煙草H2A的序列分析、原核表達載體構建及誘導表達

童文艷，徐林娜，喬慧聰，李 芬

(河南師范大學生命科學學院，河南新鄉(xiāng) 453007)

煙草H2A序列來自于以 NtTkr尾部為誘餌進行的酵母雙雜交篩選，NtTkr與新發(fā)現(xiàn)的煙草驅動蛋白家族成員12(kinesin-12 subfamily)NtKrp序列一致，在分裂旺盛的組織和發(fā)育各時期胚中表達，可調控細胞周期進程，進而影響胚、種子大小與萌發(fā)[1]。NtTkr有3個卷曲螺旋結構，尾部卷曲螺旋中 1 084 位的 T 缺失或突變會影響其分布，而這一改變是受與其結合的蛋白底物的影響。已知驅動蛋白是一類蛋白質超家族，屬于分子馬達的一種，其“頭部”具有ATP酶活性，能通過水解ATP獲得能量，在細胞內執(zhí)行著多種功能[2]，如細胞內細胞器及大分子沿微管的定向輸運、核融合、細胞分裂過程中染色體的移動、紡綞體的形成、神經元的發(fā)育以及發(fā)育過程中成形素的分布等均與驅動蛋白家族密切相關[3-4]。已知與細胞運動直接相關的馬達蛋白有3種：驅動蛋白、肌球蛋白、動力蛋白，它們既負責真核細胞的運動，也參與胞內物質的定向運輸、細胞分裂、形態(tài)建成等重要生物學過程，而這些功能都與其卷曲螺旋結構有直接的關系。

NtTkr共有3個卷曲螺旋結構，其中卷曲螺旋CC1和CC2形成莖桿結構，尾部的CC3(1 049～1 143Aa)可能參與靶蛋白的相互作用。因為酵母雙雜交分析發(fā)現(xiàn)缺失和替換1 084位T在酵母細胞中可影響NtTkr與候選蛋白的結合強度。

為進一步檢測 NtTkr全長、尾部、T1084替換或缺失的尾部與候選蛋白之間的相互作用，筆者對H2A進行了序列分析及蛋白結構域分析，并將其克隆入pGEX4T-1 原核表達載體進行誘導表達，為運用Pull Down 驗證其相互作用進而確定NtTkr與底物互作的關鍵結構域奠定基礎。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株與質粒。以NtKkr 尾部為誘餌雙雜交獲得的陽性克隆F35-1，大腸桿菌DH5α和BL21；PGEX-4T-1質粒。

1.1.2工具酶與主要試劑。BamH I、XhoI 限制性內切酶和KOD-plus高保真酶，X-gal，IPTG，回收試劑盒，T4DNA 連接酶，RnaseA，dNTP 等均購自ToYoBo公司。

1.2方法

1.2.1信息查詢。在美國國立生物信息中心數(shù)據庫(http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/)中，尋找與F35-1插入序列最為接近的核苷酸序列。

1.2.2同源性比較。運用Bioedit軟件將F35-1插入序列與擬南芥H2A的Aa進行同源性比較。

1.2.3蛋白功能結構域分析。利用EMBL的SMART軟件(http://smart.embl-heidelberg.de/)進行蛋白功能結構域分析。

1.2.4PCR片段的獲得。擴增引物由 TaKaRa 生物工程公司合成，合成產物經PAGE純化，其序列如下：5’端引物為p1:5’-NNNNggATCCTCAACAACAGCAACCAAA-3’;3’端引物為 p2:5’- NNNNCTCgAgCTGAGAAATAGAGGCAA-3’。引物兩端分別加上BamH I 和XhoI 共2個酶切位點；以pGADT-Rec-F35-1質粒為模板，PCR 擴增獲得目的片段。

1.2.5表達質粒pGEX-4T-H2A的構建和鑒定。將pGEX-4T-1和PCR產物經BamH I和XhoI酶切、凝膠回收4 969 bp的pGEX-4T-1載體和414 bp 的目的片段，在T4DNA連接酶作用下16 ℃連接16 h，連接產物轉化大腸桿菌DH5α超感細胞，經酶切鑒定篩選正確的重組質粒 pGEX-4T-H2A，送北京三博遠志生物技術有限責任公司測序。

1.2.6目的蛋白的誘導表達及SDS-PAGE檢測。將測序無突變的重組質粒轉化入 BL21(DE3)感受態(tài)細胞，在50 mg/mL氨芐青霉素LB平板上挑取單克隆，37 ℃、180 r/min 過夜培養(yǎng)，次日1∶100稀釋菌液，培養(yǎng)4 h左右至OD600=0.8時，分別經0.10、0.08、0.06、0.04、0.02 mmol/L的IPTG 于37 ℃誘導 4 h 后, 取菌液2 mL，1 000 r/min、4 ℃離心1 min，棄上清，菌體中加入還原型2×SDS上樣緩沖液和去離子水各100 μL，混勻后煮沸 10 min，取15 μL 樣品進行SDS-PAGE分析。

