Klk6、Her—2蛋白及Ki—67在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)及臨床病理意義

鄒云峰　熊雅波　楊春林

[摘要] 目的 探討組織型激肽釋放酶6（Klk6）、Her-2蛋白及Ki-67在子宮內(nèi)膜癌中表達(dá)的意義。 方法 應(yīng)用免疫組化檢測(cè)正常增生期內(nèi)膜、單純性增生性內(nèi)膜、復(fù)雜性不典型增生性內(nèi)膜各19例和子宮內(nèi)膜樣腺癌38例中Klk6、Her-2蛋白、Ki-67的表達(dá)情況。利用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 17.0和Graphpad Prism 5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析檢測(cè)并探討其意義。 結(jié)果 Klk6、Her-2蛋白、Ki-67在癌組織中表達(dá)高于其他病變（P<0.05），Klk6在不同腫瘤臨床分期中表達(dá)有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）；而Klk6、Her-2蛋白在子宮內(nèi)膜癌分級(jí)及淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。 結(jié)論 Klk6、Her-2蛋白、Ki-67在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)與腫瘤發(fā)生有一定的相關(guān)性，特別是Klk6與子宮內(nèi)膜癌分期相關(guān)，對(duì)臨床診斷、治療及評(píng)估預(yù)后具有一定的價(jià)值。

[關(guān)鍵詞] 子宮內(nèi)膜癌；Klk6；Her-2蛋白；Ki-67；免疫組織化學(xué)

[中圖分類號(hào)] R737.3 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2018）04-0025-04

[Abstract] Objective To investigate the significance of expression of tissue-specific kallikrein 6 （Klk6）， Her-2 protein and Ki-67 in endometrial carcinoma. Methods Immunohistochemistry was used to detect the expression of Klk6， Her-2 protein and Ki-67 in normal proliferative endometrium（n=19）， simple proliferative endometrium（n=19）， complex atypical hyperplastic endometrium （n=19） and endometrioid adenocarcinoma（n=38）. Statistical software SPSS 17.0 and Graphpad Prism 5 were used to detect and explore its significance. Results The expression of Klk6， Her-2 protein and Ki-67 in cancer tissues was higher than that in other lesions（P<0.05）. There was statistically significant difference in the Klk6 expression among different clinical stages（P<0.05）. There was no significant difference in the expression of Klk6 and Her-2 protein among different grades of endometrial carcinoma or in endometrial carcinoma with or without lymph node metastasis（P>0.05）. Conclusion The expression of Klk6， Her-2 protein and Ki-67 has some correlation with the occurrence of endometrial carcinoma， and has certain value for clinical diagnosis， treatment and prognosis evaluation， of which especially Klk6 is associated with staging of endometrial cancer.

[Key words] Endometrium carcinoma； Klk6； Her-2 protein； Ki-67； Immunohistochemistry

