多重耐藥鮑曼不動桿菌耐藥基因檢測及同源性分析

劉戀，丁銀環(huán)，向成玉，吳澤才，楊葵，唐敏，劉靳波

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，四川瀘州646000)

鮑曼不動桿菌是醫(yī)院感染的重要致病菌，它能在無生命的物體表面生存，并通過受感染的物體傳播給易感人群[1，2]。此外，鮑曼不動桿菌能通過本身固有的或獲得的機(jī)制對常用抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性[3]。碳青霉烯類抗菌藥物是治療鮑曼不動桿菌感染的有效藥物[4，5]；然而，由于全球抗菌藥物耐藥性的影響，對此類抗菌藥物耐藥的鮑曼不動桿菌不斷增加。在中國，碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌的感染率從2005年的31%上升到2014年的66.7%[6]，并且多重耐藥鮑曼不動桿菌(MDR-AB)的感染率也在不斷上升。MDR-AB多重耐藥的機(jī)制十分復(fù)雜，幾乎涉及了所有的抗菌藥物耐藥機(jī)制。本文就MDR-AB的同源性及其耐藥機(jī)制進(jìn)行研究，現(xiàn)報告如下。

1　材料與方法

1.1　菌株來源

收集2015～2016年西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院各臨床科室分離的非重復(fù)MDR-AB 63株，標(biāo)本主要為各科室住院患者送檢的痰液及分泌物，按標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行分離和培養(yǎng)。

1.2　菌株對常用抗菌藥物的耐藥情況觀察

采用微量肉湯稀釋法測定亞胺培南、美羅培南、頭孢他啶、頭孢吡肟、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、阿米卡星、多黏菌素8種抗菌藥物對MDR-AB的最低抑菌濃度(MIC)。以512 μg/mL為起始濃度，倍比稀釋法制備11個濃度梯度(分別為512、256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5 μg/mL)的藥物，分別加入到滅菌96孔聚苯乙烯板的第1～11孔中，100 μL/孔，第12孔加入無藥水解酪蛋白胨(MH)肉湯作為空白對照。將生長良好的目標(biāo)菌落制備成0.5麥?zhǔn)蠞舛鹊木鷳乙海?jīng)MH肉湯1∶500稀釋后向每孔加入100 μL，加蓋后置于37 ℃普通空氣孵箱中，孵育16～20 h后判讀結(jié)果，此時第1～11孔的藥物濃度分別為256～0.25 μg/mL，無細(xì)菌生長的第1孔為最低抑菌濃度，以銅綠假單胞菌(ATCC27853)、大腸埃希菌(ATCC25922)為質(zhì)控菌株進(jìn)行同批次試驗。各藥物的藥敏折點判斷標(biāo)準(zhǔn)：以50%細(xì)菌被抑制時的MIC為MIC50，90%細(xì)菌被抑制時的MIC為MIC90。

1.3　耐藥基因TEM、AmpC、OXA-23及外排泵基因adeB、adeJ、adeG表達(dá)檢測

使用北京天根DNA提取試劑盒(離心柱型)提取63株菌株的全基因組DNA為模板，TaKaRa擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。引物序列：OXA-23上游5′-GATCGGATTGGAGAACCAGA-3′，下游5′-ATTTCTGACCGCATTTCCAT-3′；AmpC上游5′-CGGGCAATACACCAAAAGAC-3′，下游5′-CCTTAATGCGCTCTTCATTTGG-3′；TEM上游5′-AG-GAAGAGTATGATTCAACA-3′，下游5′-CTCGTCGTT-TGGTATGGC-3′；adeB上游5′-TTAACGATAGCGTTGTAACC-3′，下游5′-TGAGCAGACAATGGAATAGT-3′；adeJ上游5′-ATTGCACCACCAACCGTAAC-3′，下游5′-TAGCTGGATCAAGCCAGATA-3′；adeG上游5′-TTCATCTAGCCAAGCAGAAG-3′，下游5′-ATGTGGGCTAGCTAACGGC-3′。擴(kuò)增總體系為25 μL：ddH2O 12.875 μL、TaKaRa Taq(5 U/μL)0.125 μL、10×PCR Buffer 2.5 mL、MgCl2(25 mmol/L)1.5 mL、dNTP Mixture(各2.5 mmol/L)2 μL、模板DNA 2 μL、上下游引物(10 μmmoL/L)各1 μL。PCR擴(kuò)增條件：98 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共30個循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物采用1.5%瓊脂糖于電泳儀中110 V電泳30 min，使用TaKaRa DL2000 DNA Marker作為分子量標(biāo)準(zhǔn)，凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果并拍照保存，以電泳出現(xiàn)明亮的條帶并且該條帶與預(yù)期產(chǎn)物大小相同判斷為基因表達(dá)陽性。

