天麻素在甲基苯丙胺誘導(dǎo)SH-SY5Y細胞自噬中的作用及機制研究

楊根夢，李　娟，洪仕君，薛鳳麟，何永旺，周一卿，曾曉鋒，李利華

(1. 昆明醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，云南 昆明　650500；2. 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點實驗室，云南 昆明　650118)

甲基苯丙胺(methamphetamine，METH)是一種依賴性極高的新型合成毒品，具有精神依賴性強、復(fù)吸率高、神經(jīng)毒性大等特點,長期濫用具有很強的神經(jīng)毒性和藥物依賴性。METH的神經(jīng)毒性主要與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的多巴胺能信號通路相關(guān)，影響多巴胺的釋放而導(dǎo)致神經(jīng)退行性損傷[1]。SH-SY5Y細胞即人神經(jīng)母細胞瘤細胞，是一種與人類多巴胺能神經(jīng)細胞具有相似生化特征的細胞株，被廣泛用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)毒性的研究[2]。目前METH濫用趨勢嚴重，已成為當(dāng)今全球最嚴重的公共衛(wèi)生問題之一。研究表明，自噬參與了METH神經(jīng)毒性的發(fā)生、發(fā)展，但自噬在METH神經(jīng)毒性及其依賴機制中的作用目前尚未完全闡明。

隨著METH依賴機制和戒斷干預(yù)研究的不斷深入，尋找戒毒藥物逐漸受到重視。天麻素(gastrodin)是天然中藥天麻的主要化學(xué)成分，是天麻活性成分中含量最高的有效單體成分，其具有鎮(zhèn)靜催眠、抗癲癇、鎮(zhèn)痛、抗氧化、抗炎、增強機體免疫力等作用。此外，研究表明，天麻素具有抗自由基和保護細胞膜、抗氧化、凋亡、抑制能量代謝、減少細胞脂肪蓄積以及對多種因素導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷具有保護作用等[3-6]。因此，本研究擬證實METH可誘導(dǎo)SY5Y細胞自噬，并用天麻素進行干預(yù)，觀察天麻素在METH誘導(dǎo)SY5Y 細胞自噬中的作用，并初步探討其作用機制。

1　材料

1.1細胞SH-SY5Y細胞株購自國家實驗細胞資源共享平臺。

1.2試劑METH試劑購自中國藥品生物制品檢定所；天麻素購自成都思曼特生物科技有限公司；DEME:F12培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco公司)；LC3、Beclin-1、mTOR、p-mTOR、Akt、p-Akt抗體(Abcam公司)；β-actin抗體(Sigma公司)；山羊抗兔和抗鼠二抗(CST公司)；BCA蛋白定量試劑盒、Western blot相關(guān)試劑(碧云天生物技術(shù)研究所)。

1.3儀器超凈工作臺(蘇州凈化公司產(chǎn)品)；CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher公司);倒置顯微鏡(Nikon)；CT15RE臺式微量高速離心機(Hitachi公司)；Synergy HT酶標(biāo)儀(美國Bio-Tek公司)；164-5050型Western電泳儀、GelDoc2000型凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)；激光共聚焦顯微鏡(德國徠卡)。

2　方法

2.1試劑配制取20 mg METH(分子質(zhì)量185.7)，加2 mL PBS溶解，過濾除菌，配制成濃度為53.85 mmol·L-1，4℃冰箱保存。取20 mg天麻素(分子質(zhì)量為286.28)，溶于2 mL PBS中，配制成濃度為83.02 mmol·L-1，4℃冰箱保存。

2.2細胞培養(yǎng)SH-SY5Y細胞用含15%胎牛血清、1%雙抗的DMEM ∶F12 培養(yǎng)基在37℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每36 h換液1次，待細胞長滿培養(yǎng)板后，通過胰酶消化液消化并進行傳代培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)細胞達到一定數(shù)量，且呈現(xiàn)對數(shù)生長時待用。根據(jù)實驗方案設(shè)計加入不同濃度的METH和天麻素。

