補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚誘導(dǎo)HepaRG細(xì)胞損傷機(jī)制探討

季宇彬，王　敏，王　姍，羅　云，孫桂波，孫曉波

(1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與環(huán)境科學(xué)研究中心，黑龍江 哈爾濱　150076；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所藥理毒理中心，北京　100193)

藥物性肝損傷(drug-induced liver injury， DILI)是指各種的處方藥及非處方藥造成的肝損傷，主要包括小分子化學(xué)物質(zhì)、生物制劑、中藥、天然藥物、保健品和膳食補(bǔ)充劑[1]。目前，隨著各種新藥研發(fā)及臨床聯(lián)合用藥的增多，使DILI發(fā)病率逐年增多[2]。但是其影響因素較多，臨床早期癥狀不明顯，發(fā)病具有不可預(yù)測性，近10年來，已成為最常見且最嚴(yán)重臨床副反應(yīng)，給臨床用藥和新藥研發(fā)都造成巨大的障礙，引起了廣泛的關(guān)注[3-4]。因此，解決此問題已成為研究者的重大挑戰(zhàn)。DILI按其發(fā)病機(jī)制不同分為固有型DILI和特異質(zhì)型DILI，前者與藥物劑量有關(guān)，后者涉及遺傳代謝因素[5]。其毒性作用機(jī)制主要涉及氧化應(yīng)激、線粒體損傷、炎癥反應(yīng)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等方面。HepaRG人肝細(xì)胞能表現(xiàn)人原代肝細(xì)胞的大部分功能，其對CYP酶的誘導(dǎo)和抑制作用與人原代肝細(xì)胞基本一致。有研究表明，在毒理學(xué)研究方面，其細(xì)胞毒性與原代肝細(xì)胞表現(xiàn)相吻合[6]，而且還有異于原代肝細(xì)胞的優(yōu)勢，非常有希望成為人原代肝細(xì)胞的替代物。根據(jù)最近文獻(xiàn)報(bào)道，HepaRG細(xì)胞系在用于藥物誘導(dǎo)的肝毒性篩選方面顯示出比L-02、HepG2、hiHeps、PRLs 4種肝細(xì)胞都優(yōu)越的特點(diǎn)[7]。

線粒體是肝臟內(nèi)重要的細(xì)胞器之一，是細(xì)胞生存的主要能量來源，對于細(xì)胞內(nèi)能量代謝、凋亡和衰老具有重要作用，是藥物作用的關(guān)鍵靶標(biāo)，藥物導(dǎo)致的肝細(xì)胞凋亡能改變線粒體的功能和能量狀態(tài)，因此，線粒體被認(rèn)為是介導(dǎo)肝細(xì)胞損傷和凋亡的中心環(huán)節(jié)，介導(dǎo)肝細(xì)胞死亡的多種途徑[8]。線粒體損傷主要表現(xiàn)在線粒體呼吸酶活性的降低、氧自由基的增多、線粒體膜電位的降低、線粒體膜通透性增加、鈣紊亂等方面。線粒體損傷導(dǎo)致肝細(xì)胞死亡的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一就是線粒體膜通道開放孔的開放，隨后介導(dǎo)線粒體膜電位的降低、線粒體呼吸鏈及ATP合成障礙，大量離子和水等進(jìn)入線粒體基質(zhì)，引起基質(zhì)腫脹、線粒體膜破裂、細(xì)胞色素C等促凋亡因子釋放，進(jìn)而激活凋亡家族蛋白引起細(xì)胞死亡[9-10]。

在我國引起DILI的前 5 類藥物中，中藥排在第1位。因此對于中藥造成的DILI更應(yīng)加強(qiáng)監(jiān)管、預(yù)測及治療。補(bǔ)骨脂是豆科植物補(bǔ)骨脂的干燥成熟果實(shí)，藥理作用廣泛，臨床應(yīng)用較多。補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚是補(bǔ)骨脂乙醇提取物中的一種黃酮類化合物，研究表明其具有抗炎、抗腫瘤，抗氧化、神經(jīng)保護(hù)、治療哮喘及心血管疾病等方面的作用[11]，藥物臨床開發(fā)應(yīng)用價(jià)值較大。因此，我們利用HepaRG細(xì)胞對其肝毒性進(jìn)行檢測，并對其毒性作用機(jī)制做初步探究。

