基于siPLS法建立藤茶中二氫楊梅素近紅外定量分析方法

陳科力，姚　琪

(湖北中醫(yī)藥大學(xué) 教育部中藥資源和中藥復(fù)方重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢430065)

藤茶為葡萄科蛇葡萄屬顯齒蛇葡萄(Ampelopsisgrossedentata)的干燥藤莖和葉，主產(chǎn)于湖北、湖南、福建等地[1]，主治感冒風(fēng)熱，咽喉腫痛，黃疸型肝炎等. 藤茶主要的有效成分為黃酮類化合物，其中二氫楊梅素的含量較高[2，3]. 研究表明，二氫楊梅素具有較好的降壓、降脂、降糖和保肝作用 ，目前藤茶成為一些地區(qū)較常用的保健茶. 但不同產(chǎn)地、不同采收期、不同批次藤茶中二氫楊梅素的含量差異很大，在本文的調(diào)查中，其含量范圍為9%～46%，在以往的測(cè)定中,曾發(fā)現(xiàn)更低含量. 因此，建立一種快速分析方法有利于隨時(shí)監(jiān)控市售藤茶的質(zhì)量.

藤茶的定量分析方法通常采用高效液相色譜法(HPLC)[4]，分析時(shí)間較長(zhǎng). 近紅外光譜(NIRS)技術(shù)是近年來發(fā)展迅速的光譜技術(shù)之一，其主要反映C-H、O-H、N-H等含氫基團(tuán)的倍頻與合頻吸收，具有分析速度快、樣品無損、無污染、操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)[5]，在定性以及定量分析方面已得到廣泛應(yīng)用[6,7]. 擬采用NIRS技術(shù)與化學(xué)計(jì)量學(xué)方法相結(jié)合，采用組合區(qū)間偏最小二乘法(synergy interval partial least squares, siPLS)建立定量模型，用于藤茶中二氫楊梅素的快速定量分析.

1　儀器與材料

1.1　儀器

MPA型傅里葉變換近紅外光譜儀(德國(guó)Bruker公司)，配有固體積分球漫反射附件、OPUS7.5軟件；MATLAB2014a軟件(美國(guó)MathWorks公司)；UltiMate3000高效液相色譜儀(美國(guó)Dionex公司)，配有UltiMate3000四元梯度洗脫泵，UVD170U檢測(cè)器；電子分析天平(瑞士Precisa公司).

1.2　藥材與試劑

45批藤茶樣品收集于湖北恩施、湖南張家界、福建漳州、福建泰寧，經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)生藥教研室陳科力教授鑒別，均為葡萄科顯齒蛇葡萄(Ampelopsisgrossedentata)的藤莖. 二氫楊梅素對(duì)照品(成都曼思特生物科技有限公司，批號(hào)MUST-17031501)；甲醇為色譜純；水為超純水.

2　方法與結(jié)果

2.1　含量測(cè)定

參照文獻(xiàn)[8,9]采用HPLC法測(cè)定樣品中的二氫楊梅素含量.

2.1.1對(duì)照品溶液的制備

精密稱取二氫楊梅素對(duì)照品，置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容，制成1.002 g/L的二氫楊梅素對(duì)照品溶液.

2.1.2供試品溶液的制備

取干燥后的本品粉末(過60目篩)0.02 g，精密稱定，浸于10 mL甲醇溶液中，超聲提取45 min，放冷，過濾，轉(zhuǎn)至10 mL容量瓶中，定容搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液.

2.1.3檢測(cè)條件

色譜柱：Welchrom-C18(250 mm×4.6 mm×5 mm)；流動(dòng)相：甲醇-0.05%磷酸溶液(35∶65)；流速0.8 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：290 nm.

2.1.4標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別精密量取對(duì)照品溶液0、0.4、0.8、1.2、1.6、1.8 mL置于2 mL容量瓶中，分別加入甲醇至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，所得溶液按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定. 繪制峰面積(Y)-對(duì)照品濃度(X)曲線，得到二氫楊梅素含量的回歸方程為Y=1030X-2.2249(r=0.9991，n=5)，線性關(guān)系良好.