2.3細胞藥物處理及干預(yù)貼壁細胞經(jīng)胰酶消化制備成單細胞懸液，以4×105～5×105/孔的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)36 h后，用METH(0、0.5、1、1.5、2、2.5、3 mmol·L-1)處理細胞。通過檢測自噬相關(guān)蛋白并結(jié)合細胞形態(tài)學(xué)改變，本研究選擇METH誘導(dǎo)自噬的濃度是2.0 mmol·L-1，提前1 h給予1 mmol·L-1天麻素干預(yù)，隨后在顯微鏡下觀察細胞形態(tài)學(xué)變化，并檢測給藥前后LC3、Beclin-1、mTOR、p-mTOR、Akt和p-Akt的變化情況。

2.4免疫熒光染色、激光共聚焦顯微鏡分析對數(shù)生長的細胞經(jīng)胰酶消化后，接種于鋪有小玻片的24孔板內(nèi)，當(dāng)細胞密度達70%～80%時加藥，24 h后棄掉每孔內(nèi)的培養(yǎng)液，用PBS小心漂洗細胞2次，每孔加入1 mL 4%多聚甲醛溶液固定20 min，漂洗細胞5 min×3次；0.5% Triton-X100穿孔30 min,漂洗細胞5min×3次；5%山羊血清封閉液封閉30 min，漂洗細胞5 min×3次；加入一抗(1 ∶200),4 ℃過夜。漂洗細胞5 min×3次，加入1% BSA稀釋的二抗(1 ∶200)，于37℃雜交1 h，漂洗細胞5 min×3次，5 mg·L-1DAPI染色2 min，漂洗細胞5 min×3次，在載玻片上滴1滴抗淬滅劑，隨后將小玻片倒扣在載玻片上，用激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果。

2.5Westernblot分析棄掉每孔內(nèi)的培養(yǎng)液，用PBS漂洗細胞2次，6孔細胞培養(yǎng)板中每孔加入100 μL裂解液，于冰上裂解10～20 min后，用細胞刮收集蛋白并移至離心管，于4℃、14 000 r·min-1離心10 min，取上清分裝，用BCA法測定蛋白濃度。取適量蛋白混合5×蛋白上樣緩沖液，在沸水浴中煮10 min進行蛋白變性。SDS-PAGE電泳，半干電轉(zhuǎn)移法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜。用5%的脫脂奶粉封閉1 h，滴加一抗(1 ∶1 000)，4℃過夜，TBST洗膜10 min×4次，滴加二抗(1 ∶5 000)室溫孵育1 h，TBST洗膜10 min×4次，用ECL顯色液激發(fā)化學(xué)發(fā)光，曝光，β-actin作為內(nèi)參。應(yīng)用Image J軟件對Western blot條帶進行灰度值比較。

3　結(jié)果

3.1METH處理24h后細胞形態(tài)學(xué)變化如Fig 1所示，隨著METH濃度的增加，SY5Y細胞胞體逐漸萎縮變圓，突起逐漸變短、消失，同時部分細胞質(zhì)內(nèi)可見大小不等的散在性空泡結(jié)構(gòu)形成。當(dāng)METH濃度達3 mmol·L-1時，可見SY5Y細胞失去原形，不貼壁，呈漂浮狀態(tài)。天麻素干預(yù)后，細胞折光性增強，胞質(zhì)內(nèi)空泡結(jié)構(gòu)減少，部分細胞形態(tài)發(fā)生變化。

3.2METH對SY5Y細胞自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ、Beclin-1表達的影響如Fig 2所示，與對照組相比，SY5Y細胞LC3-Ⅱ表達水平隨著METH濃度的增加逐漸增強，Beclin-1表達水平升高(P<0.05，P<0.01)。提示METH可誘導(dǎo)SY5Y細胞自噬。

3.3不同時間點METH對SY5Y細胞LC3-Ⅱ、Beclin-1表達的影響如Fig 3所示，在不同時間點(6～48 h)給予2 mmol·L-1METH處理SY5Y細胞，24 h后LC3II和Beclin-1水平升高最明顯。