1　材料

1.1細(xì)胞HepaRG細(xì)胞購自上海冠導(dǎo)生物工程有限公司；HepG2細(xì)胞購自協(xié)和細(xì)胞庫。

1.2藥物與試劑補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚(批號：161205)，純度99.93%，購自上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司；MTT、JC-1染料(Sigma公司)；Hoechst 33342/碘化丙啶(propidiumiodide，PI)凋亡檢測試劑(Invitrogen公司)；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)試劑盒(C0016)、ATP試劑盒(S0027)均購自碧云天公司；線粒體膜通道開放孔(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)試劑盒(杰美GMS10095.1v.A)；caspase-3活性檢測試劑盒(Biovision K105-25)；細(xì)胞色素C(cytochrome C，cyt C)抗體(Abcam公司)；Bax抗體、Bcl-2抗體(Proteintech公司)；BCA蛋白定量試劑盒、高靈敏度化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒，均購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.3儀器ZHJH-C1115B 型超凈工作臺(上海智成分析儀器制造有限公司)，Heraeus BB15型二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo Scientific)，Infinite M1000型酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司)，EVOS?FL Imaging 倒置熒光顯微鏡(美國Life Technologies)，電泳槽、轉(zhuǎn)膜槽、凝膠成像儀(美國 Bio-Rad)。

2　方法

2.1補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚對HepaRG細(xì)胞毒性作用取對數(shù)生長期的HepaRG細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至1×108·L-1接種于96孔板，37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至密度達(dá)70%～80%；分別設(shè)空白組，不同濃度藥物組與細(xì)胞作用24 h后，每孔加入100 μL MTT染液(5 g·L-1溶于PBS中)，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h；棄上清，每孔加150 μL的 DMSO 溶液，振蕩3 min，置于全自動(dòng)酶標(biāo)儀570 nm處測定其吸光度值，并計(jì)算其半數(shù)致死量。

2.2補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚對HepaRG細(xì)胞死亡方式的影響藥物處理方式：分別設(shè)置空白組、補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚6.25、12.5、25 μmol·L-1劑量組，作用24 h。

2.2.1Hoechst 33342/PI染色檢測藥物對HepaRG細(xì)胞凋亡的影響藥物處理結(jié)束后，棄上清，用PBS洗2次，加入Hoechst 33342染料，終濃度為10 g·L-1，37℃孵育15 min，棄染料，PBS洗2次，加入PI染料100 μL(5 g·L-1)，37℃孵育10 min，棄染料，加100 μL PBS，置熒光顯微鏡下拍片。

2.2.2LDH試劑盒檢測藥物對HepaRG細(xì)胞壞死的影響藥物處理結(jié)束后，棄上清，加入150 μL PBS稀釋10倍的LDH 釋放試劑，孵育1 h，靜置，每孔取上清120 μL到新的96孔板中，酶標(biāo)儀檢測。

2.2.3Western blot檢測藥物對HepaRG細(xì)胞中Bax/Bcl-2蛋白的影響培養(yǎng)瓶接種細(xì)胞，藥物處理結(jié)束后，棄上清，PBS洗1遍，加入胰蛋白酶消化后，1 500 r·min-1離心5 min收集細(xì)胞，500 μL PBS重懸細(xì)胞，3 000 r·min-1離心5 min，加入蛋白酶裂解液，以95%的功率超聲1 min，4℃靜置30 min，12 000 r·min-1離心30 min，取上清液。BCA定量蛋白濃度。取定量后的蛋白加5×loading buffer煮沸變性，SDS-PAGE電泳80 V分離，300 mA恒流濕轉(zhuǎn)至NC膜，再用含5%脫脂奶粉的TBST封閉2 h，一抗封閉過夜，TBST清洗3次，每次15 min，二抗封閉90 min，重復(fù)TBST清洗步驟，加顯色劑顯影。

