2例太歲樣品分離菌的初步研究

佟嘉輝，熊向華，汪建華，徐威，張惟材

1.沈陽藥科大學(xué)，遼寧 沈陽 110016；2.軍事醫(yī)學(xué)研究院 生物工程研究所，北京 100071

太歲也稱肉芝。明代李時珍著《本草綱目》[1]中對其描述為：“肉芝狀如肉，附于大石，頭尾具有，乃生物也。赤者如珊瑚、白者如截肪、黑者如澤漆、青者如翠羽、黃者如紫金，皆光明洞徹如堅(jiān)冰也?！碧珰q樣品多發(fā)現(xiàn)于土層中[2]，形如肉體，體型較大，表面光滑濕潤，顏色多樣，至今生物學(xué)界對其歸類仍未給出明確答案。鄭科研等[3]通過研究太歲樣本的化學(xué)組成，推測其主體為聚乙烯醇，同時含有少量多糖及各種雜菌；朱春玉[4]等則測定了太歲中核酸、多糖、蛋白質(zhì)等各生物體組成要素含量；西北大學(xué)戴璐[5]在對太歲樣本的衍生體進(jìn)行菌分離時共分離得到2種黏菌和18種真菌；王欣[6]從上述同一樣本中分離得到35種細(xì)菌和1種黏細(xì)菌，其優(yōu)勢菌群屬β-變性菌綱伯克霍爾德菌目（Burkholderiales）；林澗等[7]從2例太歲樣品中分離得到假絲酵母（Candida）和黏質(zhì)紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa）。本實(shí)驗(yàn)室收集了10余例來自不同地區(qū)的太歲樣本，著重對其中2例樣本的分離菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定及分析，以期獲得對太歲樣品的生物學(xué)本質(zhì)及其組成的初步認(rèn)識。

1 材料與方法

1.1 材料

黃色太歲（編號YF142）、白色太歲（編號ZWG0525）樣品由本實(shí)驗(yàn)室保存；大腸桿菌DH5α感受態(tài)、三氟乙酸（TFA）、7種單糖標(biāo)準(zhǔn)品［葡萄糖（Glc）、甘露糖（Man）、半乳糖（Gal）、鼠李糖（Rha）、阿拉伯糖（Ara）、葡萄糖醛酸（GlcUA）、半乳糖醛酸（GalUA）］、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自天根生化科技有限公司；pMD18T載體購自寶生物工程（大連）有限公司；DNA markers、HifiTaqDNA聚合酶購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）購自生工生物公司；甲醇、磷酸、葡萄糖等試劑購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；引物合成及測序由北京六合華大基因科技股份有限公司完成。

Olympus BX-51顯微鏡（WH 10×/22，100×/ 1.35 oil Iris）；Waters 600高效液相色譜儀；Wa?ters Xbridge-C18（4.6 mm×150 mm）色譜柱。

1.2 太歲樣品預(yù)處理

太歲樣品表面消毒[8]。于超凈臺中切取塊狀太歲樣品，用75%酒精浸潤12 min后用無菌水反復(fù)沖洗振蕩若干次，回收最后一次沖洗液，取適量涂布于培養(yǎng)基平板上，30℃恒溫培養(yǎng)以檢測消毒效果。

1.3 太歲樣品的菌分離及其分子生物學(xué)鑒定

1.3.1 太歲樣品分離菌的獲取 采用林澗等[7]所述菌株分離法獲取分離菌株，涂布于真菌培養(yǎng)基平板上（包括無抗及卡那霉素抗性YPD培養(yǎng)基、無抗及卡那霉素抗性麥芽汁培養(yǎng)基、虎紅培養(yǎng)基及沙氏培養(yǎng)基），30℃恒溫倒置培養(yǎng)3 d，挑取單菌落平板劃線培養(yǎng)。

