微波輔助提取資木瓜多酚化合物工藝優(yōu)化

何冬蘭，薛芷筠，張澤文，王　怡，程國軍，李曉華，田貞環(huán)

(1中南民族大學(xué) 湖北省微生物資源與利用工程技術(shù)研究中心，武漢 430074；2 宜昌銀澤源農(nóng)業(yè)科技有限公司，宜昌 443500)

資木瓜[ChaenomelesSpeciosa(sweet) Nakai]為湖北省長陽資丘特產(chǎn)的皺皮木瓜，又名貼梗海棠，是薔薇科(Rosaceae)木瓜屬(Chaemoneles)的成熟果實(shí)[1]，是一種藥食價值兼具的水果，民間更是有“杏一益，梨二益，木瓜百益”之說，為湖北省的十大道地藥材之一. 資木瓜主要含有有機(jī)酸、多酚類化合物、三萜酸、糖、維生素等成分[2-5]. 其中多酚化合物是一類具有獨(dú)特藥效和生理活性的天然產(chǎn)物[6]，大量研究結(jié)果表明植物多酚具有抑菌、抗氧化、抗腫瘤，防治肺動脈高壓等作用[7-12]，在美容、制藥、醫(yī)療等行業(yè)極具開發(fā)前景，但有關(guān)資木瓜多酚的研究以及微波提取工藝的研究目前尚鮮有報(bào)道[3]，本實(shí)驗(yàn)擬采用微波輔助乙醇提取資木瓜多酚類化合物，在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上采用正交設(shè)計(jì)，確定資木瓜多酚的最佳提取方法，為資木瓜的深度開發(fā)提供依據(jù).

1　實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1　實(shí)驗(yàn)材料

資木瓜(產(chǎn)地湖北省宜昌市長陽縣榔坪鎮(zhèn))，沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品(上海源葉生物科技有限公司，純度98%)，無水乙醇、鎢酸鈉、鉬酸鈉、85%磷酸、濃鹽酸、硫酸鋰、液溴、碳酸鈉均為分析純.

1.2　實(shí)驗(yàn)儀器

FW250中藥粉碎機(jī)(鄭州科豐公司)，MAS-ⅡPLUS常壓微波萃取反應(yīng)工作站(上海新儀公司)，UV-3100BPC分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)公司)，HH-2恒溫水浴鍋(金壇市科興儀器廠)，HR/T16MT臺式高速冷凍離心機(jī)(湖南赫西公司)，RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)，SHB-3循環(huán)水式真空泵(鄭州杜甫儀器廠).

2　實(shí)驗(yàn)方法

2.1　沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確稱取0.010 g沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品置于燒杯中，加水溶解，轉(zhuǎn)移溶液至100 mL容量瓶，定容至刻度線. 分別吸取0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL上述標(biāo)準(zhǔn)液加入到10 mL的具塞比色管中，添加1 mL制備好的Folin-ciocalteu試劑[13]，充分混勻后，加入2 mL 15%Na2CO3溶液，用蒸餾水定容至刻度. 室溫靜置反應(yīng)2 h，于765 nm處測定吸光度. 以沒食子酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[14].

2.2　資木瓜多酚的提取與測定

準(zhǔn)確稱取資木瓜干粉100.00 g，按照料液比1∶10加入95%乙醇，回流2 h，抽濾除去乙醇后，烘干，除去部分色素和脂溶性物質(zhì)[14]. 準(zhǔn)確稱取1.0 g脫脂資木瓜干粉，按照一定料液比加入一定體積的乙醇溶液后，一定功率的微波處理一定時間后，提取液在4 ℃、7000 r/min離心10 min后，保留上清液，加入相同體積的乙醇溶液洗滌沉淀，再次離心后合并上清液，減壓濃縮，收集殘留物，用蒸餾水定容至20 mL. 吸取0.1 mL多酚粗提液于10 mL比色管中，加入Folin-ciocalteu試劑1 mL、15%Na2CO3溶液2 mL，用蒸餾水定容至10 mL，充分混勻后，靜置反應(yīng)2 h，稀釋兩倍，于765 nm處測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多酚含量.