2.2.4caspase-3試劑盒檢測藥物對HepaRG細(xì)胞中caspase-3活性的影響藥物處理結(jié)束后，棄上清，加入細(xì)胞裂解液，冰上孵育10 min，每孔加入2×buffer 20 μL，再每孔加入DEVD-AFC 2 μL，混勻，37℃避光孵育2 h，酶標(biāo)儀400～505 nm檢測。

2.3補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚對線粒體影響

2.3.1線粒體膜電位檢測試劑(JC-1)檢測藥物對HepaRG細(xì)胞線粒體膜電位的影響藥物處理結(jié)束后，加入JC-1染料(10 g·L-1)100 μL，37 ℃避光孵育30 min，去除染料，PBS洗2次，每孔加PBS 100 μL，熒光顯微鏡下拍片。另取6孔板，藥物處理結(jié)束后，棄上清液，PBS洗2次，加入胰酶消化后，1 500 r·min-1離心5 min收集細(xì)胞，棄上清，加JC-1染料，37℃避光孵育30 min，離心，去除染料，400 μL PBS重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至96孔板，每孔100 μL，3個(gè)復(fù)孔。置酶標(biāo)儀514～585 nm檢測。

2.3.2ATP試劑盒檢測藥物對HepaRG細(xì)胞能量代謝的影響6孔板接種細(xì)胞，藥物處理結(jié)束后，棄上清液，每孔加入200 μL裂解液，充分裂解后，4℃、12 000×g離心5 min，取上清，轉(zhuǎn)移至96孔板，每孔60 μL，3個(gè)復(fù)孔，每孔加100 μL ATP檢測工作液，并根據(jù)試劑盒做其標(biāo)準(zhǔn)曲線，酶標(biāo)儀檢測。

2.3.3MPTP試劑盒檢測藥物對HepaRG細(xì)胞線粒體膜通道的影響藥物處理結(jié)束后，棄上清，加入100 μL 37 ℃預(yù)熱的GENMED清理液清洗細(xì)胞，抽去清理液，加100 μL含有GENMED染色液和GENMED中和液的GENMED染色工作液(1 ∶100)到1個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)孔，覆蓋培養(yǎng)皿表面，37 ℃避光孵育20 min，抽去染色工作液，再加清理液100 μL，洗2次，再加100 μL清理液，酶標(biāo)儀下，以激發(fā)波488 nm、發(fā)射波505 nm檢測，并于熒光顯微鏡下拍照。

Fig1Differentconcentrations

ofbavachininfor24h

A: Cell morphology after 24h of different concentrations of bavachinin； B: 24 h toxicity curve of bavachinin. a: Control; b:bavachinin 1.5625 μmol·L-1; c:bavachinin 3.125 μmol·L-1;d:bavachinin 6.25 μmol·L-1;e:bavachinin 12.5 μmol·L-1; f:bavachinin 25 μmol·L-1; g:bavachinin 50 μmol·L-1; h:bavachinin 100 μmol·L-1

2.3.4Western blot檢測藥物對HepaRG細(xì)胞中cyt C蛋白的影響方法同“2.2.3”。

3　結(jié)果

3.1補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚毒性劑量篩選結(jié)果補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚在2種細(xì)胞中，以濃度為1.5625、3.125……100 μmol·L-1作用24 h后，MTT法檢測其細(xì)胞存活率結(jié)果見Fig 1B,細(xì)胞形態(tài)見Fig 1A，正常HepaRG細(xì)胞呈現(xiàn)肝細(xì)胞樣顆粒狀上皮細(xì)胞，隨藥物濃度增加，細(xì)胞出現(xiàn)死亡，細(xì)胞形態(tài)皺縮呈圓形。計(jì)算其IC50值分別為HepaRG：11.97 μmol·L-1，HepG2：15.75 μmol·L-1。