1.4　菌株的同源性分析

采用腸桿菌科基因間重復(fù)序列-聚合酶鏈反應(yīng)(ERIC-PCR)法對63株菌株進(jìn)行同源性分析。引物序列：ERIC-PCR上游5′-TGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3′，下游5′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′。擴(kuò)增體系為：引物各1 μL，DNA模板2.5 μL，PCR Master Mix 12.5 μL，雙蒸水8 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min、26 ℃復(fù)性1 min、72 ℃延伸1 min，共4個循環(huán)；然后94 ℃變性30 s、40 ℃復(fù)性30 s、72 ℃延伸1 min，共40個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物在含溴化乙錠的2%瓊脂糖凝膠儀上進(jìn)行電泳，電壓90 V，時間90 min，以DL2000 DNA Marker作為分子量標(biāo)準(zhǔn)，于凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并拍照，采用Quantity One軟件進(jìn)行聚類分析，以相似性80%為同一型別判定標(biāo)準(zhǔn)。

2　結(jié)果

2.1　菌株耐藥情況

63株菌株對亞胺培南、美羅培南、頭孢他啶、頭孢吡肟、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、阿米卡星7種抗菌藥物的MIC50、MIC90均屬于耐藥水平。見表1。

2.2　主要耐藥基因檢測結(jié)果

在63株菌株中，表達(dá)TEM基因50株(79.4%)，表達(dá)AmpC基因58株(92.1%)，表達(dá)OXA-23基因62株(98.4%)，同時表達(dá)以上3種耐藥基因45株(71.4%)。攜帶外排泵基因adeB、adeJ、adeG的菌株分別為61株(96.8%)、62株(98.4%)、62株(98.4%)。

2.3　菌株的同源性分析結(jié)果

經(jīng)ERIC-PCR擴(kuò)增后的DNA片段形成的條帶4～10條，63株菌株經(jīng)基因分型共分為5個型別，分別命名為A～E型，其中A型58株(占92.1%)，B型2株，C、D、E型各1株。

表1　63株多重耐藥鮑曼不動桿菌藥敏結(jié)果

3　討論

鮑曼不動桿菌是條件致病菌，容易導(dǎo)致患有嚴(yán)重基礎(chǔ)疾病、年老及抵抗力弱的患者發(fā)生感染。CHINET中國細(xì)菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)監(jiān)測結(jié)果顯示，從2010年到2014年，鮑曼不動桿菌的檢出率已超越銅綠假單胞菌，成為排名第3的醫(yī)院感染致病菌[6]，MDR-AB的檢出率居高不下[7]。本研究中，63株MDR-AB僅對多黏菌素敏感，對亞胺培南、美羅培南、頭孢他啶、頭孢吡肟、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、阿米卡星的MIC50均屬耐藥水平，MIC90也遠(yuǎn)超耐藥折點，耐藥現(xiàn)象非常嚴(yán)重。MDR-AB的耐藥機(jī)制十分復(fù)雜，包括產(chǎn)生各種β-內(nèi)酰胺酶、外膜通透性下降、藥物作用靶位改變、外排泵的過度表達(dá)及產(chǎn)生生物被膜等[8]。

細(xì)菌產(chǎn)生的β-內(nèi)酰胺酶主要分為4類，A類主要是指廣譜β-內(nèi)酰胺酶，包含TEM、SHV、KPC等；B類為金屬β-內(nèi)酰胺酶,包含IMP、VIM和SIM；C類即AmpC酶；D類為苯唑西林酶，又稱OXA碳青霉烯酶，其中OXA-23為我國最常見的苯唑西林酶。各類β-內(nèi)酰胺酶的共同作用可以介導(dǎo)鮑曼不動桿菌對青霉素、碳青霉烯類、單環(huán)酰胺類及頭孢菌素抗菌藥物產(chǎn)生耐藥[8]。本研究分析了63株MDR-AB中β-內(nèi)酰胺酶的攜帶情況，結(jié)果顯示，OXA-23基因的陽性率最高，為98.2%，與文獻(xiàn)[9]報道一致；TEM基因檢出率為79.4%；AmpC基因檢出率為92.1%；同時攜帶以上3種耐藥基因的菌株占71.4%。本研究中，63株MDR-AB對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥率高達(dá)100%，對頭孢類等抗菌藥物的耐藥率>92.0%，說明產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶是導(dǎo)致MDR-AB多重耐藥的原因之一。

