使得核苷類藥物表現(xiàn)出更好的抗癌、抗病毒效果，同時糖基改造完成后的核苷類藥物的毒副作用大大減少，對核苷類藥物糖基的修飾改造是對抗病毒藥物的有效衍生。

糖基改造可以在D-或L-型呋喃糖基上進(jìn)行脫氧、取代、引入雜原子等，比如在2'、3'位上改造的D-或L-型核糖核苷：一是糖基的2'、3'位羥基被疊氮基、鹵素、氨基、亞甲基、乙炔基、氰基、羥甲基取代，如圖2所示：

二是2'、3'位二脫氧以及在此基礎(chǔ)上形成2'、3'-雙鍵的核苷。另外在呋喃糖基上引入雜原子也是糖基修飾的一種重要方法，糖基5'位氧原子改造成硫原子，但未表現(xiàn)出一定的生物活性。如圖2所示。

圖2 核苷類化合物糖基的修飾

另外一類糖基的改造體現(xiàn)在將呋喃糖基變成吡喃糖、四元氧雜糖，如圖3所示，以及碳環(huán)型、開環(huán)成為無環(huán)型，

圖3 核苷類化合物糖環(huán)改變

糖基的改造修飾為核苷類藥物的衍生、發(fā)展開拓了新的途徑，為抗癌、抗病毒藥物的篩選提供了新的方法，其中不乏有一些生物活性很好的核藥物，糖基的改造遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒有完成，需要進(jìn)行更加深入的探索。

2.2 堿基的修飾

堿基在核苷的組成中處于決定性作用，堿基的修飾改造也直接影響著核苷類藥物的抗癌、抗病毒活性。因此研發(fā)新的核苷抗藥物的道路上，堿基的修飾很有意義。

堿基的主要修飾部位體現(xiàn)在嘧啶環(huán)或嘌呤環(huán)的碳原子被取代，這種情況主要在尿嘧啶環(huán)的5位，如抗HSV的IDU，BVDU等[14]；還可以在胞嘧啶環(huán)的5位，及胸腺嘧啶環(huán)的6位；嘌呤環(huán)的2位和8位上進(jìn)行。另外堿基羰基氧原子的雜原子取代也是一條重要的修飾改造途徑，在咪唑核苷當(dāng)中最重要的化合物是bredinin以及5位取代的衍生物，如圖4所示。

圖4 核苷類化合物堿基的修飾

總之，核苷類藥物的高效、低毒研究已成為現(xiàn)階段抗病毒的主要途徑。

3 核苷類藥物磷酸酯化的研究概況

近年來，通過化學(xué)的方法對核苷化合物預(yù)先磷酸化大大拓寬了核苷結(jié)構(gòu)修飾的范圍，并為對付病毒耐藥性提供了新途徑。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，核苷類化合物及其類似物作為一種藥物來治療癌癥、以及某些病毒疾病如艾滋病等，藥物進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮作用的往往是其5'磷酸化產(chǎn)物，如5-氟尿苷進(jìn)入細(xì)胞中發(fā)揮活性的是其5'單磷酸化產(chǎn)物。以及目前的抗艾滋病病毒（HIV）藥物如：疊氮胸苷，雙脫氧肌苷和雙脫氧胞苷等自身無法抑制HIV病毒的復(fù)制，發(fā)揮作用的同樣是進(jìn)入細(xì)胞后代謝成的5'磷酸酯[15]，這些核苷類似物均可以稱為我們所說的前體藥物[16]，從大量的探究可以發(fā)現(xiàn)，核苷類似物發(fā)揮其內(nèi)部活性必須要經(jīng)過細(xì)胞酶代謝為磷酸酯產(chǎn)物。并且我們知道DNA、RNA在人體內(nèi)的作用機(jī)制，核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑是核苷或核苷酸結(jié)構(gòu)衍生物，逆轉(zhuǎn)錄酶的存在使得HIV病毒無法復(fù)制，限制了HIV DNA的合成。另外，如果核苷類似物的糖基3'位缺乏羥基，在DNA復(fù)制時將不能再進(jìn)行與5'-3'磷酸二酯鍵的結(jié)合，這樣就阻止了病毒DNA鏈的延長，使其無法復(fù)制[17-19]。

