miR-200b和miR-200c在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)及其臨床病理學(xué)意義

竇維佳,王景杰,劉震雄

(中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)(第四軍醫(yī)大學(xué))唐都醫(yī)院消化內(nèi)科,西安　710038;#共同第一作者;*通訊作者,E-mail:liuzhx816@126.com)

1　材料與方法

1.1　材料

收集2012-06～2014-06經(jīng)空軍軍醫(yī)大學(xué)(第四軍醫(yī)大學(xué))唐都醫(yī)院手術(shù)切除的結(jié)腸癌64例,同時(shí)在距癌組織邊緣>5 cm處的正常組織取標(biāo)本作為癌旁組織,所有癌組織標(biāo)本均經(jīng)病理確診,癌旁組織確認(rèn)為無癌細(xì)胞及明顯炎癥細(xì)胞浸潤。患者共64例,其中男性40例,女性24例,年齡31-76歲,中位年齡57.9歲。所取標(biāo)本經(jīng)過液氮速凍后保存在-80 ℃冰箱中用于提取總RNA。所有患者術(shù)前均未接受化療、放療或生物治療等相關(guān)治療措施。

1.2　方法

1.2.1RNA的提取取100 mg組織放入液氮預(yù)冷的研缽中,將組織塊迅速研磨成粉末,置1.5 ml離心管中,加入1 ml Trizol充分勻漿,室溫靜置5 min;加入0.2 ml氯仿,振蕩15 s,靜置2 min;4 ℃離心,12 000g×15 min,取上清;加入0.5 ml異丙醇,將管中液體輕輕混勻,室溫靜置10 min;4℃離心,12 000g×10 min,棄上清;加入1 ml 75%乙醇,輕輕洗滌沉淀。4 ℃,7 500g×5 min,棄上清;晾干,加入適量的DEPC H2O溶解(65 ℃促溶10-15 min);用260 nm波長分光測定RNA濃度,OD值為1相當(dāng)于大約40 μg/ml的單鏈RNA。用1 cm光徑,用ddH2O稀釋DNA樣品50倍并以ddH2O為空白對照,根據(jù)此時(shí)讀出的OD260值即可計(jì)算出樣品稀釋前的濃度:RNA(mg/ml)=40×OD260讀數(shù)×稀釋倍數(shù)(50)/1 000。

1.2.2qRT-PCR應(yīng)用PrimeScript RT reagent Kit試劑盒將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s。以cDNA為模板應(yīng)用SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增,變性:95 ℃ 5 min,循環(huán):95 ℃ 10 s,58 ℃ 10 s,72 ℃ 10 s(共45個(gè)循環(huán)),溶解曲線分析:95 ℃ 5 s,50 ℃ 1 min,97 ℃(1個(gè)循環(huán)),冷卻:40 ℃ 30 s。以U6作為內(nèi)參,所有引物購自RiBoBio公司。miR-200b引物序列:5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATCGGCACTG CATACGACAAAATATGGAAC-3′(RT引物),5′-TGCGGGTGCTCCGCTCCGCAGC-3′(qRT-PCR正義引物),5′-CAGTGCACGCTCCGA-3′(qRT-PCR反義引物);miR-200c引物序列:5′-GTCGTCCAGTGCAGGGTCCGAGGTAGTTCGCACTGCATACGACGCG GAAC-3′(RT引物),5′-TGCGGTTCACAGTGGCTAAG-3′(qRT-PCR正義引物),5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′(qRT-PCR反義引物);U6引物序列:5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′(RT引物),5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′(qRT-PCR正義引物),5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′(qRT-PCR反義引物),采用2-ΔΔCt分析miRNA的相對表達(dá)水平。每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件對結(jié)果進(jìn)行分析。獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析結(jié)腸癌及癌旁組織中miR-200b、miR-200c的表達(dá)差異。以平均表達(dá)值作為截點(diǎn)將結(jié)腸癌組織中miR-200b和miR-200c的表達(dá)分為低表達(dá)組和高表達(dá)組,用卡方檢驗(yàn)分別分析miR-200b、miR-200c表達(dá)與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系。Pearson相關(guān)系數(shù)檢測結(jié)腸癌組織中miR-200b及miR-200c表達(dá)的相關(guān)性。所有檢驗(yàn)均為雙側(cè),P<0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1　miR-200b及miR-200c在結(jié)腸癌與癌旁組織中的表達(dá)

應(yīng)用qRT-PCR對64例結(jié)腸癌及癌旁組織中miR-200b及miR-200c表達(dá)分別進(jìn)行檢測,結(jié)果表明與正常組織相比,miR-200b在結(jié)腸癌中表達(dá)明顯降低,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖1)。同樣,miR-200c在結(jié)腸癌中的表達(dá)較正常組織亦顯著降低(P<0.05,見圖1)。

與癌旁組織比較,*P<0.05圖1　結(jié)腸癌與癌旁組織中miR-200b和miR-200c的表達(dá)Figure 1　Expression of miR-200b and miR-200c in colon cancer and matched adjacent non-tumor tissues

2.2　miR-200b及miR-200c在結(jié)腸癌中的表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系

