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    復(fù)方參術(shù)對TGEV感染仔豬小腸黏膜上皮細胞凋亡因子Bcl-2/Bax的影響

    2018-04-09 00:35:44,,,,
    現(xiàn)代牧業(yè) 2018年1期
    關(guān)鍵詞:苦參堿細胞核胃腸炎

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    (1.河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院,河南 鄭州,450011;2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,內(nèi)蒙古 呼和浩特,010018)

    引言

    豬傳染性胃腸炎是由傳染性胃腸炎病毒(TGEV)引起的一種急性傳染病[1]。豬感染后出現(xiàn)嚴重脫水、水樣腹瀉、劇烈嘔吐等特征,尤以10日齡以內(nèi)的仔豬更為嚴重,甚至可達100%死亡,給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失。Jeong研究表明,感染TGEV的PK-15細胞,存在凋亡加速現(xiàn)象[2],TGEV通過激活Bcl-2介導(dǎo)線粒體通路和FasL介導(dǎo)死亡受體通路,誘導(dǎo)PK-15細胞凋亡[3]。衛(wèi)文強[4]等研究表明,黃芩、黃芪、大黃、金錢草體外對TGEV均有抑制作用。當(dāng)前對于中獸藥抗TGEV的研究主要集中在單味藥或提取物單體進行體外抗TGEV感染和細胞的保護率上?,F(xiàn)今成方中藥制劑抗病毒作用研究太少,通過SIEC感染TGEV來探討復(fù)方參術(shù)干預(yù)TGEV誘導(dǎo)SIEC凋亡的相關(guān)基因,為中藥復(fù)方防治TGV提供理論參加。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    豬小腸粘膜上皮細胞(SIEC),由西北農(nóng)林科技大學(xué)張彥明教授實驗室饋贈;PK-15與TGEV購于中科學(xué)院武漢病毒研究所;中藥黨參、茯苓、白術(shù)、扁豆、陳皮、等中藥購于內(nèi)蒙古萬民藥房連鎖有限公司。

    試劑

    DMEM(gibco),EGF(sigma),HEPES(sigma),EB(sigma),AO(sigma),FBS(gibco),ITS(gibco),F(xiàn)astStart Universal SYBR Green Master(ROX),SuperSignalR West Femto Maximum Sensitivity Substrate(Thermo),0.25%胰蛋白酶(gibco),一抗:Bcl-2(sc-492)、Bax(sc-493)均購于美國Santa Cruz生物試劑公司,HRP標(biāo)記的兔抗山羊 IgG(聯(lián)科生物),PVDF膜(Millipore),苦參堿(阿拉丁)。

    儀器設(shè)備

    二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo),離心機(Eppendorf,5430R),熒光倒置顯微鏡(OLYMPUS,1×71),7500 Fast Real-Time PCR儀(AB,IQ5),DYY-12型電泳儀(北京市六一儀器廠),蛋白凝膠成像系統(tǒng)(GE Healthcare, Image Quant LAS4000),超純水機(UPH,成都超純科技有限公司)。

    1.2 方法

    1.2.1SIEC和PK-15細胞的培養(yǎng)與TGEV的增殖

    按常規(guī)方法進行細胞培養(yǎng)[5],與TGEV病毒液(TCID50為103.8/0.1mL)的準備。

    1.2.2試驗分組及處理見(表1)

    表1試驗分組及處理方法

    1.2.3熒光染色

    參照文獻3進行。

    1.2.4Western blot 檢測細胞凋亡主要調(diào)控因子的蛋白表達情況

    將對數(shù)生長期的SIEC懸液接種于培養(yǎng)瓶中,當(dāng)SIEC約長成80%的豐度時, PBS清洗細胞2次,接入相應(yīng)藥物處理或維持液2mL,24h,棄液;再接種100TCID50 TGEV病毒液或維持液1mL,37℃孵育2h,棄病毒液,加入維持液,分別感染0h、2h、4h、8h、12h、24h、48h、72h后棄細胞培養(yǎng)液,提取細胞總蛋白,進行Western blot分析[6],結(jié)果見表1。