2.3　單因素實(shí)驗(yàn)

微波法提取木瓜過程中，影響多酚最終提取率的因素頗多，本研究著力從微波功率、微波時間、乙醇濃度以及料液比4個方面優(yōu)化多酚提取工藝，利用單因素實(shí)驗(yàn)觀察以上4個因素對多酚提取的影響.

2.3.1微波功率對資木瓜多酚得率的影響

稱取1.0 g脫脂木瓜干粉，按照料液比1∶25、乙醇濃度60%、微波時間60 s，分別采用300、500、700、900 w的微波功率提取多酚，測定多酚含量.

2.3.2微波時間對資木瓜多酚得率的影響

稱取1.0 g脫脂木瓜干粉，按照料液比1∶25、乙醇濃度60%、微波功率700 W，分別采用30、60、90、120 s的微波時間提取多酚，測定多酚含量.

腫瘤治療包括手術(shù)、化療、放療等，治療費(fèi)用較高，且部分病人因疾病影響，身體素質(zhì)減弱，不能承受原本工作壓力，收入減少，進(jìn)一步加重家庭經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。病人2:“這病又治不好，還花這么多錢，啥時候是個頭?！辈∪?：“以前家里老人、孩子都靠我掙錢養(yǎng)家，現(xiàn)在有了這個病，也不能出去打工了，只能在老家找點(diǎn)輕松的活?！贝送?，醫(yī)療費(fèi)用支付方式對病人服藥依從性有重要影響，其中公費(fèi)病人服藥依從性高于有醫(yī)療保險病人，有醫(yī)療保險病人服藥依從性高于自費(fèi)病人[14]。病人5：“這個升白細(xì)胞藥多少錢,貴不？給報(bào)銷不？盡量給我開一些可以報(bào)銷的藥?！辈∪?：“我是自費(fèi)，看病都是自己掏錢，細(xì)胞偏低一點(diǎn)沒事，我多吃點(diǎn)(白細(xì)胞)就上來了”。

2.3.3乙醇濃度對資木瓜多酚得率的影響

稱取1.0 g脫脂木瓜干粉，按照料液比1∶25、微波功率500 W、微波時間60 s，分別采用40%、50%、60%、70%的乙醇濃度提取多酚，測定多酚含量.

2.3.4料液比對皺皮木瓜多酚得率的影響

稱取1.0 g脫脂木瓜干粉，按照微波功率500 W、微波時間60 s、乙醇濃度50%，分別采用1∶15、1∶20、1∶25、1∶30的料液比提取多酚，測定多酚含量.

2.4　正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，每個因素取3個水平，按照L9 ( 34)設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線方法測定多酚含量，并進(jìn)行方差分析，確定最優(yōu)提取方案.

2.5　數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析

利用IBM SPSS Statistics軟件進(jìn)行正交設(shè)計(jì)和分析，利用OriginPro 8進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和繪圖.

3　結(jié)果與分析

3.1　標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=103.11x-0.2679，R2=0.9987，式中x為沒食子酸質(zhì)量濃度 ( mg /mL ) ，y為吸光度值. 各濃度及其對應(yīng)的OD值見表1.

表1　標(biāo)準(zhǔn)曲線測量結(jié)果Tab. 1　Standard curve measurement results

3.2　單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

3.2.1微波功率對資木瓜多酚得率的影響

由圖1可知，微波功率對多酚提取效果影響較大，吸光度隨著微波功率的變化而變化，當(dāng)微波功率在300～700 W時，隨著多酚濃度提高吸光度呈現(xiàn)上升趨勢，在700 W時達(dá)到最大值0.8555. 微波功率在700～900 W時，多酚濃度降低. 其原因可能是當(dāng)微波功率大于700 W時，微波產(chǎn)生的熱量過多，破壞了部分多酚的結(jié)構(gòu)，吸光度下降[15](以下吸光度值均為稀釋兩倍后測得).

圖1　微波功率對多酚得率的影響Fig.1　Effect of microwave power on the yield of polyphenols

3.2.2微波時間對資木瓜多酚得率的影響

微波時間在30～60 s時，隨著微波作用時間的延長，多酚不斷溶解，吸光度呈明顯上升趨勢，在60 s時達(dá)到最大值0.917(圖2). 當(dāng)微波時間大于60 s時，多酚濃度下降，吸光度幾乎呈直線下降趨勢，原因可能是微波作用時間過長致使熱量過高，從而破壞了多酚的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致多酚含量下降.