外排泵的過表達(dá)是細(xì)菌對抗菌藥物耐藥的一個重要途徑，在能量的參與下可將細(xì)菌體內(nèi)的藥物或代謝產(chǎn)物泵出體外，最終導(dǎo)致細(xì)菌出現(xiàn)耐藥?；蚪M學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，外排泵系統(tǒng)廣泛存在于鮑曼不動桿菌中。在5類外排泵超家族中，與鮑曼不動桿菌耐藥相關(guān)的主要是耐藥結(jié)節(jié)分化(RND)超家族中的外排泵，由膜轉(zhuǎn)運蛋白、膜融合蛋白、膜通道蛋白3部分組成，RND超家族包括adeABC、adeIJK、adeFGH系統(tǒng)，它們的過度表達(dá)可導(dǎo)致氨基糖苷類、喹諾酮類、頭孢菌素類、四環(huán)素等抗菌藥物產(chǎn)生耐藥。adeABC于2001年發(fā)現(xiàn)，是第一個報道的RND外排泵系統(tǒng)[10],隨后于2008年和2010年分別發(fā)現(xiàn)adeIJK和adeFGH系統(tǒng)。adeB為adeABC外排系統(tǒng)的膜轉(zhuǎn)運體蛋白，其編碼基因adeB是介導(dǎo)adeABC外排系統(tǒng)產(chǎn)生耐藥的主要因素。adeJ是adeIJK外排系統(tǒng)中的外排蛋白，adeIJK的過度表達(dá)可導(dǎo)致鮑曼不動桿菌對β-內(nèi)酞胺類、碳青霉烯酶類、氟喹諾酮類、氯霉素、四環(huán)素等抗菌藥物產(chǎn)生耐藥。adeG是典型的RND蛋白。Coyne等[11]研究發(fā)現(xiàn)，adeFGH外排系統(tǒng)為鮑曼不動桿菌所固有，但部分細(xì)菌中不存在adeFGH，過度表達(dá)的adeFGH可介導(dǎo)菌株對磺胺類、氟喹諾酮類及克林霉素等高水平耐藥。本研究對MDR-AB進(jìn)行RND外排泵結(jié)構(gòu)基因adeB、adeG、adeJ檢測，結(jié)果表明，3種外排泵基因廣泛存在于MDR-AB中，adeB、adeG、adeJ的檢出率分別為96.8%、98.4%、98.4%；同時檢出3種泵基因的菌株占98.4%；有1株MDR-AB 3種基因均未檢出，并且其β-內(nèi)酰胺酶檢測也均為陰性，表明存在RND超家族外的其他外排泵發(fā)揮作用。

基因分型在醫(yī)院感染的爆發(fā)流行中起重要作用。ERIC-PCR屬于基因分型技術(shù)的一種，其與脈沖場凝膠電泳技術(shù)結(jié)果一致性高[12，13]，并且具有簡便、快捷、重復(fù)性好、穩(wěn)定性高等特點，適用于臨床細(xì)菌的分型檢測。ERIC-PCR是根據(jù)腸桿菌科細(xì)菌中高度保守的反向重復(fù)序列設(shè)計引物，通過PCR擴(kuò)增產(chǎn)生不同的DNA片段，并通過瓊脂糖電泳分析條帶進(jìn)行基因分型，可以認(rèn)為ERIC-PCR是一種半隨機(jī)擴(kuò)增PCR[14]。本研究通過ERIC-PCR對63株MDR-AB進(jìn)行基因分型，結(jié)果顯示，63株菌株可分為A、B、C、D、E 5型，其中A型占92.1%，B、C、D、E型均為散在菌株。說明本研究中臨床分離的MDR-AB大部分為同一菌株克隆進(jìn)化而來，提示MDR-AB存在小型暴發(fā)流行的可能。

綜上所述，β-內(nèi)酰胺酶及主動外排系統(tǒng)在MDR-AB中分布廣、存在率高，醫(yī)院科室之間的克隆播散及臨床科室對抗菌藥物的不合理使用可能導(dǎo)致鮑曼不動桿菌出現(xiàn)多重耐藥。因此臨床需合理使用抗菌藥物，加強(qiáng)對已有抗菌藥物的改進(jìn)及新型抗菌藥物的研發(fā)迫在眉睫。

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