組織激肽釋放酶基因家族（kallikreins，Klks）是廣泛存在于人體各組織中編碼絲氨酸蛋白酶的一組同源基因?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)Klks基因家族所編碼的組織激肽釋放酶共15種[1，2]，參與細(xì)胞到組織發(fā)生、發(fā)展的許多正常生理過程，如牙齒及神經(jīng)、生殖系統(tǒng)的發(fā)育[3-5]等，此外，還與腫瘤的轉(zhuǎn)移有關(guān)。大量研究表明Klks在許多腫瘤及非腫瘤疾病中有一定的表達(dá)差異，從而應(yīng)用于臨床診斷中，如Klk3即前列腺特異性抗原（PSA）已被廣泛應(yīng)用于前列腺腺癌的篩查，是診斷、預(yù)后、監(jiān)測(cè)最重要的標(biāo)記物之一[5，6]；也有研究表明Klk6在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展、浸潤轉(zhuǎn)移等方面有一定作用[7]，但在子宮內(nèi)膜相關(guān)病變中研究較少。Her-2基因是某些腫瘤分子靶向治療檢測(cè)基因之一，現(xiàn)臨床對(duì)Her-2基因陽性的腫瘤分子靶向治療具有良好的效果，如胃癌、乳腺癌等[8-11]。Ki-67是細(xì)胞增殖指數(shù)，對(duì)腫瘤預(yù)后的評(píng)估有一定作用。本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)正常增生期、良性增生及子宮內(nèi)膜癌中的Klk6、Her-2蛋白的表達(dá)及Ki-67增殖指數(shù)，分析與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性，以探討在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展中的作用，為子宮內(nèi)膜癌的診斷、治療、預(yù)后提供參考數(shù)據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集余姚市人民醫(yī)院病理科2009年1月～2017年3月間存檔資料，經(jīng)病理明確診斷女性患者病例：增生期子宮內(nèi)膜19例（A組），年齡30～54歲，平均（45.58±6.41）歲；單純性增生19例（B組），年齡27～55歲，平均（46.21±6.59）歲；復(fù)雜性不典型增生19例（C組），年齡28～63歲，平均（50.50±9.68）歲；子宮內(nèi)膜樣腺癌38例（D組），年齡38～77歲，平均（59.15±9.45）歲。各組間年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。38例子宮內(nèi)膜樣腺癌中：1級(jí)10例（D1）、2級(jí)11例（D2）、3級(jí)17例（D3）；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移5例，無轉(zhuǎn)移33例；27例Ⅰ期、4例Ⅱ期、7例Ⅲ期（按照2009 FIGO手術(shù)分期進(jìn)行分期）。

1.2 免疫組化

Klk6抗體來自美國R&D;公司，Her-2、Ki-67抗體和SP免疫組化試劑盒均來自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司。組織采用10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，連續(xù)4 μm厚切片，采用鏈霉卵蛋白素染色（SP法）檢測(cè)Klk6、Her-2、Ki-67蛋白。按SP免疫組化試劑盒（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司）說明書進(jìn)行基本步驟：切片脫蠟→沖洗→PBS稀釋的山羊血清封閉→沖洗→加生物素標(biāo)記二抗工作液→PBS沖洗→滴加適量的堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液→PBS沖洗→DAB液顯色→蘇木精復(fù)染→梯度酒精脫水干燥→二甲苯透明→中性樹膠封片→鏡下觀察。

1.3 結(jié)果判定

（1）Klk6蛋白染色結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：主要是子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞質(zhì)中呈棕色顆粒為陽性細(xì)胞，隨機(jī)觀察10個(gè)高倍鏡視野（×400）并計(jì)數(shù)，每個(gè)視野至少計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，取其平均值為該病例的細(xì)胞陽性率。視野中無細(xì)胞陽性著色或陽性細(xì)胞<10%為陰性（0），陽性細(xì)胞在10%～50%為陽性（1+），陽性細(xì)胞>50%為強(qiáng)陽性（2+）。（2）Her-2蛋白定位于細(xì)胞膜上，染色結(jié)果根據(jù)陽性信號(hào)強(qiáng)度及著色方式進(jìn)行評(píng)估：無陽性細(xì)胞或膜陽性細(xì)胞<10%為陰性（0），>10%的細(xì)胞有微弱或難以察覺的膜著色或僅部分細(xì)胞膜著色為陽性（1+），>10%的細(xì)胞有弱或中等強(qiáng)度的完整“U”型膜著色為陽性（2+），>10%的細(xì)胞有中等或強(qiáng)的完整“U”型膜著色為陽性（3+）。Klk6及Her-2蛋白以免疫組化結(jié)果（1+）為陽性標(biāo)準(zhǔn)。（3）Ki-67定位于細(xì)胞核，胞核染為棕黃色或棕褐色視為陽性表達(dá)，Ki-67增殖指數(shù)評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)：選擇腫瘤細(xì)胞豐富、陽性細(xì)胞較多的熱點(diǎn)區(qū)域，選擇至少10個(gè)高倍鏡視野，計(jì)算這些視野腫瘤細(xì)胞中陽性細(xì)胞的平均值（%），作為Ki-67的增殖指數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0和Graphpad Prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Klk6蛋白在子宮內(nèi)膜病變中的表達(dá)

