下丘腦室旁核Epac蛋白在大鼠炎性痛調(diào)節(jié)過程中的作用及其機(jī)制研究

陳彬彬，黃思婷，花景煜，杜　雷，姬寧寧，宋　昱，章功良，張?jiān)伱?/p>

(1. 江蘇省麻醉學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，徐州醫(yī)科大學(xué)麻醉學(xué)院，江蘇 徐州　221002；2. 安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，安徽 合肥　230032)

疼痛是組織損傷或潛在組織損傷所引起的一種不愉快的主觀感受和情感體驗(yàn)。按照國際疼痛研究學(xué)會(international association for the study of pain，IASP)的分類，疼痛包括生理性和病理性疼痛，其中病理性疼痛可進(jìn)一步分為炎癥性疼痛、神經(jīng)病理性疼痛和癌性疼痛等。炎癥性疼痛是臨床上最常見的一種癥狀，主要由于周圍組織損傷、缺血、缺氧、酸中毒等引起。目前的研究主要集中在外周組織炎癥反應(yīng)[1]，外周神經(jīng)元興奮性增高[2]，中樞興奮性神經(jīng)遞質(zhì)大量釋放[3]，以及膠質(zhì)細(xì)胞或炎癥因子敏化[4]等。在炎癥痛中，持續(xù)刺激外周傷害性感受器，提高了神經(jīng)元的興奮性，可以促進(jìn)背根神經(jīng)節(jié)、脊髓以及相應(yīng)腦組織痛相關(guān)的物質(zhì)表達(dá)[5]。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，cAMP直接激活的交換蛋白(exchange protein directly activated by cAMP，Epac)在疼痛調(diào)節(jié)過程中也發(fā)揮了重要作用[6]。Epac蛋白是cAMP激活的鳥苷酸交換因子(guanine-nucleotide-exchange factor，GEF)，它可以直接作用于下游小G蛋白Rap蛋白，置換和Rap蛋白結(jié)合的GDP為GTP，從而激活Rap蛋白[7]。根據(jù)RAPGEF3和RAPGEF4基因編碼，Epac可分為Epac1和Epac2兩種亞型，Epac2根據(jù)N端剪輯不同，又可分為Epac2A、Epac2B、Epac2C三種類型[8]。Epac1在全身分布比較廣泛，如中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心臟、血管內(nèi)皮細(xì)胞等；Epac2在全身表達(dá)部位比較局限[8]。有研究表明，Epac可以通過下游的Rap1、PKC、MEK/ERK、GRK2等信號分子介導(dǎo)疼痛反應(yīng)[9]。MEK是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)激酶，包括MEK1和MEK2兩種亞型，可介導(dǎo)多種生理病理功能，如在大鼠結(jié)腸炎腸黏膜通透性[10]以及血管平滑肌細(xì)胞增殖[11]中發(fā)揮了重要作用。且已有研究表明，在炎癥性疼痛模型中，外周傷害性感覺神經(jīng)元中表達(dá)升高的Epac蛋白可以通過下游MEK/ERK信號通路，直接或間接發(fā)揮著傷害性刺激激活神經(jīng)元的作用[12]。

炎癥性疼痛是一種損傷性應(yīng)激反應(yīng)，下丘腦作為神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)的重要樞紐站，其中室旁核(paraventricular nucleus，PVN)在應(yīng)激及疼痛調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要的作用[13]。因此,本研究采用一種常用的動物疼痛模型——完全弗氏佐劑(complete Freund’s adjuvant，CFA)誘導(dǎo)的炎性痛模型，采用蛋白質(zhì)印跡的方法觀察炎癥痛條件下下丘腦室旁核Epac和p-MEK1/2的蛋白表達(dá)變化，使用Epac激動劑8p-CPT作用后，觀察其行為學(xué)和分子水平改變，為進(jìn)一步理解炎性痛的發(fā)病機(jī)制及探討Epac蛋白在炎性痛中的作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料

1.1實(shí)驗(yàn)動物健康成年SD大鼠64只，♂，體質(zhì)量230～250 g，由山東濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動物繁育有限公司提供，許可證號：SCXK(魯)20140007。大鼠置于晝夜(12 h/12 h)節(jié)律光照條件下，室溫(23±1)℃，自由飲水和攝食，所有大鼠實(shí)驗(yàn)前靜養(yǎng)1周。所有實(shí)驗(yàn)均遵守《實(shí)驗(yàn)動物使用規(guī)范》。