3.4天麻素干預(yù)前后LC3-Ⅱ、Beclin-1的表達情況Fig 4結(jié)果顯示，天麻素+METH組LC3-Ⅱ的表達水平比METH組有所降低。與對照組相比，METH組LC3-Ⅱ和Beclin1表達水平明顯增強(P<0.01)；與METH組相比，給予天麻素干預(yù)后， LC3-Ⅱ和Beclin1表達水平降低(P<0.05,P<0.01)，說明天麻素對METH誘導(dǎo)的SY5Y細胞自噬有抑制作用。

3.5天麻素干預(yù)前后SY5Y細胞Akt、p-Akt、mTOR和p-mTOR表達情況如Fig 5、6所示，METH處理SY5Y細胞24 h后，與對照組相比，mTOR和Akt表達差異無顯著性，p-mTOR、p-Akt表達水平明顯降低(P<0.01)，說明METH誘導(dǎo)SY5Y細胞自噬與其減弱p-mTOR和p-Akt的表達水平有關(guān)。與METH組相比，天麻素干預(yù)后，mTOR、p-mTOR、Akt、p-Akt表達水平升高(P<0.05,P<0.01)。說明天麻素通過增強Akt、p-Akt、mTOR和p-mTOR的表達水平，發(fā)揮抑制METH誘導(dǎo)SY5Y細胞自噬的作用。

Fig 1　Morphological changes of SY5Y cells by METH and gastrodin treatment for 24 h

A: Control; B: 0.5 mmol·L-1METH; C: 1.0 mmol·L-1METH; D: 1.5 mmol·L-1METH; E: 2.0 mmol·L-1METH; F: 2.5 mmol·L-1METH; G: 3.0 mmol·L-1METH; H: 1 mmol·L-1Gastrodin; I: 1 mmol·L-1Gastrodin+2.0 mmol·L-1METH

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

Fig 3　Effect of METH on expression of LC3-Ⅱ and Beclin-1 in SY5Y cells at different time points detected by Western blot

The levels of LC3-Ⅱ and Beclin-1 increased time-dependently with a significant rise at 24h.This time point was used in all subsequent experiments.*P<0.05,**P<0.01vs6 h.

Fig 4　Effect of gastrodin and METH co-treatment on expression of LC3-Ⅱ and Beclin-1 in SY5Y cells detected by Western blot(A) and confocal microscope(B)**P<0.01 vs control; ##P<0.01 vs METH group

Fig 5　Effect of gastrodin and METH co-treatment on expression of Akt(A) and p-Akt(B) in SY5Y cells detected by Western blot

4　討論

Fig 6　Effect of gastrodin and METH co-treatment on expression of mTOR and p-mTOR in SY5Y cells detected by Western blot

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsMETH group

自噬對細胞內(nèi)異常蛋白質(zhì)的降解和細胞器的更新具有十分重要作用，能夠提高細胞對周圍環(huán)境的適應(yīng)性，對于抗腫瘤治療以及維持營養(yǎng)缺乏狀態(tài)下細胞的代謝功能不可或缺[7]。但是過度自噬卻是細胞程序性死亡的一種方式[8]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，自噬是把雙刃劍，自噬功能的紊亂使神經(jīng)元對興奮性毒性更加敏感[9]。近年來研究表明，自噬參與了METH神經(jīng)毒性作用，METH與自噬的研究雖然已取得一定的進展，但METH濫用與自噬之間確切的作用機制和信號通路仍不清楚。

本研究發(fā)現(xiàn)，隨著METH濃度的增加，SY5Y細胞胞體逐漸萎縮變圓，突起逐漸變短、消失，同時部分細胞質(zhì)內(nèi)可見大小不等的散在性空泡形成。當(dāng)METH濃度達3 mmol·L-1時，細胞失去原形，不貼壁呈漂浮狀態(tài)。說明METH對SY5Y細胞具有一定的毒性作用，同時可誘導(dǎo)細胞質(zhì)內(nèi)大量類似自噬泡結(jié)構(gòu)的形成。2 mmol·L-1METH處理SY5Y細胞24 h后，與對照組相比，自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ和Beclin-1表達明顯增強，說明METH可誘導(dǎo)SY5Y細胞自噬，且METH處理24 h后自噬發(fā)生最明顯。研究表明，METH可明顯誘導(dǎo)神經(jīng)細胞自噬，METH濫用可使機體產(chǎn)生大量活性氧簇( reactive oxygen species, ROS)，并破壞線粒體功能，從而誘導(dǎo)細胞死亡。同時，線粒體功能障礙可增加患神經(jīng)退行性疾病的風(fēng)險[10]。