3.1 減少給藥時間

經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，核苷類化合物作為藥物到達(dá)病變部位的過程中要經(jīng)過被細(xì)胞多種激酶的作用，進(jìn)行三步磷酸化的階段，最終轉(zhuǎn)化成核苷類5'三磷酸酯，從而對腫瘤細(xì)胞DNA產(chǎn)生作用，破環(huán)其DNA，抑制癌細(xì)胞的復(fù)制，從而發(fā)揮其生物活性。在這個過程中單磷酸化即第一步磷酸化為整個過程的決速步驟[20]，轉(zhuǎn)化的時間也大大超過后兩步，并且在有些細(xì)胞中核苷激酶的活性很低[21-25]，核苷類藥物的單磷酸酯化更只有少部分進(jìn)行，直接影響了藥效，因此，對核苷類化合物通過化學(xué)方法預(yù)先單磷酸化修飾，不用在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行藥物的單磷酸化過程，可以極大提高藥物到達(dá)病變部位的時間，提高活性，也是當(dāng)前一個研究熱點(diǎn)[26]。如抗HBV新藥:替諾福韋酯(TDF)如圖5，是一種單磷酸腺苷的無環(huán)磷酸化的核苷酸類似物，進(jìn)入細(xì)胞中被細(xì)胞激酶磷酸化為二磷酯，與5'三磷酸脫氧腺苷競爭發(fā)揮作用。

圖5 替諾福韋酯

3.2 改善核苷酸藥代動力學(xué)

核苷酸在體內(nèi)的分解以及排泄很快，進(jìn)行磷酸酯的修飾后可以改善核苷酸的藥代動力學(xué)，并且在給藥過程中，口服相對注射為更加對病人有利的給藥方式。日本研制出的治療白血病的藥物磷酸酯化阿糖胞苷，如圖6。該化合物在肝臟緩慢釋放阿糖胞苷(Ara-C)，口服300 mg/d，連續(xù)5 d給藥，血中Ara-C濃度相當(dāng)于以15～20 mg/d劑量連續(xù)注射Ara-C[27]?；衔?和2等的類似物的初步抗腫瘤活性研究也已經(jīng)報道[28]。核苷類化合物的磷酸酯修飾對癌癥的治療進(jìn)展有了很大的促進(jìn)。

圖6 磷酸酯化的核苷類藥物

3.3 改善核苷酸藥對細(xì)胞膜的穿透性

藥物到達(dá)給藥位置的過程，細(xì)胞膜的阻礙作用非常明顯，核苷類化合物自身難以透過細(xì)胞膜，使得藥物不能及時到達(dá)指定位置，通過化學(xué)方法的修飾把核苷類藥物制成其5'磷酸酯可很大程度上改善細(xì)胞膜對藥物的透過作用?；加蠵388白血病的鼠，腹腔注射化合物3（如圖7）有效，但注射化合物3的母體效果不明顯，這表明化合物3比母體對細(xì)胞膜有更好的穿透性[29]。

圖7 化合物3

經(jīng)磷酸酯修飾的核苷類化合物在沒有進(jìn)入細(xì)胞時分解慢，甚至不分解，這樣使得藥物在給藥過程中極大的減少了其損失，更大程度的作用于病變部位，間接提高抗病毒、腫瘤活性。

選擇對核苷類化合物進(jìn)行磷酸酯化的一個很重要原因是人體核酸的組成部分含有大量的磷酸基團(tuán)，是一種對人體無害的物質(zhì)。同時核苷類化合物的磷酸化合成方法有很多種，原料易得，可以滿足實(shí)驗(yàn)室和工業(yè)化的不同要求。