1.3.2 太歲樣品分離菌16S rDNA、18S rDNA、ITS、NS序列測定 50 μL反應(yīng)體系[7]，以1 μL提取的太歲樣品總DNA為模板。16S rDNA PCR擴(kuò)增條件：95℃ 10 min；95℃ 30 s，50℃退火30 s，72℃延伸90 s，循環(huán)30次；72℃ 10 min；ITS和18S rDNA擴(kuò)增條件：95℃ 10 min；95℃ 30 s，55℃退火30 s，72℃延伸 90 s，循環(huán)30次；72℃10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，用膠回收試劑盒切膠回收目的基因后，一部分直接進(jìn)行測序，一部分連接pMD18T載體，選取陽性克隆后進(jìn)行測序。將基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast比對，確定分離菌株的分類位置。

1.4 太歲樣品分離菌多糖組成分析

1.4.1 鞘氨醇單胞菌屬發(fā)酵多糖分離 YPD培養(yǎng)基于30℃發(fā)酵培養(yǎng)72 h后，沸水浴溶解發(fā)酵液，12 000 r/min離心10 min提取上清液，加入2倍量的95%乙醇，4℃過夜醇沉，12 000 r/min離心10 min得到分泌的胞外多糖。

1.4.2 多糖樣品水解 取1 mL提取的多糖樣品置于具塞試管中，加入2 mol/L TFA 2 mL，渦旋混勻，110℃水解8 h，取出冷卻至室溫，12 000 r/ min離心5 min，取上清，用0.2 mol/L NaOH溶液調(diào)pH值至7，將水解液定容至10 mL。

1.4.3 衍生化 準(zhǔn)確稱取上述7種單糖標(biāo)準(zhǔn)品，配制100 μg/mL單糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液及混糖溶液（葡萄糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖終濃度為50 μg /mL，葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、鼠李糖終濃度為5 μg/mL的溶液）；取各單糖標(biāo)準(zhǔn)液、混合糖標(biāo)準(zhǔn)液和樣品溶液100 μL置于不同試管中，依次加入50 μL 0.5 mol/L PMP甲醇溶液和50 μL 0.2mol/L NaOH溶液，渦旋混勻，70℃水浴反應(yīng)40 min，冷卻至室溫，加入100 μL 0.3 mol/L HCl溶液中和，用400 μL氯仿萃取，渦旋4 min混勻，4500 r/min離心5 min，取上層水相，重復(fù)3次，上層水相經(jīng)濾器過濾混勻，待用，20 μL進(jìn)樣分析。1.4.4 HPLC分析條件 Waters Xbridge-C18柱，標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)樣量20 μL，樣品進(jìn)樣量50 μL，柱溫25℃，檢測波長250 nm。流動相A為15%乙腈磷酸鹽緩沖液（50 mmol/L，pH6.9），流動相B為40%乙腈磷酸鹽緩沖液（50 mmol/L，pH6.9）；梯度模式設(shè)置：時間為0→10→30→40 min時，相應(yīng)濃度梯度為0%→10%→30%→0%流動相B。

表1 擴(kuò)增引物及序列

2 結(jié)果

2.1 太歲樣品的形態(tài)學(xué)觀察

編號YF142的黃色太歲樣品外觀為黃褐色肉質(zhì)，有彈性，有條紋帶，內(nèi)部成束狀并伴有少量白色硬結(jié)，表面光滑濕潤；編號ZWG0525的白色太歲樣品體型較大，外觀為白色，有彈性，表面光滑濕潤，有類似蕈菌類的傘蓋和薄膜，切割時有韌性。見圖1。

2.2 對太歲樣品中分離得到的4株共性菌的初步研究

對2例太歲樣品進(jìn)行菌株分離，通過培養(yǎng)觀察及Blast比對，結(jié)果表明2例太歲樣品中均含有以下4種原核菌株：TS-1號菌株為熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens），TS-2號菌株為地中海短波單胞菌（Brevundimonas mediterranea）（其16S rDNA部分序列上傳至GenBank，序列號為MF 668251，長度為1331 bp），TS-3號菌株為紅串紅球菌（Rhodococcus erythropolis），TS-4號為鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonassp.）菌株。見圖2、表2。