1.2試劑抗Epac1抗體(Lot：GR29965-14)和抗Epac2抗體(Lot：GR127767-1)均購自Abcam；抗p-MEK1/2抗體(9154S)購自Cell Signaling Technology；抗GAPDH抗體(Cat.No:AC001)購自ABclonal；堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；8p-CPT-2′-O-Me-cAMP購自Santa Cruz Biotechnology；CFA購自Sigma；BCIP/NBT堿性磷酸酶顯色試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.3儀器熱痛敏刺激儀(IITC series 8-390)購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所；機(jī)械痛測試儀(ZH)購自淮北立華生物儀器設(shè)備有限公司。

2　方法

2.1CFA炎癥性疼痛模型的制備與實(shí)驗(yàn)分組將SD大鼠隨機(jī)分為對照組和CFA模型組，每組6只。大鼠固定，用微量注射器吸取100 μL CFA注入大鼠左側(cè)后肢足底中心皮下，建立炎癥性疼痛模型；生理鹽水對照組于相同位置注射100 μL生理鹽水。模型建立成功的標(biāo)志為大鼠局部出現(xiàn)典型的外周炎癥癥狀，包括注射局部紅、腫以及疼痛表現(xiàn)等，持續(xù)時(shí)間超過1周。首先進(jìn)行大鼠熱縮足反射潛伏期(thermal withdrawal latency，TWL)和機(jī)械縮足反射閾值(paw mechanical withdraw threshold，PMWT)基礎(chǔ)值的測定，此后于足底注射后1、3、5、7、9、11、13 d進(jìn)行TWL檢測，足底注射后6、8、10、12、14 d進(jìn)行PMWT檢測。根據(jù)行為學(xué)以及蛋白檢測結(jié)果，在CFA炎癥性疼痛模型建立后，對大鼠進(jìn)行下丘腦室旁核核團(tuán)給藥，分為室旁核微量注射生理鹽水組(Saline)和給藥(8p-CPT)組，每組6只，分別PVN微量注射0.3 μL 0.9%生理鹽水或8p-CPT(1 g·L-1)。

2.2下丘腦室旁核核團(tuán)注射CFA致炎后d 3，大鼠七氟烷吸入麻醉后，將頭部固定于大鼠腦立體定位儀上，暴露顱骨，雙氧水清潔顱骨表面，參考Watson & Paxinos大鼠腦圖譜，結(jié)合本課題組對大鼠(230～250) g PVN核團(tuán)定位摸索，確定核團(tuán)坐標(biāo)為：ML=±0.4 mm，AP=-1.4 mm，DV=7.7 mm[13]。用針尖外徑為0.3 mm的微量注射器向核團(tuán)內(nèi)注射，1 min內(nèi)注射完畢，留針5 min以防藥液流出，統(tǒng)一選取右側(cè)PVN進(jìn)行注射。注射后20 min、1 h、2 h檢測熱痛閾。

2.3TWL的測定在同一時(shí)間段、同一室溫、同一濕度下進(jìn)行測定。按照Hargreaves法，將大鼠放置于3 mm厚的15 cm×15 cm×15 cm的有機(jī)玻璃箱中，待大鼠在其中適應(yīng)30 min安靜后，用熱痛敏刺激儀照射大鼠左后肢足底后外側(cè)。從照射開始至大鼠出現(xiàn)抬腿回避的時(shí)間為TWL；光源刺激強(qiáng)度恒定不變，自動切斷時(shí)間為25 s，以防止組織損傷。每只動物連續(xù)測定5次，測量間隔3 min，取其中3次比較平穩(wěn)的數(shù)據(jù)平均值為大鼠TWL。