4 4-硫代核苷及其衍生物的研究進(jìn)展

4.1 4-硫代核苷及其衍生物作為藥物在癌癥治療上的應(yīng)用

目前，癌癥的主要治療方法有外科治療、放射治療、化學(xué)治療、分子靶向治療和免疫治療等[30]。一般來說，初期病人只接受手術(shù)治療，而晚期病人需要多種治療方法相結(jié)合。腫瘤具有復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)，特別是存在微轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象[31]，使得治療難度不斷加大。同時癌癥患者的預(yù)后仍然不達(dá)不到預(yù)期效果，病人還要遭受治療的副作用和經(jīng)濟(jì)壓力。因此，人們需要一些繼續(xù)研發(fā)更高效的抗癌藥物以及需要一些精確、高效、副作用小、經(jīng)濟(jì)性好的新療法作為補(bǔ)充，協(xié)助癌癥的傳統(tǒng)治療，以獲得最大的治療效益。

光動力學(xué)療法是一種新興的癌癥治療方法，其原理是，將光敏劑注入患者病變部位，然后用特定波段激光照射患病區(qū)域使光敏劑受到激發(fā)。光敏劑被激發(fā)之后把能量轉(zhuǎn)移到周圍的氧中，產(chǎn)生高活性的單態(tài)氧，其和周圍的生物大分子發(fā)生反應(yīng)，使其氧化，從而能對破壞細(xì)胞，產(chǎn)生毒性作用，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞受損乃至死亡[32]。相對于傳統(tǒng)的化療、放療治療方式，由于其超高的選擇性，不會對正常細(xì)胞造成傷害，在治療的過程中，減輕了患者的痛苦。

當(dāng)前研制出的光敏藥物已發(fā)展到第三代，即第一代的血卟啉衍生物，第二代的5-氨基酮戊酸，第三代的天門冬?；溥卜雍吞囝?。有些尚處在動物研究階段[33,34]。但現(xiàn)有的光敏藥物存在很多缺點(diǎn)，例如會產(chǎn)生光毒反應(yīng)、影響生理代謝等[35]。因此尋找新的光敏藥物變得尤為重要。

研制光敏藥物非常有效的方式之一是在核苷類化合物中對堿基進(jìn)行修飾[36]。自從Lipsett[37]從大腸桿菌分離出4-硫尿嘧啶核苷酸之后，含硫堿基和硫代核苷吸引人們的關(guān)注。與正常DNA相比，在親脂性方面，硫代嘧啶堿基正常的嘧啶核苷具有一定的提高，且嘧啶環(huán)上含有巰基，常常具有強(qiáng)的抗癌活性[38-39]。例如可治療兒童白血病的6-硫唑嘌呤和可治療炎性病癥的6-硫鳥嘌呤[37,40]。但是這些藥物具有明顯的副作用，常常會提高皮膚病的患病率[41-45]。通過研究還發(fā)現(xiàn)，6-硫鳥嘌呤會起到延遲細(xì)胞中毒的作用[46-47]。但其副作用極強(qiáng)，會把癌細(xì)胞和正常細(xì)胞一并殺死，使患者及其痛苦。

我們課題組聯(lián)合英國的徐耀忠教授課題組，合成了一系列新型4-硫核苷類藥物，如下圖所示

圖8 新型4-硫核苷類似物

4.2 近紫外光輔助硫胸苷（UVA/4-thiothymidine）優(yōu)點(diǎn)

新興起的近紫外光輔助輔助硫代胸苷療法具有傳統(tǒng)抗癌療法不具備的其他優(yōu)點(diǎn)：

（1）毒性低：4-硫胸苷是對近紫外光較為敏感的化學(xué)物質(zhì)，而其不曝露近紫外光時，對細(xì)胞是無毒害作用的，在原位動物模型實(shí)驗(yàn)中，通過膀胱給藥或靜脈注射給藥，4-硫胸苷沒有明顯進(jìn)入皮膚和眼睛組織的DNA，然而這兩個組織最容易受到光敏感作用[48-49]。這說明此法較安全，而化療中使用的其它抗癌藥物幾乎都具有很高的細(xì)胞毒性。