圖1 2例太歲樣品

2.3 鞘氨醇單胞菌屬分離菌的初步研究

圖2 分離菌株在無抗性YPD培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)及顯微照片（×100）

表2 對太歲樣品中分離得到的4株共性菌的培養(yǎng)觀察

文獻(xiàn)調(diào)研表明，鞘氨醇單胞菌屬在生物降解方面具有優(yōu)勢，與太歲較為類似。同時，鞘氨醇單胞菌屬可分泌胞外多糖，推測其可能與太歲的形成有關(guān)，因此著重對其進(jìn)行研究。采用鞘氨醇單胞菌特異引物（732 F/982 R）[9]對提取的太歲總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到一條約250 bp的條帶，測序結(jié)果表明在提取的太歲總DNA中存在鞘氨醇單胞菌基因，并非污染產(chǎn)生。

采用YPD培養(yǎng)基培養(yǎng)TS-4分離菌，30℃發(fā)酵72 h后形成黃色凍狀物（圖3），沸水浴溶解發(fā)酵液后，12 000 r/min離心10 min提取上清液，加入2倍量的95%乙醇于4℃過夜醇沉，12 000 r/min離心10 min得到分泌的胞外多糖（圖4），通過HPLC對其單糖組成進(jìn)行分析。

2.4 HPLC分析多糖的單糖組成

混糖標(biāo)準(zhǔn)品PMP衍生后進(jìn)樣梯度流動相HPLC分離結(jié)果見圖5。鞘氨醇單胞菌屬分離菌發(fā)酵多糖PMP衍生后進(jìn)樣梯度流動相HPLC分離結(jié)果見圖6，確認(rèn)其由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖組成，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)品峰面積定量后對樣品進(jìn)行分析，其相對摩爾比約為6∶1∶3。

3 討論

太歲是自然界中存在的一種特殊的未知生命體，至今生物學(xué)界對其歸類仍未給出明確答案。1992年西北大學(xué)對首例太歲樣本進(jìn)行了分析鑒定，認(rèn)為太歲是一種“特大型罕見黏菌復(fù)合體”，并獲得一定認(rèn)可。我們通過微生物學(xué)角度研究太歲樣本的菌種組成，以期初步了解太歲的生物多樣性。采用多種真菌分離培養(yǎng)基對上述2例太歲樣品進(jìn)行菌分離時，從無抗性YPD及麥芽汁培養(yǎng)基平板中分離得到多株相同形態(tài)的不同菌株，測序鑒定結(jié)果均為細(xì)菌，并且2例太歲樣品中均含有上述4株菌株。經(jīng)文獻(xiàn)調(diào)研，河北師范大學(xué)李亮等在NCBI提交的太歲浸液中的29例菌種信息，其中10例為短波單胞菌屬，5例為鞘氨醇單胞菌屬，3例為假單胞菌屬，與我們的結(jié)果很相似。結(jié)合王朝江[10-11]通過構(gòu)建16S rDNA文庫分析太歲樣品細(xì)菌多樣性的結(jié)果，我們認(rèn)為2例來源地不同的太歲之間可能在生物學(xué)組成上存在一定的相似性，也提示不同太歲間存在一定的生物共性。

圖3 TS-4分離菌發(fā)酵72 h后菌體形成凍狀及其顯微觀察（×100）

圖4 TS-4分離菌發(fā)酵72 h后分離得多糖及其顯微觀察（×100）

圖5 混糖標(biāo)準(zhǔn)液HPLC分離結(jié)果1：甘露糖；2：鼠李糖；3：葡萄糖醛酸；4：半乳糖醛酸；5：葡萄糖；6：半乳糖;7：阿拉伯糖

圖6 鞘氨醇單胞菌屬分離菌發(fā)酵多糖HPLC分離結(jié)果

我們發(fā)現(xiàn)上述2例太歲樣品菌分離得到的菌株均為細(xì)菌，并未從中獲得真菌，而在對其他較新鮮的太歲樣品進(jìn)行菌株分離時得到了2株酵母，經(jīng)鑒定其中一株為漢遜德巴利酵母（Debaryo?myces hansenii），推測可能是某些太歲樣品的組織層較厚不易破碎、真菌含量相對較低或不易在實(shí)驗(yàn)室條件下獲得并培養(yǎng)、現(xiàn)有分離手段不完善或樣品保存條件等原因所致。因此，獲取新鮮的太歲樣品，對于太歲的研究非常重要。

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