抗菌肽的生產方法與產業(yè)化分析

(河南牧業(yè)經濟學院，河南 鄭州，450011)

抗菌肽是存在于生物體內由13-45個氨基酸組成的小分子多肽，能消除體內突變細胞，抵抗外界微生物侵害，屬于先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分。目前為止，人類已經發(fā)現了兩千多種抗菌肽，這些抗菌肽廣泛分布于細菌、昆蟲、植物、兩棲動物、哺乳動物(包括人)[1]中，它們具有廣譜殺菌、抑病毒、抑真菌和抑殺腫瘤細胞等活性，而且不破壞人體正常細胞，能增強免疫功能，加速傷口愈合，在醫(yī)藥、食品加工、日化、農業(yè)、畜禽養(yǎng)殖業(yè)等方面應用前景可觀。

1　抗菌肽的生產方法

1.1　生物提取法

抗菌肽的傳統(tǒng)分離方法主要是通過人工誘導刺激生物有機體內抗菌肽的產量，再用生物化學方法將抗菌肽從宿主機體中提取分離出來。這種傳統(tǒng)分離提純方法非常繁瑣，受其來源的限制，提取量較少，而且不同的試驗條件對于組分的活性效果影響很大，生產成本較高，不能滿足規(guī)模化生產的需要。

1.2　化學合成

已知氨基酸序列的抗菌肽，采用化學合成法獲取目標多肽。目前，有液相合成、固相合成、片段法合成和化學合成四種方法。液相合成法較為基礎，但由于中間體提純過程復雜，工作量較大，花費時間較長，故而使用較少,現多采用多肽的固相合成技術結合化學技術。

固相合成法是根據組成肽鏈的氨基酸分子結構，從C端(羧基端)向 N端(氨基端)重復添加氨基酸的過程。1963年Merrineld首次發(fā)明使用，通過固體樹脂(PAM，MBHA，Rink．Amide-MBHA等)載體上的化學基團與所合成的肽鏈氨基酸C端以共價鍵的形式相連接，再以結合在固相載體上的氨基酸N端作為起點，同連在樹脂上的氨基端進行連接反應。脫去氨基保護基并同過量的活化羧基反應以延長肽鏈，連接一個氨基酸，再脫去氨基保護，再接下一個氨基酸，通過重復以上過程，就可以得到所需要的肽段。組合化學法又稱為同步多重合成化學或組合合成化學，是以固相合成為基礎建立起來的，運用化學合成、組合理論 、計算機輔助設計和機械技術，可在短時間 內將購買的或合成的不同結構的基礎模塊，通過化學合成或生物合成，以共價鍵的形式相結合，系統(tǒng)反復進行連接，從而產生大批相關的化合物。組合化學法是近幾十年興起的一門新學科，已成為化學領域最活躍的部分之一。

1.3　基因工程表達

生物提取法費時費事、產量低；化學合成法所需時間較長，人工合成成本過高，多用于合成較短的肽段，且多為線性，不具備復雜的二級結構，不能保證合成的抗菌肽具有正確的空間構型而具有生物活性。隨著技術和設備的改進，基因工程抗菌肽替代天然抗菌肽在理論和實踐上已成為可行的途徑。目前，基因克隆和表達抗菌肽基因，越來越受到人們的重視。

當前常見的抗菌肽表達體系有真核和原核表達體系兩種。在原核表達體系中，以大腸桿菌表達體系、芽孢桿菌表達體系為代表；酵母表達體系在真核表達體系中使用最多。近年來，真核微藻表達系統(tǒng)因其成本低、產量高的特點得到業(yè)界的廣泛關注。

1.3.1大腸桿菌表達系統(tǒng)

目前，大腸桿菌表達系統(tǒng)是基因表達技術中發(fā)展最早、應用最為廣泛的表達系統(tǒng)，具有遺傳背景清楚、表達水平高、操作簡單、培養(yǎng)周期短、抗污染能力強等優(yōu)點，但因抗菌肽對細菌的殺傷作用，而原核表達缺乏蛋白質翻譯后的修飾和加工過程，所以抗菌肽基因只能以融合蛋白形式表達。

1.3.2枯草芽孢桿菌表達系統(tǒng)