2　結果與分析

2.1H2A序列分析將以 NtKrp 尾部為誘餌進行酵母雙雜交篩選得到的陽性克隆 F35-1 測序，發(fā)現(xiàn)其插入片段大小為610 bp，經ORF finder 序列分析同時結合真核基因的特點可以確定該序列含有1個長度為426 bp 的編碼框，編碼142個Aa 和1個終止密碼子。其序列如圖1所示。

通過Blast發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)35-1的核苷酸和氨基酸序列均與擬南芥的組蛋白H2A有很高的一致性，該基因的CDS全長為426 bp，編碼142個氨基酸。二者的同源性比較見圖2，其氨基酸的一致性為74%，相似性為88%。蛋白結構域分析表明，該蛋白含H2A結構域，參與組蛋白核心八聚體的組成，對應核苷酸序列為煙草H2A的編碼基因。

圖1　H2A序列Fig.1　H2A sequence

注：F35-1為陽性克隆基因； NP_172363.1為擬南芥組蛋白H2A基因；灰色為相似性；黑色為相同性Note：F35-1 was positive clone gene; NP_172363.1 was Arabidopsis histone H2A gene;Gray was similarity;Black was homogeny圖2　F35-1與擬南芥組蛋白H2A基因的氨基酸序列分析Fig.2　Amino acid sequence analysis of F35-1 and Arabidopsis histone H2A gene

2.2煙草H2A全長的克隆、酶切與電泳回收以質粒pGADT-Rec-F35-1為模板進行PCR擴增，經過1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定(圖3)，得到414 bp的擴增帶，與預期大小相符。運用引入引物兩端的PCR產物，經BamH Ⅰ和XhoⅠ雙酶切，電泳回收得到用于連接的H2A-414片段。

2.3原核表達載體的構建與鑒定BamH Ⅰ和XhoⅠ雙酶切的pGEX-4T-1凝膠回收4 969 bp 載體片段，將其與“2.2”同樣雙酶切的H2A-414片段進行連接反應，連接產物轉化DH5α感受態(tài)細胞，BamH Ⅰ和XhoⅠ雙酶切鑒定重組質粒，得到4 969 bp的載體片段和414 pb的H2A全長(圖4)，測序無突變，表明得到正確的原核表達載體pGEX-4T-H2A。

2.4H2A的誘導表達重組質粒pGEX-4T-H2A轉化到大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)，轉化子經0.10、 0.08、0.06、0.04、0.02 mmol/L的IPTG誘導培養(yǎng)4 h后收集菌體，煮沸后經12% SDS-PAGE檢測蛋白的表達。結果表明大于0.06 mmol/L IPTG濃度誘導后表達的蛋白量幾乎相當，都可高效表達約38 kD的煙草H2A蛋白(圖5)。

注：1 .λ-Eco T14 Marker；2.PCR產物Note：1.λ-Eco T14 Marker；2.PCR products圖3　煙草H2A-414 PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳Fig.3　Agarose gel electrophoresis of tobacco H2A-414 PCR products

注：A.pGEX-4T-H2A的酶切鑒定(1.DL5000 Marker;2.pGEX-4T-H2A重組子BamH I和Xho I雙酶切后得到的4 969 bp的載體片段和414 bp的H2A全長)；B.pGEX-4T-H2A圖譜，示414 pb的H2A全長插入pGEX-4T-1的酶切位點Note：A.Enzyme digestion identification of pGEX-4T-H2A(1 .DL5000 Marker ;2. 4 969 bp vector got by double enzyme digestion and 414 bp H2A overall length )；B. pGEX-4T-H2A atlas,enzyme digestion site of 414 bp H2A overall length inserted with pGEX-4T-1圖4　pGEX-4T-H2A重組子的酶切鑒定Fig.4　Enzyme digestion identification of pGEX-4T-H2A recombinant

注：1.蛋白分子量Marker：PageRuler Unstained Protein Lader；2.空載的表達； 3.IPTG誘導前H2A的表達；4～8.0.10、0.08、0.06、0.04、0.02 mmol/L IPTG誘導后H2A的蛋白表達Note：1.Protein marker：PageRuler Unstained Protein Lader;2.No-load expression;3.H2A expression before IPTG induction;4-8.H2A protein expression after induction with 0.10、0.08、0.06、0.04、0.02 mmol/L IPTG圖5　煙草H2A的誘導表達Fig.5　Induction expression of tobacco H2A