2.4PMWT的測定在安靜環(huán)境下將大鼠置入透明的有機(jī)玻璃箱中，其底為金屬絲制成的網(wǎng)狀格墊。同一時(shí)間段，先將大鼠放入箱中，使之適應(yīng)30 min直至大鼠對陌生環(huán)境保持安靜(不在籠里走來走去、不自我舔舐為止)。采用von Frey filaments刺激大鼠左側(cè)掌跖部無毛處，Von Frey filaments呈“S”型，作用時(shí)間6～8 s，緩慢用力，出現(xiàn)抬足、躲避或舔足動作為陽性反應(yīng)，每次刺激至少間隔30 s。測量時(shí)，選取中間值10.0 g作為起始，若縮足反應(yīng)為陰性，則選用刺激強(qiáng)度呈對數(shù)遞增的相鄰von Frey filaments繼續(xù)刺激；若縮足反應(yīng)為陽性，則選擇相鄰遞減的刺激強(qiáng)度給予刺激。如此反復(fù)，以第1個(gè)轉(zhuǎn)折點(diǎn)的前一點(diǎn)為起點(diǎn)，連續(xù)6次的刺激結(jié)果為最終縮足反應(yīng)模式。若縮足反應(yīng)呈持續(xù)陽性則為5次刺激，縮足反應(yīng)呈持續(xù)陰性則為4次刺激，刺激次數(shù)最多為9次；最大力度為26 g，大于此值時(shí)記為26 g，最小力度為4 g，小于此值時(shí)記為4 g。采用內(nèi)推法計(jì)算誘發(fā)大鼠出現(xiàn)50%機(jī)械縮足反應(yīng)的刺激強(qiáng)度作為機(jī)械痛閾，其公式為：50% threshold(g)=(10[Xf+κδ])/10 000(Xf為最后一次刺激強(qiáng)度；κ為不同刺激方式的系數(shù)，在內(nèi)推法的表格中查找；δ為各刺激強(qiáng)度取對數(shù)后間距的平均值，δ=0.18)。

2.5Westernblot檢測行為學(xué)測試結(jié)束后，10%水合氯醛(3 mL·kg-1)腹腔注射麻醉大鼠后取腦，分離出雙側(cè)室旁核。將取出的室旁核放入預(yù)冷的裂解液中，在冰上使用電動勻漿器進(jìn)行勻漿，每個(gè)樣本勻漿3次，每次10 s，間隔5 s冷卻，充分裂解后離心15 min，取上清液， BCA法對裂解后的蛋白濃度進(jìn)行檢測，配平，隨后加入5×上樣緩沖液，放入沸水中煮沸15 min使蛋白變性。用10% SDS～PAGE電泳分離蛋白，通過濕轉(zhuǎn)方式將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。5%脫脂牛奶封閉2 h后，以相應(yīng)的檢測蛋白抗體4℃孵育過夜，TBST緩沖液洗膜5 min×3次；用堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h，再次洗滌，TBST緩沖液洗膜5 min×3次，BCIP/NBT堿性磷酸酶顯色試劑盒顯色，以Image J軟件進(jìn)行圖像分析。

3　結(jié)果

3.1CFA誘導(dǎo)炎癥性疼痛行為學(xué)改變與對照組相比，CFA組的TWL和PMWT基礎(chǔ)值均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與對照組相比，大鼠左側(cè)足底皮下注射CFA后d 1、3、5、7、9、11 TWL明顯降低(P<0.01)，d 13 TWL基本恢復(fù)至正常水平(Fig 1A)；注射后d 6、8、10、12 PMWT明顯降低(P<0.05，F(xiàn)ig 1B)。在此過程中大鼠患足伴有紅腫、行走困難、提縮患爪等一系列保護(hù)性行為。

3.2CFA炎性痛大鼠下丘腦室旁核Epac1、Epac2和p-MEK1/2蛋白表達(dá)情況如Fig 2所示，與對照組相比，CFA炎性痛大鼠下丘腦室旁核Epac1蛋白表達(dá)于d 3開始降低，且在d 3和d 9差異有顯著性(P<0.05)，而Epac2蛋白表達(dá)則無明顯變化；p-MEK1/2蛋白表達(dá)于d 3明顯降低(P<0.05)。

3.3PVN內(nèi)注射8p-CPT對大鼠痛行為學(xué)及p-MEK1/2蛋白表達(dá)的影響CFA炎性痛大鼠于d 3，PVN內(nèi)注射Epac非特異激動劑8p-CPT后，與生理鹽水組相比，8p-CPT組大鼠的TWL明顯升高(P<0.05)，這一效應(yīng)在給藥后20～30 min達(dá)到最大，到2 h衰減到給藥前水平(Fig 3A)。給予激動劑30 min后，室旁核p-MEK1/2蛋白表達(dá)較生理鹽水組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；給藥2 h后，室旁核p-MEK1/2蛋白表達(dá)基本恢復(fù)至給藥前水平(Fig 3B)。