枯草芽孢桿菌表達具有以下三個特點：第一、枯草芽孢桿菌是非致病性革蘭氏陽性菌，細胞壁組成簡單，不含內毒素，能形成芽孢；第二、細胞壁能將大量的蛋白質分泌到胞外，回收和純化都較為簡單；第三、枯草芽孢桿菌擁有高效的分泌信號肽系統(tǒng)，能完成目的蛋白的高效分泌表達，避免包涵體的形成。由于這些特點，因而成為工業(yè)酶制劑的重要生產菌，并已在芽孢桿菌中得到水解酶、中性蛋白酶、淀粉酶等酶制劑。但因其存在水解蛋白酶和質粒不穩(wěn)定等原因，多采用大腸桿菌-芽孢桿菌進行穿梭表達，或采用整合的方式將克隆的基因整合到宿主染色體上克服質粒的不穩(wěn)定性。

1.3.3酵母菌表達體系

酵母屬于低等真核生物，營養(yǎng)要求低、生長速度快、遺傳操作簡單。作為基因工程菌表達外源蛋白的技術已相應成熟，具有操作簡單，表達量高，可大規(guī)模生產，并可對異源蛋白進行修飾，表達的外源蛋白具有合理的空間結構，更接近于天然蛋白質，從而成為真核表達系統(tǒng)的代表。

1.3.4微藻表達系統(tǒng)

一個以藻類為基礎的生產系統(tǒng)將會是繼大腸桿菌和酵母之后的用于大量生產抗菌肽的新一代表達平臺，因為這一系統(tǒng)成本低廉、沒有污染，又是可再生的生物發(fā)生器，而且可以達到很大的生物量。藻類每英畝產生的生物量比玉米等其他作物的30倍還多。大部分藻類能在簡易的條件下生長，如只需水和碳源在陽光下藻類就可以進行光合作用，為其代謝提供能量。由農桿菌介導的基因在藻類中穩(wěn)定高效表達的系統(tǒng)較之其它表達系統(tǒng)有如下優(yōu)點：(1)載體能將外源基因集成到藻類細胞中，如小球藻Chlorella vulgaris；(2)經過穩(wěn)定的轉化可得到轉基因的藻類；(3)轉基因藻類很容易生長到極大的生物量；(4)真核藻類能完成糖基化修飾[2]。

微藻表達系統(tǒng)具有以下優(yōu)勢：首先是成本優(yōu)勢,微藻養(yǎng)殖不需要昂貴的培養(yǎng)基，大部分藻類能在簡易的條件下生長，只需水、碳源和陽光藻類就可以大量繁殖，并作為生物反應器持續(xù)的生產出抗菌肽。藻類培養(yǎng)不需要大型發(fā)酵設備，在室外的湖泊、池塘或人工反應池中都可以大量生長，與大腸桿菌或酵母相比少了發(fā)酵設備及其使用和維護的成本。與從昆蟲或者蛙等天然原料中提取相比，重組表達所得的產物更容易分離純化，節(jié)約了下游加工的成本。其次易于產業(yè)化，藻類繁殖迅速，且能夠在較小的空間里密集生長，達到極大的生物量。如藻類每英畝產生的生物量比玉米等其他作物的30倍還多，這為產業(yè)化奠定了基礎。

2　抗菌肽的應用研究

抗菌肽具有廣譜抗菌性、抗被膜病毒、抗寄生蟲、抗腫瘤等作用，不破壞人體正常細胞，不易產生耐藥性。因此，抗菌肽有望在臨床醫(yī)學、食品加工、日化、農業(yè)及飼料添加劑和動物藥品等領域具有廣闊的開發(fā)應用前景。

2.1　抗菌肽專利

通過SooPAT新世界分析[3]得出，國外關于抗菌肽的專利共有52795項(見圖6，2013年4月15日SooPAT專利檢索結果)，專利申請時間集中在2000年～2008年，其中美國抗菌肽專利約占世界抗菌肽專利的90%，且主要集中在抗菌肽的發(fā)現、制備方法和應用。國內抗菌肽專利申請高峰時間在2000～2012年，主要申請人是上海高科聯合生物技術研發(fā)有限公司、吉林大學、華南農業(yè)大學、廈門大學、山東大學、南京農業(yè)大學、山東大學、中國農業(yè)大學。國內抗菌肽專利主要集中在醫(yī)學、獸醫(yī)學、生物化學、微生物學、農業(yè)、畜牧業(yè)、林業(yè)領域。

2.2　抗菌肽的開發(fā)應用

研究發(fā)現，抗菌肽除廣譜抗菌抗病毒活性之外，還具有促胰島素分泌、促進傷口愈合、提高機體免疫力等新型活性功能，這些功能的發(fā)現，展示了抗菌肽開發(fā)應用的廣闊前景。目前，國內外的抗菌肽產品主要是人用抗菌肽藥物和保健品、抗菌肽日化產品、抗菌肽食品保鮮劑、抗菌肽飼料添加劑和獸藥三種。