2.1.5樣品含量測(cè)定

按2.1.3色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄20 min內(nèi)色譜圖，計(jì)算得供試品中二氫楊梅素含量在9.77%～46.13%范圍內(nèi).

2.2　近紅外光譜采集

分別將45批藤茶樣品打粉，過60目篩，干燥，混合均勻置于石英樣品杯中，在分辨率為16 cm-1、掃描時(shí)間為64次、掃描范圍為12500～4000 cm-1條件下，每個(gè)樣品重復(fù)掃描3次，求平均光譜. 結(jié)果表明，45批藤茶樣品的近紅外光譜圖具有相似峰形(圖1)，特征峰主要集中在9000～4000 cm-1. 因此，建模譜段初步選定為9000～4000 cm-1.

圖1　45批藤茶樣品的近紅外光譜圖Fig. 1　Near infrared spectra of 45 batches of Ampelopsis grossedentata

2.3　二氫楊梅素含量的近紅外光譜siPLS定量模型

2.3.1樣品集的劃分

在MATLAB2014a中，采用K-S算法[10]，按照訓(xùn)練集和驗(yàn)證集2∶1劃分樣本建立定量校正模型. 各樣品集樣品濃度測(cè)定值的變化范圍、平均值和樣品量如表1.

表1　樣品集信息Tab.1　Information of sample set

2.3.2模型的建立與驗(yàn)證方法

采用siPLS算法將樣品的光譜信息和含量信息進(jìn)行匹配，建立siPLS定量分析模型，用于藤茶中二氫楊梅素的快速定量分析. 建模過程中，訓(xùn)練集通過內(nèi)部交叉驗(yàn)證來優(yōu)化模型以及評(píng)價(jià)模型性能，以模型的交叉驗(yàn)證均方差(RMSECV)、決定系數(shù)(R2)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)；采用外部驗(yàn)證對(duì)所建模型的預(yù)測(cè)能力進(jìn)行評(píng)價(jià)，以模型對(duì)訓(xùn)練集預(yù)測(cè)均方差(RMSEE)、對(duì)驗(yàn)證集預(yù)測(cè)均方差(RMSEP)及其決定系數(shù)(R2)作為評(píng)價(jià)指標(biāo). 其中，在內(nèi)部交叉驗(yàn)證中，RMSECV越小，R2越大，所建模型越合理；在外部驗(yàn)證中，RMSEE不得大于RMSECV，RMSEP越小，R2越大，結(jié)果與實(shí)測(cè)值越接近，模型精度越高，預(yù)測(cè)能力越強(qiáng). 此外，所建模型對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)果的相對(duì)預(yù)測(cè)偏差(RPD)作為評(píng)價(jià)模型預(yù)測(cè)能力的關(guān)鍵指標(biāo). RPD為1.75～2.25時(shí)，具有一定的建模意義；RPD為 2.25～3時(shí)，建模比較成功；RPD 為3～4時(shí)，模型具有較強(qiáng)實(shí)用性[11]. 建模過程中，模型的主因子數(shù)(Rank)不宜過大，否則會(huì)造成模型過擬合. 因此，Rank值在1～10范圍內(nèi)進(jìn)行優(yōu)化，根據(jù)RMESCV-Rank關(guān)系圖，以RMSECV值最小確定最佳Rank值.

2.3.3光譜的預(yù)處理方法篩選

采用矢量歸一化(VN)、減去一條直線(constant offset elimination)、一階導(dǎo)數(shù)(FD)、二階導(dǎo)數(shù)(SD)、多元散射校正(MSC)等及其組合方法對(duì)光譜進(jìn)行預(yù)處理[12]. 在特征譜段9000～4000 cm-1范圍內(nèi)，依次以不同預(yù)處理方法獲得的光譜信息建立siPLS模型，評(píng)價(jià)模型的內(nèi)部交叉驗(yàn)證結(jié)果，RMSECV越小，R2越大，預(yù)處理效果越好.