    1.3 數(shù)據(jù)處理

    用 SPSS20.0軟件分析統(tǒng)計結(jié)果。

    2 結(jié)果

    2.1 熒光顯微鏡下細胞形態(tài)的變化

    SIEC細胞 AO/EB染色后(如圖1):對照組只被AO染色,細胞核呈長梭形綠色熒光,胞漿內(nèi)無明顯顆粒,細胞核膜完整,核大,呈圓形或橢圓形,形態(tài)規(guī)則,邊緣清晰,染色質(zhì)均勻(圖1-1);隨時間的延長感染TGEV的模型組,其細胞核內(nèi)染色質(zhì)固縮,細胞核發(fā)生明顯碎裂和聚縮,細胞膜失去完整性。(圖1-2~1-5);中藥復(fù)方參術(shù)組干預(yù)感染TGEV的SIEC結(jié)構(gòu)清晰,呈長梭形,大部分細胞核結(jié)構(gòu)較清晰,染色質(zhì)著色均一,凋亡現(xiàn)象不明顯,但存在少量的細胞核變大或碎裂現(xiàn)象(圖1-10~1-13);苦參堿組間于復(fù)方參術(shù)組與模型組之間(圖 1-6~1-9)。

    圖1 復(fù)方參術(shù)對TGEV 感染SIEC細胞形態(tài)學(xué)的影響(200×)圖1-1 正常細胞;圖1-2~1-5分別為TGEV 感染12h、24h、48h、72h;圖1-6~1-9為苦參堿組TGEV 感染12h、24h、48h、72h;圖1-10~1-13為復(fù)方參術(shù)組TGEV 感染12h、24h、48h、72h。

    2.2 復(fù)方參術(shù)干預(yù)TGEV感染SIEC的 Bcl-2和Bax蛋白表達水平的影響

    圖2 復(fù)方參術(shù)對感染TGEV的SIEC Bcl-2蛋白表達水平的影響

    圖3 復(fù)方參術(shù)對感染TGEV的SIEC Bax蛋白表達水平的影響

    由圖2和3可知,與感染TGEV模型組比較復(fù)方參術(shù)組和苦參堿組Bcl-2蛋白表達明顯上調(diào)。復(fù)方參術(shù)組和苦參堿組Bax蛋白表達量在TGEV感染細胞4h后開始下調(diào),對照組與感染TGEV模型組的Bax一直保持高效表達 。

    2.3 復(fù)方參術(shù)對感染TGEV的SIEC細胞Bcl-2和Bax mRNA水平的影響

    圖4表明,Bcl-2mRNA轉(zhuǎn)錄水平隨著TGEV感染細胞時間的延長,TGEV逐漸下降,與對照組相比差異顯著(P<0.05),復(fù)方參術(shù)組極顯著(P<0.01);與空白組相比,8h時模型組 Bcl-2 mRNA轉(zhuǎn)錄量減少(P<0.01),復(fù)方參術(shù)組顯著增加(P<0.05);12h時模型組Bcl-2 mRNA轉(zhuǎn)錄量減少,復(fù)方參術(shù)組顯著增加(P<0.01),苦參堿組表達量增加;24h時復(fù)方參術(shù)組極顯著增加(P<0.01);48h時復(fù)方參術(shù)組極顯著增加(P<0.01),苦參堿組表達量增加;72h時復(fù)方參術(shù)組顯著增加(P<0.05),苦參堿組極顯著增加(P<0.01)。這與Bcl-2蛋白表達水平檢測結(jié)果一致。

    由圖5可知,隨著TGEV感染SIEC時間的延長,TGEV組Bax mRNA轉(zhuǎn)錄一直保持較高水平。復(fù)方參術(shù)Bax mRNA轉(zhuǎn)錄量隨著時間的延長表達量一直較低,與對照組和TGEV相比差異極顯著(P < 0.01)。Bax mRNA變化趨勢與蛋白表達水平一致。

    3 討論

    TGEV屬于冠狀病毒科(Coronaviridae)、α冠狀病毒屬(Coronavirus),與PEDV有較高的同源性。一旦發(fā)病,可致使仔豬大量死亡。目前對該病的防治主要有疫苗、化藥及外源性細胞因子等。由于病毒基因突變快、血清型多,為疫苗的研發(fā)與應(yīng)用帶來眾多困難;中藥抗病毒基于“祛邪”與“扶正”的理論。在于中藥可以直接殺死病毒、抑制病毒復(fù)制,而且可以提高機體免疫力,增強抗病毒功效。

    圖4 復(fù)方參術(shù)對感染TGEV的SIEC細胞Bcl-2 mRNA水平變化,*(P<0.05),**(P<0.01)

    圖5 復(fù)方參術(shù)對感染TGEV的SIEC細胞Bax mRNA水平變化,*(P<0.05),**(P<0.01)

