結(jié)直腸癌浸潤性成分中CD44+/ki-67-腫瘤干樣細(xì)胞分布特征及意義

王興芬,張向蓮，許麗萍，鄭海燕，孫保存

(天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，天津300211)

結(jié)直腸癌是我國常見腫瘤之一，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是患者死亡的主要原因，但目前尚無任何臨床病理特征或分子標(biāo)志物可預(yù)測哪些患者可能會發(fā)生轉(zhuǎn)移。腫瘤干細(xì)胞是一群具有自我更新、無限增殖及多向分化潛能的細(xì)胞，是腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的根本原因。我們通過免疫雙染法檢測結(jié)直腸癌浸潤性成分(浸潤性前沿、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶、癌結(jié)節(jié)、肝轉(zhuǎn)移灶)中CD44+/ki-67-腫瘤干樣細(xì)胞的分布特征，并探討其意義?，F(xiàn)報告如下。

1　 資料與方法

1.1臨床資料從天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院病理科2011～2014年結(jié)直腸癌手術(shù)切除標(biāo)本中選取64例結(jié)直腸癌(其中高中分化34例，低分化30例；伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者37例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者27例；伴軟組織癌結(jié)節(jié)者23例，不伴軟組織癌結(jié)節(jié)者41例)，20例結(jié)直腸腺瘤，18例結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移灶(選自本組結(jié)直腸癌標(biāo)本中手術(shù)切除肝轉(zhuǎn)移灶)和10例陰性切端(均為本組結(jié)直腸癌距離癌灶5 cm以上陰性切緣)作為研究對象，結(jié)直腸癌標(biāo)本中男28例、女36例，年齡41～85歲，中位年齡70歲。

1.2芯片制作標(biāo)本術(shù)前均未行放化療，每例標(biāo)本均用10%中性甲醛固定，石蠟包埋，經(jīng)兩名從事多年病理診斷工作的醫(yī)師對切片進(jìn)行復(fù)閱，根據(jù)張登才等[1]發(fā)明的簡便組織芯片制作方法制作芯片，首先用穿刺針在空白蠟塊打孔作為受體蠟塊，然后觀察患者石蠟標(biāo)本(供體)蠟塊HE切片，鏡下標(biāo)記正常結(jié)直腸腸黏膜、腺瘤，結(jié)直腸癌灶中心、浸潤性前緣、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶、癌結(jié)節(jié)、肝轉(zhuǎn)移灶為結(jié)直腸癌浸潤性成分。骨髓穿刺針抽取供體蠟塊相應(yīng)組織柱，將穿刺的組織柱推入受體蠟塊孔內(nèi)，制備5×7陣列石蠟組織芯片，將蠟塊放入60～70 ℃烤箱中，約3 min取出，輕輕擠壓蠟塊使穿刺的組織柱與受體蠟塊相融，自然冷卻后作為制作完成的組織芯片。

1.3結(jié)直腸癌浸潤性成分中CD44+/ki-67-腫瘤干樣細(xì)胞分布特征觀察采用免疫組化雙重染色法。CD44兔抗人多克隆抗體、ki-67鼠抗人單克隆抗體及免疫組化雙染試劑盒均購自北京中杉金橋試劑公司，實(shí)驗(yàn)方法參照免疫組織化學(xué)雙重染色說明書進(jìn)行。結(jié)果判定：CD44蛋白定位于腫瘤細(xì)胞膜，酒紅顯色，呈紅色；ki-67蛋白定位于腫瘤細(xì)胞核，DAB顯色，呈棕黃色-棕褐色。判讀方法：以芯片上每個點(diǎn)為單位，計(jì)數(shù)CD44+/ki-67-細(xì)胞數(shù)所占的百分比，無表達(dá)為-，≤5%為+，6%～15%為++，>15%為+++。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件。通過χ2檢驗(yàn)比較CD44+/ki-67-腫瘤干樣細(xì)胞與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征間的關(guān)系。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1CD44+/ki-67-腫瘤干樣細(xì)胞在正常結(jié)直腸黏膜、結(jié)直腸腺瘤、結(jié)直腸癌及其浸潤性成分中的分布CD44+/ki-67-腫瘤干樣細(xì)胞胞膜呈紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)色，在正常結(jié)直腸黏膜組織中無表達(dá)；在結(jié)直腸腺瘤組織中散在單個或灶性表達(dá)，+者3例；在結(jié)直腸癌組織中，-者3例，+者16例，++者22例，+++者23例，CD44+/ki-67-細(xì)胞較正常結(jié)直腸黏膜和結(jié)直腸腺瘤分布數(shù)量增多(P均<0.05)，主要位于癌灶基底部，單個或灶性分布，浸潤性成分(浸潤性前緣、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶、癌結(jié)節(jié)及肝轉(zhuǎn)移灶)及脈管癌栓中呈簇或小片狀分布，形態(tài)主要為胞核大，呈卵圓形，胞質(zhì)較少，但各浸潤性成分之間CD44+/ki-67-腫瘤干樣細(xì)胞的分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但均較癌灶中心分布數(shù)量多(P<0.05，表1)。