2.2.1抗菌肽藥物與保健品

目前，國外研究的部分抗菌肽藥物已進入臨床試驗階段(表1)。

表1　國外抗菌藥物的開發(fā)公司與產品

國內醫(yī)藥公司和相關研究機構也紛紛投入抗菌肽藥物和保健品開發(fā)行列。代表產品有：上海肽仕生物科技有限公司的13種抗菌肽藥物原料，香港泰美國際藥業(yè)集團有限公司的抗菌肽保健品膠囊，青島中秘實業(yè)有限公司的“抗菌肽昆蟲活性蛋白”，云南昆蟲生物科技有限公司的“昆蟲活性蛋白”等產品，山東贏升養(yǎng)殖專業(yè)合作社加工的含抗菌肽的昆蟲蛋白粉等。除此之外，國內有多家醫(yī)藥公司和相關機構在研究開發(fā)抗菌肽藥物。

2.2.2抗菌肽在日化用品中的應用

研究發(fā)現，抗菌肽具有殺菌消炎和促進傷口愈合的功效，既可內服也可外用，且至今未發(fā)現不良反應和細菌耐藥性，這為抗菌肽在日化用品中的應用提供了條件。與藥品相比，日化產品的市場準入門檻相對較低，研發(fā)和審批的周期短，市場需求量大,日化用品市場給了我們更大的想象空間。

國內市場上含有抗菌肽的日用化工產品主要集中在化妝品，以創(chuàng)傷疤痕修復為主，兼具溫和殺菌、抗感染和消除紅腫等功效，所涉及的抗菌肽包括天蠶素Cecropin、rh-aFGF和微生物抗菌肽等。國內的抗菌肽日化產品主要有：天津天獅集團有限公司的“天獅口健爽”，廣州華桑生物工程有限公司的化妝品“抗菌肽修復精化”和“抗菌肽活性收縮水”，廣州綠谷生物有限公司的“微生肽塑型賦活素”等美容產品，廣州尚朵化妝品有限公司的“足跟保濕修復霜”，山東精彩無限生物科技有限公司的“尹姿美創(chuàng)傷修復型(凍干粉)”，北京秘妝堂化妝品有限公司的“深層脫敏祛痘膏”，北京海博利茲科技有限公司的可能用于潔陰洗液的“抗菌多肽”。

2.2.3抗菌肽在食品工業(yè)的應用

天然抗菌肽是生物體的自然產物，具有廣譜抗菌性而對真核細胞無殺傷作用，是一種極具發(fā)展前景的新型食品防腐劑。目前，乳酸鏈球菌素(Nisin)已經被美國FDA批準用于食品保鮮中，它是食品領域成熟應用的唯一抗菌肽。

2.2.4抗菌肽飼料添加劑和獸藥

國外市場主要集中于抗菌肽獸醫(yī)的開發(fā)研究，美國ImmuCell Corporation治療奶牛乳房炎的藥物，有效成分已，與2009年提交FDA獸醫(yī)中心進行審查和批復；美國已把昆蟲抗菌肽做為飼料防腐劑應用于飼料業(yè)。

我國抗菌肽產品的研究、開發(fā)和應用主要集中于動物養(yǎng)殖和保健方面。研究發(fā)現，抗菌肽作為飼料添加劑，添加到畜禽飼料中，既能有效防止飼料霉變，延長飼料保質期，還能提高動物的抗病能力和飼料利用率。黃自然等[4]報道抗菌肽飼料添加劑應用于肉雞預防疾病,提高存活率,增加體重和降低料肉比。劉莉如等研究發(fā)現，抗菌肽可不同程度提高蛋用仔雞血漿IgA、IgG、溶菌酶和C3 含量，腸道大腸桿菌數量有效降低，高劑量的抗菌肽制劑可以增加腸道的乳酸桿菌與雙歧桿菌數量[5]。呂尊周等[6]研究表明，飼糧中添加抗菌肽可調節(jié)機體血清免疫水平，提高蛋雞的脾臟系數。Hancock 等在白羽母番鴨的日糧中添加天蠶素Cecropin AD 制劑，發(fā)現其腸道中的乳酸桿菌數量顯著提高的同時大腸桿菌的數量顯著降低[7]。李永新等將抗菌肽添加劑用于分娩前后的母豬，可提高仔豬初生重和斷奶重，顯著降低哺乳期仔豬的腹瀉率和死亡率，提高整體養(yǎng)殖效益[8]?；潞Ａ盏仍囼灲Y果表明抗菌肽添加劑可以明顯改善仔豬腸黏膜的形態(tài)結構，提高仔豬血清谷丙轉氨酶活性、空腸上皮緊密連接蛋白的基因相對表達量和總蛋白含量[9]。張江等研究結果表明在基礎日糧中添加抗菌肽制劑可明顯降低牛奶中體細胞數量，提高奶牛產奶量，經濟效益可觀[10]。