    根據(jù)TGEV感染仔豬后的特征性癥狀,本實驗通過加減化裁經(jīng)典方劑“參苓白術(shù)散”,開展中藥復(fù)方對豬傳染性胃腸炎病毒的治療研究。

    TGEV病毒通過S麥穗蛋白與宿主細胞N-pAPN結(jié)合,介導(dǎo)TGEV與SIEC細胞膜融合,最終引發(fā)病毒侵入細胞內(nèi)部并在該細胞內(nèi)進行復(fù)制,產(chǎn)生大量的具有感染毒性的病毒粒子[3][7][8]。TGEV能夠引起細胞病變致使細胞凋亡。細胞凋亡主要有兩條通路,一條為死亡受體通路,主要包括Fas和TNF等腫瘤壞死因子受體超家族;另一條為線粒體通路,線粒體處于細胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的中心地位,其相關(guān)的基因家族主要是Bcl-2家族。其中Bcl-2和Bax是調(diào)控細胞凋亡發(fā)生的兩個關(guān)鍵因子,通過控制Cyt-C的釋放和下游Caspase-3蛋白酶的活化,介導(dǎo)細胞凋亡,Bax表達增加或Bcl-2表達下調(diào)均可誘導(dǎo)細胞凋亡[9,10,11]。本實驗結(jié)果表明,SIEC感染TGEV后細胞出現(xiàn)CPE現(xiàn)象,細胞發(fā)生凋亡,同時Bax表達增加,Bcl-2表達減少,而通過復(fù)方參術(shù)干預(yù)TGEV感染SIEC后這一現(xiàn)象得到改善,致使細胞凋亡現(xiàn)象不再明顯。

    4 結(jié)論

    試驗結(jié)果表明,復(fù)方參術(shù)湯可顯著增加Bcl-2的表達量,減少Bax的表達量,從而抑制TGEV誘導(dǎo)SIEC的凋亡,實現(xiàn)對SIEC的保護。

    參考文獻:

    [1]殷震,劉景華.動物病毒學(xué).第二版.北京:科學(xué)出版社,1997(3):681-688.

    [2]Jeong H P, Jeong H H, Hyuk M K. Sequence analysis of the ORF 7region of transmissible gastroenteritis viruses isolated in Korea. VirusGenes, 2008(36):71-78.

    [3]丁利. TGEV誘導(dǎo)PK-15細胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通絡(luò)研究[D].楊凌:西北農(nóng)林科技大學(xué),2012.

    [4]衛(wèi)文強,吳潤,劉磊.4味中草藥的體外抗TGEV試驗.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(自然科版),2015(12):23-28.

    [5]王靜.永生化豬小腸上皮細胞系的建立及豬輪狀病毒對其影響的研究[D].楊凌:西北農(nóng)林科技大學(xué),2014.

    [6] Ding L, Xu X, Huang Y, Li Z, Zhang K, Chen G, Yu G, Wang Z, Li W, Tong D.Transmissible gastroenteritis virus infection induces apoptosis through FasL-andmitochondria-mediated pathways.Veterinary microbiology, 2012(158):12-22.

    [7]Smith E C, Denison M R. Implications of altered replication fidelityon the evolution and pathogenesis of coronaviruses. Current Opinionin Virology , 2012(2):519-524.

    [8]孫雪嬌.豬傳染性胃腸炎病毒膜蛋白單克隆抗體的制備與抗原表位的鑒定[D].哈爾濱:東北農(nóng)業(yè)大學(xué),2013.

    [9] Lin HH,Chen JH,Huang CC,et al. Apoptotic effect of 3, 4-dihydroxybenzoic acid on human gastric carcinoma cells involving JNK/p38 MAPK signaling activation.Int J Cancer, 2007, 120 (11) :2306-2316.

    [10]劉玉,原凌燕,楚慧媛,陳徹.As2O3聯(lián)合AZT通過激活caspase-3通路抑制肝癌HepG2細胞的增殖.腫瘤,2014(08):705-711.

    [11]邵秋紅,凌榕鑌,朱兆榮,等.復(fù)方苦芩對感染豬傳染性胃腸炎病毒的PK-15細胞中Bcl-2/BAXmRNA轉(zhuǎn)錄的影響.中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2014(11):2242-2250.

    [12] 王雪飛.中藥復(fù)方體外抗TGEV誘導(dǎo)豬小腸黏膜上皮細胞凋亡的機制研究[D].呼和浩特:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué),2016.

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