3.2補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚誘導(dǎo)細(xì)胞損傷

3.2.1補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚對細(xì)胞凋亡的影響補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚6.25、12.5、25 μmol·L-1作用24 h后發(fā)現(xiàn)，在6.25、12.5 μmol·L-1時(shí)，正常細(xì)胞呈淺藍(lán)色熒光，而具有細(xì)胞凋亡特征細(xì)胞核表現(xiàn)為固縮形態(tài)或顆粒狀的熒光，呈亮藍(lán)色的細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，此時(shí)PI染色的紅色熒光并不明顯，細(xì)胞以凋亡為主，但是在25 μmol·L-1時(shí)，毒性較強(qiáng)，細(xì)胞呈紅色熒光，細(xì)胞主要表現(xiàn)為壞死(Fig 2)。

White arrow: Early apoptotic nuclei; Yellow arrow: Necrosis of the nucleus. A: Control; B: bavachinin 6.25 μmol·L-1; C:bavachinin 12.5 μmol·L-1;D: bavachinin 25 μmol·L-1; E: Quantitative analysis of apoptotic cell ratio.**P<0.01vscontrol

3.2.2LDH檢測補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚導(dǎo)致的細(xì)胞壞死在檢測細(xì)胞凋亡的情況下，我們有對壞死指標(biāo)LDH活力進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚6.25、12.5、25 μmol·L-1作用24 h后，細(xì)胞LDH活力在6.25 μmol·L-1時(shí)增加不明顯，而在12.5、25 μmol·L-1時(shí)明顯增加，與之前Hoechst 33342結(jié)果相吻合，在25 μmol·L-1時(shí)HepaRG細(xì)胞以壞死為主(Fig 3)。

Fig 3　Effect of bavachinin for 24h on LDH leakage(±s,n=3)

**P<0.01vscontrol

3.2.3補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚對Bax、Bcl-2蛋白的影響補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚6.25、12.5、25 μmol·L-1作用24 h后，隨藥物濃度增大，Bax/Bcl-2比值不斷增加(Fig 4)。

Fig 4　Effect of bavachinin for 24h on activity

A:Protein band of Bax and Bcl-2; B:Grayscale scanning Bax/Bcl-2.**P<0.01vscontrol

3.2.4補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚對caspase-3活性的影響補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚6.25、12.5、25 μmol·L-1作用24 h后，隨藥物濃度增大，caspase-3活性不斷增強(qiáng)(Fig 5)。

Fig 5　Effect of bavachinin for 24 h on activity

**P<0.01vscontrol

3.3補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚對線粒體的影響

3.3.1補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚對線粒體膜電位的影響補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚6.25、12.5、25 μmol·L-1作用24 h后，隨藥物濃度增大，線粒體膜電位逐漸降低(Fig 6)。

3.3.2補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚對細(xì)胞內(nèi)ATP的影響補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚6.25、12.5、25 μmol·L-1作用24 h后，隨藥物濃度的增大，細(xì)胞內(nèi)ATP含量不斷降低(Fig 7)。

3.3.3補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚對細(xì)胞MPTP的影響補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚6.25、12.5、25 μmol·L-1作用24 h后，MPTP通透性逐漸增大(Fig 8)。

3.3.4補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚對細(xì)胞cyt C蛋白的影響Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，cyt C蛋白濃度隨藥物濃度的升高而升高(Fig 9)，說明細(xì)胞死亡過程中涉及cyt C的釋放，且補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚毒性作用誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

4　討論

肝臟作為藥物代謝的主要場所，也更容易成為藥物損傷的主要器官。近年來，關(guān)于DILI的報(bào)道越來越多，且每年都呈上升趨勢，但是由于其臨床發(fā)病的不可預(yù)測性及早期臨床癥狀不明顯等因素，可能其發(fā)病率遠(yuǎn)大于報(bào)道[2]，因此，解決這一問題尤為重要。