分別以miR-200b及miR-200c的平均表達(dá)值作為截點(diǎn)將病例分為高表達(dá)組和低表達(dá)組得到計(jì)量資料。miR-200b和miR-200c在結(jié)腸癌中呈低表達(dá),卡方檢驗(yàn)顯示miR-200b和miR-200c在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)顯著低于癌旁組織(P<0.05,見表1)。另外,miR-200b及miR-200c的表達(dá)與腫瘤的病理分化程度、TNM分期及淋巴轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(P<0.05,見表2),而與患者的年齡、性別無顯著相關(guān)性(P>0.05,見表2)。

表1miR-200b及miR-200c在結(jié)腸癌和癌旁組織中的表達(dá)

Table1ExpressionofmiR-200bandmiR-200cincoloncancerandnon-tumoradjacenttissues

組織nmiR?200bmiR?200c低表達(dá)高表達(dá)χ2P低表達(dá)高表達(dá)χ2P結(jié)腸癌組織64432190780003392562240013癌旁組織　6426382440

表2miR-200b及miR-200c的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

Table2RelationshipsbetweenexpressionofmiR-200bandmiR-200candclinicopathologicalfeaturesincoloncancer

臨床特征nmiR?200bmiR?200c低表達(dá)高表達(dá)χ2P低表達(dá)高表達(dá)χ2P　年齡2278013124110121　　<60歲2816121513　　≥60歲362792412　性別0045083222150137　　男4025152218　　女24186177　分化程度6493001195400002　　高中分化3015151317　　低分化34286268　TNM分期6977000867000010　?、?Ⅱ2311121013　　Ⅲ-Ⅳ413292912　淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移104380001114620001　　否4021191921　　是24222204

2.3　miR-200b及miR-200c在結(jié)腸癌中表達(dá)的相關(guān)性

應(yīng)用Pearson相關(guān)系數(shù)對結(jié)腸癌組織中miR-200b及miR-200c表達(dá)水平進(jìn)行相關(guān)性分析,結(jié)果顯示兩者呈顯著正相關(guān)(r=0.531,P<0.05,見圖2)。

為讓易地搬遷對象“搬得出，穩(wěn)得住，有事做，能致富”，爭取到2018年所有搬遷對象全面脫貧，湖南省汝城縣三措并舉，不斷強(qiáng)化監(jiān)管力度，確保了全縣易地扶貧搬遷工作的順利推進(jìn)。截至10月31日，全縣所有集中安置點(diǎn)的搬遷對象均已分房到戶。

圖2　miR-200b及miR-200c在結(jié)腸癌中表達(dá)的相關(guān)性Figure 2　Correlation between miR-200b and miR-200c expression in colon cancer tissues

3　討論

結(jié)腸癌是常見的消化道腫瘤。近年來,隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和生活水平的提高,結(jié)腸癌的發(fā)病率及死亡率逐年升高,嚴(yán)重危害國民的健康及生命。因此,闡明結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制,找到有效的治療靶點(diǎn)顯得至關(guān)重要,但是結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。

MicroRNAs(miRNAs)是一類能在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮調(diào)控基因表達(dá)的非編碼小RNA。大量研究證實(shí)miRNAs在結(jié)腸癌中發(fā)揮癌基因或抑癌基因功能。miR-200b及miR-200c屬于miR-200家族,其中包含miR-200a,miR-200b,miR-200c,miR-141以及miR-429等5個(gè)成員。研究表明miR-200家族成員在腫瘤增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等行為中均發(fā)揮重要的調(diào)控作用,且在腫瘤細(xì)胞、組織及血漿樣本中存在差異表達(dá)。miR-200b通過抑制FN1的表達(dá),阻礙耐藥乳腺癌細(xì)胞EMT過程,發(fā)揮抑癌作用[6]。在垂體細(xì)胞瘤中,miR-200b下調(diào)PKCα表達(dá)抑制腫瘤增殖侵襲[7]。miR-200c可通過下調(diào)Foxf2表達(dá)從而抑制乳腺癌的轉(zhuǎn)移[8]。另外還有研究發(fā)現(xiàn)miR-200c可作為判斷非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)預(yù)后的指標(biāo)[9]。Tang等[5]同時(shí)研究miR-200b及miR-200c在胃癌中的表達(dá),發(fā)現(xiàn)兩者在胃癌組織中均呈低表達(dá),且與患者預(yù)后顯著相關(guān),過表達(dá)miR-200b及miR-200c可抑制胃癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為。雖然miR-200b或miR-200c單獨(dú)與腫瘤關(guān)系的相關(guān)報(bào)道有不少[10-15],但兩者與結(jié)腸癌關(guān)系并不十分清楚。

我們通過對64例結(jié)腸癌患者的癌及癌旁組織進(jìn)行qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn),miR-200b及miR-200c在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)均顯著低于癌旁組織。進(jìn)一步分析兩者與結(jié)腸癌臨床病理學(xué)資料的相關(guān)性,發(fā)現(xiàn)miR-200b及miR-200c表達(dá)與腫瘤分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均相關(guān),即分化程度越低、TNM分期越高、存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時(shí),miR-200b及miR-200c表達(dá)越低,且兩者表達(dá)呈明顯正相關(guān),提示miR-200b及miR-200c均在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮抑癌基因的作用,可能為結(jié)腸癌的診治提供新的潛在靶點(diǎn),但具體的分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入研究。

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