表1　結(jié)直腸癌浸潤性成分中CD44+/ki-67-腫瘤干樣細(xì)胞的分布特征

表2　CD44+/ki-67-腫瘤干樣細(xì)胞分布與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系(例)

2.2CD44+/ki-67-腫瘤干樣細(xì)胞與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系癌組織中不同性別和年齡者CD44+/ki-67-腫瘤干樣細(xì)胞的數(shù)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但與組織分化程度、是否伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和癌結(jié)節(jié)均有關(guān)(P均<0.05，表2)，高中分化者低于低分化者，伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和癌結(jié)節(jié)者較不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和癌結(jié)節(jié)者分布數(shù)量多(P<0.05，表2)。

3　討論

在我國，結(jié)直腸癌總的發(fā)病率在所有惡性腫瘤中位居第四位，而在城市，其發(fā)病率位居第二位，并呈逐年上升趨勢[2]。目前結(jié)直腸癌的主要治療手段仍以手術(shù)為主，輔助放化療及中醫(yī)治療，但治療效果并不理想。患者的生存率取決于腫瘤被發(fā)現(xiàn)時所處的臨床分期，Ⅰ期結(jié)直腸癌5年總生存率為85%～90%，但Ⅳ期結(jié)直腸癌總生存率則<5%[3]。在結(jié)直腸癌治療過程中的主要難題不是去除腫瘤原發(fā)灶，而是轉(zhuǎn)移灶的形成，即浸潤和轉(zhuǎn)移是結(jié)直腸癌患者死亡的主要原因。

腫瘤干細(xì)胞學(xué)理論于2001年由Reya等[4]提出,之后研究者從各種腫瘤組織中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了腫瘤干細(xì)胞，證明腫瘤干細(xì)胞是引發(fā)腫瘤生長分化的決定性細(xì)胞[5]，其具有強(qiáng)致癌性，因此治療腫瘤的關(guān)鍵在于有效清除腫瘤干細(xì)胞[6]，目前流行的靶向治療就是方法之一，但靶向治療的前提條件是找到并標(biāo)記腫瘤干細(xì)胞。目前已發(fā)現(xiàn)眾多腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物，在結(jié)直腸癌中CD133、CD166、CD44、CD24、ALDH1、EpCAM、Oct4等是可能的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物[7]。通常研究者會聯(lián)合應(yīng)用兩種或三種標(biāo)記物對腫瘤干細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，但迄今為止沒有哪種標(biāo)記物能真正代表腫瘤干細(xì)胞，CD44是目前被承認(rèn)最多的標(biāo)記物，研究發(fā)現(xiàn)，將100個CD44+結(jié)腸癌細(xì)胞種植裸鼠體內(nèi)可形成癌灶，培養(yǎng)單個CD44+結(jié)腸癌細(xì)胞就能形成細(xì)胞集落，RNA干擾法降低CD44表達(dá)后，細(xì)胞集落生長緩慢并顯著減少，證明CD44+結(jié)腸癌細(xì)胞具有干細(xì)胞的特性[8]。腫瘤干細(xì)胞與正常干細(xì)胞相似，均處于細(xì)胞靜止期(G1/G0期)，即具有低增殖的特性[9]，二者主要區(qū)別在于正常干細(xì)胞是受調(diào)控的自我更新分化，而腫瘤干細(xì)胞是失控的生長[10]。顏暢等[11]結(jié)果顯示，ki-67-/low細(xì)胞為慢增殖細(xì)胞，具有顯著的自我更新能力，根據(jù)腫瘤干細(xì)胞的特性及定義，ki-67-/low可在結(jié)直腸癌中作為富集腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)記物。本研究結(jié)果顯示，CD44+/ki-67-腫瘤干樣細(xì)胞在結(jié)直腸正常黏膜中無分布，在腺瘤中少量分布，在癌組織中的分布數(shù)量明顯增多，且在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和癌結(jié)節(jié)的腫瘤組織中，其分布數(shù)量均增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明CD44+/ki-67-腫瘤干樣細(xì)胞在結(jié)直腸癌惡性生物學(xué)行為中起重要作用。