線粒體是多種藥物作用的靶點(diǎn)，因而成為藥物臨床應(yīng)用及研發(fā)的又一大障礙。有研究表明，線粒體在肝細(xì)胞損傷的早期即發(fā)生結(jié)構(gòu)和功能的改變是凋亡的執(zhí)行者[13]。MPTP在引起細(xì)胞的凋亡和壞死中都具有重要作用。MPTP開放初期啟動(dòng)細(xì)胞凋亡，使線粒體腫脹、外膜破裂、細(xì)胞色素C釋放，但是隨藥物損傷的加劇，線粒體氧化磷酸化解偶聯(lián)，其ATP的合成受阻，產(chǎn)生能量代謝障礙，在ATP耗竭時(shí)，細(xì)胞發(fā)生壞死[14]。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚在低濃度6.25 μmol·L-1時(shí)就可以導(dǎo)致MPTP的開放，在此期間還伴隨著線粒體膜電位的降低，ATP合成降低，細(xì)胞色素C活性增強(qiáng)，并且隨藥物濃度增加線粒體損傷加劇。對凋亡相關(guān)指標(biāo)檢測時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨藥物濃度增加，Bax/ Bcl-2蛋白比例增大，caspase-3活性增強(qiáng)，但在高劑量25 μmol·L-1時(shí)，此時(shí)細(xì)胞雖然仍有凋亡，但主要表現(xiàn)為壞死。所以我們推測，補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚導(dǎo)致的HepaRG細(xì)胞的凋亡和壞死，應(yīng)該是通過損傷線粒體介導(dǎo)的，在6.25、12.5 μmol·L-1時(shí)，損傷較輕，細(xì)胞以凋亡為主，而在25 μmol·L-1時(shí)，損傷過重，細(xì)胞以壞死為主。

補(bǔ)骨脂由于其藥理作用廣泛，深受臨床用藥的歡迎，但是目前大量的臨床及實(shí)驗(yàn)研究都表明補(bǔ)骨脂存在肝毒性，而且其成分復(fù)雜，毒性成分難以確認(rèn)，是否存在藥物之間的相互作用關(guān)系也尚未知曉。此外，國家食品藥品監(jiān)督管理總局藥品評價(jià)中心對補(bǔ)骨脂進(jìn)行的風(fēng)險(xiǎn)評估也表明，補(bǔ)骨脂用藥風(fēng)險(xiǎn)主要為肝損傷，因此，明確其肝毒性成分，了解其毒性作用，并有效規(guī)避其毒副作用，對于提高補(bǔ)骨脂臨床用藥的安全性具有重要意義。目前針對補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚的研究甚少，主要集中在其保護(hù)作用方面，而且其作用機(jī)制等尚不明確，因此加強(qiáng)對補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚研究，對指導(dǎo)臨床用藥提高臨床用藥價(jià)值都具有非常重要的意義。

Fig 6　Effect of bavachinin treatment on mitochondrial

A: Control; B: 6.25 μmol·L-1;C: 12.5 μmol·L-1;D: 25 μmol·L-1; E: Quantitative analysis of JC-1 red/green fluorescence ratio.*P<0.5,**P<0.01vscontrol

Fig 7　Effect of bavachinin treatment on intracellular ATP

**P<0.01vscontrol

Fig 8　Effect of bavachinin on permeability of mitochondrial

A:Control; B:6.25 μmol·L-1;C:12.5 μmol·L-1; D: 25 μmol·L-1; E:Quantitative analysis of MPTP fluorescence ratio.*P<0.5,**P<0.01vscontrol

Fig 9　Effect of bavachinin for 24 h on activity

A:Cyt C and β-actin protein band; B:Grayscale scanning cyt C/β-actin.*P<0.5,**P<0.01vscontrol

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