（2）能量低：與放療中所需要用的X-射線（約1 nm）和γ-射線（0.01 nm）相比，近紫外光（310～360 nm）的波長更長，因此在應(yīng)用時與X-射線和γ-射線相比，近紫外光（UVA）的能量是遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于它們的。與細(xì)胞中大部分物質(zhì)的吸收波長相比，近紫外光的波長是遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于它們的，例如DNA堿基是在260～270 nm有吸收峰，氨基酸殘基是在低于220 nm波長處有吸收峰；此外，近紫外光的能量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于這些生物成份所需要的激發(fā)能量，故低能量的近紫外光是對人體細(xì)胞無毒害作用的。

（3）高選擇性：由于癌細(xì)胞較正常細(xì)胞的TK含量多，4-硫胸苷能夠代替正常胸苷整合到DNA中，在UVA的照射下，藥物能夠損傷DNA，從而誘導(dǎo)細(xì)胞的死亡。正是由于胸苷激酶在正常細(xì)胞與癌細(xì)胞中作用強(qiáng)度不同，造成了4-硫胸苷在腫瘤細(xì)胞中的取代程度是正常細(xì)胞的3～10倍，故該藥對正常細(xì)胞是幾乎沒有影響的。此外，在對正常細(xì)胞無毒害作用的低劑量，即4-硫胸苷（10 um/L）和近紫外光（5 kJ/m2），對癌細(xì)胞生長有了顯著的抑制作用[48,49]，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明4-硫胸苷協(xié)同近紫外光可治療皮膚癌和（老鼠）膀胱癌。

近UVA/S4TdR療法作為新興的癌癥治療方法，它具有靶向殺死癌細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)，4-硫核苷藥物就是靶向抗癌藥物。

4.3 4-硫核苷類化合物的磷酸酯化

以4-硫胸苷為基礎(chǔ)，進(jìn)行新的結(jié)構(gòu)修飾和取代，使硫代化合物的吸收波長向可見光區(qū)發(fā)展，在臨床上配合光導(dǎo)纖維的發(fā)展，意味著今后也可應(yīng)用在深源性的腫瘤治療上。而核苷類化合物糖環(huán)上磷酸酯化有很好的前景，磷酸酯化后的抗腫瘤，抗病毒前藥最重要的作用就是提高藥物的靶向作用，使得藥物順利進(jìn)入病變部位，減少了對正常細(xì)胞、組織的毒害。除此之外，磷酸酯前藥還可以使藥物更加易溶，優(yōu)化藥物的治療給藥途徑，對藥物穩(wěn)定性也可以產(chǎn)生一定的作用[50]。并且4-硫胸苷衍生出的新的硫代核苷酸，作為一種近紫外光敏劑，其自身不會對細(xì)胞產(chǎn)生任何毒性，能夠靶向性的選擇癌細(xì)胞，以核苷酸的形式嵌入到細(xì)胞DNA鏈中，卻能在近紫外（UVA）光的輔助下，表現(xiàn)對癌細(xì)胞的高致死作用，這可能成為一類在近紫外光輔助下的一種潛在的介于細(xì)胞毒類藥物和分子靶向類藥物的新型抗癌藥物靶向抗腫瘤藥物的應(yīng)用前景非常廣泛，對新的抗腫瘤藥物的研究也有重要意義。

5 展望

核苷類化合物的修飾如4-硫胸苷、4-硫-5-溴-脫氧尿苷、4-硫-5-碘-脫氧尿苷、4-硫-5-（2-噻吩）尿苷等，這些硫代核苷類似物與UVA相輔助，在治療癌癥方面已經(jīng)取得了一些成果，能特異性的殺死癌細(xì)胞，而核苷化合物的磷酸酯化修飾又能突破細(xì)胞膜的阻礙更加快速的到達(dá)預(yù)定給藥位置，因此可以預(yù)見4-硫代核苷類化合物的磷酸酯化修飾能更好的體現(xiàn)核苷類藥物的活性，是一個非常有前景的研究方向。