盡管惡性腫瘤的檢測和治療手段取得較大進(jìn)步，但遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，尤其是肝轉(zhuǎn)移仍是結(jié)直腸癌患者死亡的主要原因[12]。浸潤性成分中CD44+/ki-67-腫瘤干樣細(xì)胞呈優(yōu)勢分布，較癌灶中心明顯增多。脈管癌栓中，腫瘤細(xì)胞團(tuán)以CD44+/ki-67-腫瘤干樣細(xì)胞為主，CD44+/ki-67-腫瘤干樣細(xì)胞在結(jié)直腸癌惡性生物學(xué)行為中起重要作用。

參考文獻(xiàn)：

[1] 張登才,劉斌,張麗華,等.一種簡便實(shí)用的組織芯片制作方法[J].診斷病理學(xué)雜志,2013,20(11):722-724.

[2] 陳萬青,鄭榮壽,張思維,等.2013年中國惡性腫瘤發(fā)病和死亡分析[J].中國腫瘤,2017,26(1):1-7.

[3] Miranda E1, Bianchi P, Destro A, et al. Genetic and epigenetic alterations in primary colorectal cancers and related lymph node and liver metastases[J]. Cancer, 2013,119(2):266-276.

[4] Reya T, Morrison SJ, Clarke MF, et al. Stem cells, cancer, and cancer stem cells[J]. Nature, 2001,414(6859):105-111.

[5] Tu SM, Lin SH, Logothetis CJ. Stem-cell origin of metastasis and heterogeneity in solid tumours[J]. Lancet Oncol, 2002,3(8):508-513.

[6] Kuhlmann JD, Hein L, Kurth I, et al. Targeting cancer stem cells: Promises and challenges[J]. Anticancer Agents Med Chem, 2016,16(1):38-58.

[7] Cherciu I, Barbalan A, Pirici D, et al. Stem cells, colorectal cancer and cancer stem cell markers correlations[J]. Curr Health Sci J, 2014,40(3):153-161.

[8] Du L, Wang H, He L, et al. CD44 is of functional importance for colorectal cancer stem cells[J]. Clin Cancer Res, 2008,14(21):6751-6760.

[9] Kreso A, O′Brien CA, van Galen P, et al.Variable clonal repopulation dynamics influence chemotherapy response in colorectal cancer[J]. Science, 2013,339(6119):543-548.

[10] Yu Z, Pestell TG, Lisanti MP, et al. Cancer stem cells[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2012,44(12):2144-2151.

[11] 顏暢,胡藝冰,穆磊,等.Ki-67陰性結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和自我更新能力的研究[J].華中科技大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2015,44(2):134-137.

[12] 姚宏偉,張忠濤.結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的規(guī)范化診斷和治療[J].中華胃腸外科雜志,2017,20(7):753-757.