近年來，飼料行業(yè)中的大型企業(yè)紛紛投入抗菌肽的研發(fā)與生產，香港格拉姆科技國際有限公司目前占有飼料用抗菌肽市場份額的60%以上，主要產品格萊姆系列、免疫金系列和菲腸壯系列產品；深圳瑞鑫百奧生物科技有限公司致力于防御素、抗菌肽、新型病毒性疫苗等生物醫(yī)藥的研發(fā)與生產，已成功實現了人類α-、 β-、和θ-防御素的產業(yè)化。大北農集團公司擁有關鍵菌種、發(fā)酵工藝、后處理和配套應用技術等核心技術。上海蓮豐生物科技有限公司完成了研發(fā)及生產轉化，肽益健由抗菌肽(蜂毒素)、丹參酮等組成，可有效殺滅或抑制引起動物與人類健康障礙的各種細菌、病毒以及寄生蟲，有效的激活非特異性免疫細胞因子，使動物整體免疫力得到提高。深圳圣西馬生物技術有限公司、希普集團、新希望集團、杭州安迪蜜生物工程有限公司(英資企業(yè))、香港新亞國際藥業(yè)集團等都投入大量人力物力財力進行抗菌肽產品的研究(表2)。

表2　國內飼料行業(yè)抗菌肽生產企業(yè)與代表性產品及科研項目

值得一提的是，中農穎泰集團相繼成立了林州市抗菌肽研究所、安陽市多肽工程技術研究中心、河南省抗菌肽工程技術研究中心、飼用抗菌肽北京市工程實驗室、生物飼料添加劑北京市重點實驗室、農業(yè)部飼用抗生素替代技術重點實驗室，組建了由60余名博士和碩士組成的研發(fā)團隊，致力于抗菌肽的廣度與深度研發(fā)。在抗菌肽研究方面，已完成了“天蠶素抗菌肽的創(chuàng)制與應用技術研究”的成果鑒定，技術達到國際領先水平，目前已獲得國內發(fā)明專利1項，申報受理國內發(fā)明專利4項，并完成一項國際PCT專利的審核。目前，正在向農業(yè)部申報國家一類新獸藥。

3　抗菌肽產業(yè)化分析

抗菌肽雖然顯示具有廣闊的應用前景和巨大的開發(fā)潛力，但是抗菌肽產業(yè)化道路并不如想象的那般順暢,主要原因有以下幾個方面：第一，生產成本高，生產方法有待突破；第二，抗菌肽活性還不夠理想，與傳統(tǒng)抗生素比較有很大差距；第三，安全性評價需深入研究，迄今為止，尚無資料證明，在抗菌肽長期使用后病源菌是否可能會產生耐藥性。第四，抗菌肽結構、作用機制和生物功效的關系有待進一步深入研究，為抗菌肽分子改造提供理論依據。

隨著抗菌肽研究的深入，越來越多種類的抗菌肽及其生物活性被發(fā)現，如何將其作用發(fā)揮到極致，如何將其造福于人類，這一命題擺在了研究人員面前。毫無疑問，研制高效低成本的抗菌肽制備生產系統(tǒng)是重中之重，提高抗菌肽表達量和分離純化速度仍是其進入產業(yè)化階段的前提。為了進一步拓展抗菌肽的應用，加快其產業(yè)化進程，在今后的研究中，一方面需要開發(fā)新的抗菌肽及其新型的生理活性，同時研究已有抗菌肽分子結構、作用機制與活性之間的關系，為完善抗菌肽表達系統(tǒng)提供理論基礎；另一方面需要加強抗菌肽安全性研究，明確抗菌肽是否存在潛在的耐藥性威脅，為抗菌肽向獸藥甚至人用藥物開發(fā)方向奠定基礎。此外，需要開展抗菌肽分子改造方面的研究，通過基因工程技術在已有表達系統(tǒng)的基礎上進一步改進修飾以提高抗菌肽的穩(wěn)定性、減弱其溶血性。最后，就目前抗菌肽生產工藝來看，其生產成本偏高，提純困難，生產工藝創(chuàng)新研究也是抗菌肽研究工作者急需解決的難題。

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