隨著METH濫用的嚴重性和影響性，藥物戒毒治療的研究逐漸受到重視。針對METH神經(jīng)毒性治療方面，研究表明，褪黑素、?；撬峒癗-乙酰半胱氨酸(NAC)等抗氧化藥物對METH誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性和自噬具有保護作用[11]。本研究選擇云南天然藥物天麻素，探討天麻素在甲基苯丙胺誘導(dǎo)SY5Y細胞自噬中的作用及其作用機制。本研究發(fā)現(xiàn)，天麻素干預(yù)后，細胞折光性增強，部分細胞形態(tài)發(fā)生變化，胞質(zhì)內(nèi)空泡結(jié)構(gòu)減少。給予2 mmol·L-1METH處理前1 h加入1 mmol·L-1天麻素，與對照組相比，天麻素組表達LC3-Ⅱ差異無顯著性，Beclin-1表達水平稍升高。與METH組相比，天麻素+METH組LC3-Ⅱ和Beclin-1表達水平均明顯降低，說明天麻素可減弱METH誘導(dǎo)的SY5Y細胞自噬，對METH誘導(dǎo)的SY5Y細胞自噬有一定的抑制作用。

mTOR是調(diào)節(jié)自噬的負調(diào)控因子，當(dāng)機體處于饑餓狀態(tài)和產(chǎn)生大量ROS時， mTOR的活性被抑制而激發(fā)自噬。研究表明，ERK、JNK、p38 MAPK信號通路和Beclin1/Bcl-2復(fù)合物、Beclin1-ClassⅢPI3K等參與了自噬的調(diào)節(jié)[12-14]。PI3K-Akt-mTOR信號通路是調(diào)節(jié)自噬的經(jīng)典信號通路，被證實參與了阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)與帕金森病 (Parkinson’s disease，PD)動物模型的發(fā)病過程[15]。PI3K-Akt能夠調(diào)節(jié)下游mTOR活性，mTOR為自噬的重要調(diào)節(jié)蛋白[16]。研究表明，天麻素能夠通過抑制LPS誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細胞過度自噬，發(fā)揮保護作用，其保護作用與天麻素調(diào)控凋亡相關(guān)的Bcl-2、Bax表達及自噬相關(guān)的PI3K-Akt-mTOR、p38 MAPK信號通路密切相關(guān)[9]。因此，本研究檢測了天麻素干預(yù)前后Akt、p-Akt、mTOR和p-mTOR的表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2 mmol·L-1METH處理SY5Y細胞24 h后，與對照組相比，p-mTOR和p-Akt表達水平明顯降低，然而，mTOR和Akt表達無明顯差異，說明METH誘導(dǎo)SY5Y細胞自噬與其減弱p-mTOR和p-Akt的表達水平有關(guān)。提前1 h給予1 mmol·L-1天麻素干預(yù)后，與METH組相比，天麻素+METH組Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR的表達水平均升高,說明天麻素通過增強Akt、p-Akt、mTOR和p-mTOR的表達水平，發(fā)揮抑制METH誘導(dǎo)SY5Y細胞自噬的作用。

由于METH神經(jīng)毒性戒斷藥物的研究目前尚處于起步階段，本實驗通過研究天麻素在METH誘導(dǎo)SY5Y細胞自噬中的作用及機制，揭示了天麻素對METH誘導(dǎo)的SY5Y細胞自噬具有一定的抑制作用，其機制與天麻素調(diào)控Akt和mTOR信號通路密切相關(guān)。本研究可為METH濫用者提供治療的新策略，同時也為中藥的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

(致謝：本實驗是在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院生物研究所實驗動物中心和昆明醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院實驗室完成的，對為本實驗辛勤付出的老師和同學(xué)表示衷心的感謝)。

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