4　討論

Epac蛋白是cAMP下游信號分子，可以介導(dǎo)cAMP多種效應(yīng)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮促神經(jīng)軸突生長[14]、神經(jīng)遞質(zhì)釋放[15]、神經(jīng)元分化與重塑以及突觸傳遞等功能[9]。有研究表明，在外周感覺神經(jīng)元中Epac蛋白表達(dá)升高可促進(jìn)長時(shí)程炎癥性疼痛，通過有效的干預(yù)手段使Epac表達(dá)恢復(fù)正常，可抑制疼痛持續(xù)性發(fā)展[12]。

Fig 1　Effects of CFA administration on TWL(A) and PMWT(B) in SD rats

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

我們前期的研究發(fā)現(xiàn)[13]，幼年經(jīng)過結(jié)直腸擴(kuò)張應(yīng)激后可致成年大鼠發(fā)生慢性內(nèi)臟痛敏表現(xiàn)，且這一作用可能和室旁核促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(corticotropin-releasing hormone，CRH)神經(jīng)元敏化作用有關(guān)，敏化的CRH神經(jīng)元可分泌大量CRH，并激活其胞膜CRHR1。CRHR1是G蛋白偶聯(lián)受體，其被激活時(shí)胞內(nèi)cAMP、Epac、PKA等相關(guān)信號分子的表達(dá)量或激活情況可能發(fā)生改變。在炎癥性疼痛模型中對此相關(guān)研究甚少，因此，本實(shí)驗(yàn)采用CFA誘導(dǎo)的炎性痛模型，該模型成功模擬了炎性痛局部紅、腫、熱、痛等癥狀，并且可維持一段時(shí)間。結(jié)果證實(shí)，大鼠CFA致炎后d 1 TWL即降低，直到d 11維持在較低水平，d 13 基本恢復(fù)到正常水平，而PMWT于d 14仍維持在較低水平；在d 3室旁核Epac1和p-MEK1/2蛋白表達(dá)均降低，并可維持一段時(shí)間，這與已有報(bào)道致炎后外周感覺神經(jīng)元Epac蛋白表達(dá)水平升高正好相反[2]，這可能與外周和中樞在炎性痛調(diào)節(jié)過程中分別發(fā)揮的不同作用有關(guān)，在此過程中，室旁核p-MEK1/2表達(dá)可能受到多種上游信號分子影響；而致炎后Epac另一種亞型Epac2蛋白表達(dá)在各時(shí)間點(diǎn)并無明顯變化，因此，我們認(rèn)為，在CFA致炎過程可能參與發(fā)揮作用的Epac類型是Epac1蛋白。CFA致炎后d 3室旁核注射Epac非特異性激動劑8p-CPT 20～30 min后鎮(zhèn)痛效果最佳，1 h尚具有明顯的鎮(zhèn)痛效果，至2 h基本恢復(fù)到給藥前水平，這可能與藥物代謝有關(guān)。與生理鹽水組相比，8p-CPT組室旁核p-MEK1/2蛋白表達(dá)明顯升高，2 h后8p-CPT組p-MEK1/2蛋白水平恢復(fù)至給藥前水平，這和行為學(xué)結(jié)果相一致。故下丘腦室旁核Epac1-MEK1/2信號通路可能參與了CFA所致的慢性炎癥性疼痛的發(fā)展過程。

Fig 2　Expression of Epac1(A), Epac2 (B) and p-MEK1/2(C) in PVN in CFA treated rats

*P<0.05vsbaseline

Fig 3　Changes of TWL(A) and expression of p-MEK1/2 protein(B) after injecting Epac non-specific agonist 8p-CPT-2'-O-Me-cAMP in PVN on 3rd post CFA injection

*P<0.05,**P<0.01vssaline group;##P<0.01vs30 min 8p-CPT group.

綜上所述，我們認(rèn)為CFA致炎后，于d 3開始進(jìn)入慢性炎癥期，下丘腦室旁核作為神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)中樞，在外周持續(xù)性炎癥痛刺激下其功能發(fā)生失調(diào)，這可能與室旁核神經(jīng)元發(fā)生敏化有關(guān)，從而導(dǎo)致室旁核對外周痛刺激反應(yīng)性增強(qiáng)，其胞內(nèi)的分子機(jī)制可能與下丘腦室旁核Epac1蛋白表達(dá)降低有關(guān)。降低的Epac1蛋白通過對下游信號分子MEK1/2的激活效應(yīng)減弱，介導(dǎo)了慢性炎癥性疼痛過程，本研究將為臨床慢性炎性痛的治療提供一定的理論基礎(chǔ)和治療靶點(diǎn)。

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