預(yù)處理方法為VN法時(shí)(表2)，模型的RMSECV最小，R2最大，所建模型效果最好，確定為本實(shí)驗(yàn)的預(yù)處理方法.

表2不同光譜預(yù)處理方法對(duì)定量模型的影響

Tab.2Effects of different preprocessing methods on the quantitative model

預(yù)處理方法內(nèi)部交叉驗(yàn)證R2/%RMSECV/%Rank未處理25．617．346VN76．554．1210減去一條直線31．667．044FD，9點(diǎn)平滑40．756．559SD，9點(diǎn)平滑30．487．101MSC43．646．393FD+VN，9點(diǎn)平滑33．006．976FD+減去一條直線，9點(diǎn)平滑50．775．979FD+MSC，9點(diǎn)平滑30．247．111

2.3.4特征譜段的優(yōu)選

在建立近紅外定量分析模型時(shí)，通常會(huì)對(duì)近紅外的特征譜段進(jìn)行篩選，以消除干擾變量、簡(jiǎn)化模型以及提高預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性. 區(qū)間偏最小二乘法(iPLS)把譜區(qū)等分成n個(gè)子區(qū)間，分別建立各子區(qū)間的回歸模型以及該譜區(qū)的回歸模型；將該譜區(qū)的回歸模型與各子區(qū)間的回歸模型進(jìn)行比較，進(jìn)而篩選出最佳特征譜段[13]. 但單一子區(qū)間的篩選可能會(huì)造成光譜信息的部分遺漏，而區(qū)間組合偏最小二乘法(siPLS)可以彌補(bǔ)這一缺陷，即通過不同區(qū)間數(shù)的任意組合而篩選出最優(yōu)組合區(qū)間[14].

采用VN法對(duì)光譜進(jìn)行預(yù)處理，在9000～4000 cm-1譜段范圍內(nèi)進(jìn)行篩選，將9000～4000 cm-1譜段劃分為5、6、7、8、9和10個(gè)區(qū)間，依次進(jìn)行siPLS運(yùn)算，選取各初始區(qū)間條件下所建模型的RMSECV值最小時(shí)為最佳組合區(qū)間，所優(yōu)選的特征譜段及其建模效果見表3以及圖2. 由表3可確定區(qū)間數(shù)n=10的優(yōu)化結(jié)果最佳. 從圖2RMSECV與Rank關(guān)系圖可知最佳Rank為10.

表3　siPLS優(yōu)選譜段及建模結(jié)果

圖2　內(nèi)部交叉驗(yàn)證均方差與主成分?jǐn)?shù)關(guān)系Fig.2　RMSECV vs Rank

2.3.5模型評(píng)價(jià)和驗(yàn)證

根據(jù)上述結(jié)果，以VN法預(yù)處理光譜，并把9000～4000 cm-1譜段劃分為10個(gè)區(qū)間進(jìn)行siPLS，確定的最佳特征譜段9000～8500 cm-1、8000～7000 cm-1、6000～5500 cm-1組合作為建模譜段時(shí)，所建二氫楊梅素的siPLS模型結(jié)構(gòu)最合理，預(yù)測(cè)能力最強(qiáng). 將訓(xùn)練集和驗(yàn)證集樣品光譜數(shù)據(jù)分別輸入到所建模型中，所得各樣品集的預(yù)測(cè)結(jié)果見圖3.

a)訓(xùn)練集；b) 驗(yàn)證集圖3　模型預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.3　Model prediction results

該模型對(duì)訓(xùn)練集預(yù)測(cè)結(jié)果RMSEE=0.993%，對(duì)驗(yàn)證集預(yù)測(cè)結(jié)果RMSEP=2.87%，R2=90.67%，RPD=3.27>3，該模型結(jié)構(gòu)合理，預(yù)測(cè)能力強(qiáng)，可滿足實(shí)踐應(yīng)用的要求，具有一定實(shí)用價(jià)值，可用于藤茶中二氫楊梅素的含量測(cè)定. 15批驗(yàn)證集藤茶樣品中二氫楊梅素的含量預(yù)測(cè)結(jié)果見表4.