圖2　微波時間對多酚得率的影響Fig.2　Effect of microwave time on the yield of polyphenols

3.2.3乙醇濃度對資木瓜多酚得率的影響

由圖3可以看出，隨著乙醇濃度的增加，吸光度先增大后逐漸減小，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%時，吸光度值達(dá)到最大值0.989.多酚類物質(zhì)在植物中常以氫鍵和疏水鏈的形式與蛋白質(zhì)、多糖結(jié)合形成穩(wěn)定的復(fù)合物.當(dāng)乙醇的體積分?jǐn)?shù)過低時，不足以與多酚類物質(zhì)形成氫鍵同原有氫鍵競爭，導(dǎo)致最終提取的多酚含量不高[16]；乙醇的體積分?jǐn)?shù)過高時，溶劑極性降低，導(dǎo)致多酚得率下降，脂溶性物質(zhì)溶出增多[17].

圖3　乙醇濃度對多酚得率的影響Fig.3　Effect of ethanol concentration on the yield of polyphenols

3.2.4料液比對資木瓜多酚得率的影響

料液比為1∶25時，吸光度值最大為0.743(圖4). 料液比在1∶25的基礎(chǔ)上，增加或減少，多酚濃度均呈現(xiàn)下降趨勢，吸光度值減小，原因可能是增加溶劑有利于多酚的溶出[18]，但是當(dāng)料液比高于1∶25后，由于溶劑過多，同樣的微波條件下的熱量不足以促使更多多酚溶出,因而多酚含量下降.

圖4　料液比對多酚得率的影響Fig.4　Effect of liquid ratio on the yield of polyphenols

3.3　正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定微波提取資木瓜多酚的最佳工藝條件分別為：微波功率700 W，微波時間60 s，乙醇濃度50%，料液比1∶25.以上條件作為參考，對微波功率、微波時間、乙醇濃度、料液比進(jìn)行4因素3水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì). 因素與水平見表2，正交方案及結(jié)果分析見表3.

表2　正交試驗(yàn)因素及水平設(shè)計(jì)Tab.2　Orthogonal L9(34)factors and levels

由表3可見微波法提取資木瓜多酚正交試驗(yàn)各處理?xiàng)l件下的多酚含量，對該結(jié)果進(jìn)行極差分析可知，在微波提取過程中，各因素對多酚得率的影響次序?yàn)椋篊(乙醇濃度)>A(微波功率)>D(料液比)>B(微波時間),為實(shí)現(xiàn)多酚得率最大化，應(yīng)采用A1B3C1D2組合條件進(jìn)行資木瓜多酚的微波提取，也即微波功率500 W,微波時間90 s，乙醇濃度40%，料液比1∶25.

表3　正交方案及結(jié)果Tab.3　Design and results of L9(34)Orthogonal test

3.4　驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)正交試驗(yàn)的優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，稱取4份1.0 g脫脂木瓜干粉，每份按照上述最優(yōu)提取條件進(jìn)行3組平行試驗(yàn)，所提取的多酚含量分別為44.99 mg/g、45.11 mg/g、45.42 mg/g、45.81 mg/g，平均含量為45.34 mg/g，與正交試驗(yàn)第6組條件(A2B3C1D2)的提取結(jié)果相近，且兩組提取條件的差別也僅限于微波功率，因此正交試驗(yàn)結(jié)果所得到的提取條件是可靠的，為實(shí)現(xiàn)提取效率最大化，將最優(yōu)提取條件定為A2B3C1D2，也即微波功率700 W,微波時間90 s，乙醇濃度40%，料液比1∶25.

4　結(jié)語

以資木瓜為原料采用微波輔助提取木瓜多酚，通過單因素試驗(yàn)以及正交設(shè)計(jì)優(yōu)化出最佳提取方案：微波功率700 W,微波時間90 s，乙醇濃度40%，料液比1∶25，利用該工藝提取所得的資木瓜多酚含量為：47.27 mg/g，得率為4.73%. 該方法較常規(guī)浸提法具有提取時間短、提取效率高的優(yōu)點(diǎn)，為提高資木瓜的經(jīng)濟(jì)效益奠定了初步的技術(shù)基礎(chǔ).

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