3　結論與討論

已知的植物Kinesin多在不同組織中廣泛表達[1-2,5]，煙草新KinesinNtTkr卻在幼葉和各發(fā)育時期的胚等分裂旺盛部位優(yōu)勢表達[1,6-7]。這種組織特異性表達模式提示它可能在胚胎發(fā)生及葉組織分化過程中具有獨特的作用。對于揭示未知蛋白的功能，篩選與之相互作用的蛋白質非常重要，因為生物體中幾乎所有生物過程，如 DNA復制、基因轉錄、蛋白合成及信號轉導等，都離不開蛋白質之間的相互作用。通過對煙草幼葉 cDNA 文庫的酵母雙雜交篩選，得到了多個能與 NtTkr 互作的候選蛋白質。由于酵母雙雜交具有局限性，不可避免地會存在假陽性[8-10]，要確定候選蛋白是否真的能夠與目的蛋白發(fā)生作用，必須通過 Pull Down 及 CoIP 或免疫共定位來進一步驗證[4,11-12]。故筆者以pGADT-Rec-F35-1質粒為模板，PCR 擴增煙草H2A全長，并將其克隆入原核表達載體pGEX4T-1，轉入 BL21(DE3)，誘導其成功表達，為 Pull Down 驗證該蛋白與候選蛋白之間的相互作用奠定了基礎。

重組原核表達載體pGEX-4T-H2A構建成功后，轉化大腸桿菌BL21超級感受態(tài)，IPTG誘導其表達。因目的蛋白的可溶性、穩(wěn)定性和表達量因蛋白而異，故必須依據實際情況調整誘導表達條件。要使蛋白達到較高表達量，除培養(yǎng)時間和溫度外，合適的IPTG工作濃度也極為重要。因此，筆者在相同溫度和時間條件下，設置5個IPTG濃度，蛋白電泳檢測結果顯示，IPTG濃度為0.06 mmol/L時表達量較高，繼續(xù)增大濃度時與0.06 mmol/L誘導差別不大，表明IPTG工作最適濃度為0.06 mmol/L。

最近有報道表明NtKrp通過與核糖體蛋白NtRPL17相互作用，影響細胞周期進程進而調節(jié)胚胎/種子大小和幼根生長[13]。如能證實NtKrp與組蛋白H2A的相互作用可進一步揭示NtKrp影響細胞分裂的機制。筆者構建了煙草H2A基因全長和pGEX4T-1載體大片段連接的融合表達載體并成功地誘導其表達，為深入研究NtTkr與候選蛋白質之間的體外互作及該蛋白的其他生物學功能奠定了試驗基礎。

[1] TIAN S J,WU J J,LI F,et al.NtKRP, a kinesin-12 protein, regulates embryo/seed size and seed germination via involving in cell cycle progression at the G2/M transition[J].Scientific reports,2016,6:35641.

[2] SABLIN E P,KULL F J,COOKE R,et al.Crystal structure of the motor domain of the kinesin-related motor ncd[J].Nature,1996,380(6574):555-559.

[3] ASBURY C L,FEHR A N,BLOCK S M.Kinesin moves by an asymmetric hand-over-hand mechanism[J].Science,2003,302(5653):2130-2134.

[4] SINGH R,LEE M O,LEE J E,et al.Rice mitogen-activated protein kinase interactome analysis using the yeast two-hybrid system[J].Plant Physiol,2012,60(1):477-487.

[5] YILDIZ A,TOMISHIGE M,VALE R D,et al.Kinesin walks hand-over-hand[J].Science,2004,303(5658):676-678.

[6] 李芬,吳秀麗,郭君麗.新基因NtTKR及其同源物LeTKR的生物信息學分析[J].河南師范大學學報(自然科學版),2014,42(5):110-115.

[7] 李芬,任向波,騰飛,等.煙草新驅動蛋白NtTKR過表達對酵母生長的影響[J].河南師范大學學報(自然科學版),2014, 42(6):97-102.

[8] FIELDS S,SONG O.A novel genetic system to detect protein-protein interactions[J].Nature,1998, 340(6230):245-246.

[9] BENDIXEN C,CANGLOFF S,ROTHSTEIN R.A yeast mating-selection scheme for detection of protein-protein interactions[J].Nucleic Acid Res,1994,22(9):1778-1779.

[10] HUBSMAN M,YUDKOVSKY G,ARONHEIM A.A novel approach for the identification of protein-protein interaction with integral membrane proteins[J].Nucleic acids research,2001, 29(4):1-6.

[11] KHAZAK V,GOLEMIS E A,WEBER L.Development of a yeast two-hybrid screen selection of human Ras-Raf protein interaction inhibitors[J].Methods Mol Biol,2005,310:253-271.

[12] ZHENG Y,TAN X Y,PYCZEK J,et al.Generation and characterization of yeast two-hybrid cDNA libraries derived from two distinct mouse pluripotent cell types[J].Mol Biotechnol,2013, 54(2):228-237.

[13] TIAN S J,WU J J,LIU Y,et al.Ribosomal protein NtRPL17 interacts with kinesin-12 family protein NtKRP and functions in the regulation of embryo/seed size and radicle growth[J].J Exp Bot,2017,68(20):5553-5564.