表4　驗(yàn)證集樣品的預(yù)測(cè)結(jié)果Tab.4　Prediction results of samples from test set

3　結(jié)語

本研究通過對(duì)45批藤茶光譜數(shù)據(jù)的分析，并以HPLC的測(cè)定結(jié)果作為參考，采用siPLS法建立了二氫楊梅素的近紅外定量分析模型. 該模型具有較好的模型性能及預(yù)測(cè)能力，可用于快速測(cè)定藤茶中二氫楊梅素的含量. 實(shí)驗(yàn)過程中，與傳統(tǒng)的高效液相色譜法相比，近紅外光譜法省去了繁瑣的樣品處理步驟，大大提高了分析速度. 該方法為快速監(jiān)控藤茶藥材的質(zhì)量提供了參考，為藤茶的生產(chǎn)應(yīng)用提供了依據(jù).

[1]馮新玲，陳科力，李娟.龍蔓藤茶增強(qiáng)免疫力功能的實(shí)驗(yàn)研究[J].中南民族大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2016,(1):67-69.

[2]謝雪佳，王晨光，侯小龍，等. 冷卻結(jié)晶法純化二氫楊梅素的工藝[J]. 醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2017,8:912-916.

[3]成鳳桂,歐知義.鄂西藤茶中總黃酮的提取及含量測(cè)定[J].中南民族大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2005,(2):19-22.

[4]李瑛琦，于治國(guó)，陸文超. HPLC法測(cè)定藤茶中雙氫楊梅黃素和楊梅黃素的含量[J].中草藥, 2003, 34(12):1098-1100.

[5]徐光通，袁洪福，陸婉珍. 現(xiàn)代近紅外光譜技術(shù)及應(yīng)用進(jìn)展[J].光譜學(xué)與光譜分析，2000，20(2):134-142.

[6]李彥周，閔順耕,劉霞. 近紅外光譜技術(shù)在中草藥分析中的應(yīng)用[J].光譜學(xué)與光譜分析,2008,28(7):1549-1553.

[7]李燕，吳然然，于佰華，等. 紅外光譜在中藥定性定量分析中的應(yīng)用[J].光譜學(xué)與光譜分析,2006,26(10):1846-1849.

[8]奉艷花,覃潔萍,王淼,等. 不同干燥方法對(duì)藤茶主要活性成分二氫楊梅素的影響研究[J].藥物分析雜志. 2015,35(8):1483-1487.

[9]林詩瑤，闕金花，李煌,等. HPLC法測(cè)定藤茶的二氫楊梅素含量[J]. 福建中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2014,24(3):44-45.

[10]Saptoro A, Tadé M O, Vuthaluru H. A modified kennard-stone algorithm for optimal division of data for developing artificial neural network models: chemical product and process modeling [J]. Chemical Product & Process Modeling, 2012, doi:10.1515/1934-2659.1645.

[11]Malley D F, McClure C, Martin P D, et al. Compositional analysis of cattle manure during composting using a field-portable near-infrared spectrometer [J]. Communications in Soil Science and Plant Analysis, 2005, 36(4-6):455-475.

[12]尼珍,胡昌勤,馮芳.近紅外光譜分析中光譜預(yù)處理方法的作用及其發(fā)展[J]. 藥物分析雜志. 2008,28(5):824-829.

[13]Norgaard L, Saudland A, Wagner J, et al. Interval partial least-squares regression (iPLS): a comparative chemometric study with an example from near-infrared spectroscopy [J]. Applied Spectroscopy, 2000, 54(3):413-419.

[14]陳龍, 袁明洋, 明晶,等. 基于改進(jìn)siPLS法建立5種含CaCO3中藥的拉曼光譜定量模型[J]. 中國(guó)中藥雜志, 2015, 40(18):3608-3615.