Klk6蛋白在正常增生期子宮內(nèi)膜，單純性子宮內(nèi)膜增生均不表達(dá)，陽性率分別為0（0/19）、0（0/19），復(fù)雜性不典型性增生陽性率100%（19/19），子宮內(nèi)膜癌陽性率94.74%（36/38），Klk6蛋白在復(fù)雜性不典型性增生和子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)水平明顯高于良性子宮內(nèi)膜病變（P<0.05）（表1，封三圖4）。在子宮內(nèi)膜癌1級(jí)、2級(jí)、3級(jí)中陽性表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）（表2）；在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與無轉(zhuǎn)移之間表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）（表3）；但在不同臨床分期中表達(dá)有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）（表4）。

2.2 Her-2蛋白在子宮內(nèi)膜病變上的表達(dá)

Her-2蛋白在正常增生期子宮內(nèi)膜陽性率為47.37%（1+，9/19），單純性子宮內(nèi)膜增生陽性率47.37%（1+，9/19），復(fù)雜性不典型性增生陽性率26.32%（1+，5/19），子宮內(nèi)膜癌陽性率73.68%（1+，13/38；2+，12/38；3+，3/38），Her-2蛋白在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)水平明顯高于增生期子宮內(nèi)膜和其他內(nèi)膜病變（P<0.05）（表5，封三圖5）。在子宮內(nèi)膜癌不同分級(jí)、有無轉(zhuǎn)移及不同臨床分期間表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P均>0.05）（表6～8）。

2.3 不同子宮內(nèi)膜病變Ki-67增殖指數(shù)的表達(dá)分析

Ki-67增殖指數(shù)在增生型內(nèi)膜平均陽性率56.84%，單純性子宮內(nèi)膜增生平均陽性率33.42%，復(fù)雜性不典型性增生陽性率46.47%，子宮內(nèi)膜癌陽性率55.68%，雖然Ki-67增殖指數(shù)在子宮內(nèi)膜癌中表達(dá)高于單純性增生（P<0.05）（封三圖6，表9），但在子宮內(nèi)膜癌不同組織學(xué)分級(jí)、是否轉(zhuǎn)移及不同臨床分期中無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（表10～12）。

3 討論

子宮內(nèi)膜癌是女性生殖系統(tǒng)常見惡性腫瘤之一。近年來子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生率有上升趨勢(shì)[12]，多發(fā)生于絕經(jīng)后婦女，發(fā)病高峰在50～70歲。其發(fā)病率增高原因有多種，如人類壽命的延長使高齡婦女增多，從而內(nèi)膜癌高發(fā)年齡人群基數(shù)增大；良好營養(yǎng)使雌激素水平相對(duì)增高；此外，初潮年齡過早、絕經(jīng)后延、未產(chǎn)、肥胖、高血壓、糖尿病等都可以影響子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生。通過大量研究表明，雌激素水平的升高及子宮內(nèi)膜長時(shí)間接受雌激素的刺激是引起子宮內(nèi)膜癌發(fā)生的關(guān)鍵。

Klk6蛋白受類固醇激素調(diào)控，在乳腺癌、卵巢癌、睪丸癌和前列腺腺癌等激素相關(guān)的惡性腫瘤中異常表達(dá)[3-5]，有研究表明Klk6可引起宮頸癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移[13]。本研究發(fā)現(xiàn)Klk6在子宮內(nèi)膜癌中陽性表達(dá)明顯高于正常增生期子宮內(nèi)膜和其他子宮內(nèi)膜病變（P<0.05），在子宮內(nèi)膜癌1級(jí)、2級(jí)、3級(jí)中陽性表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）；但在不同臨床分期中表達(dá)有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。提示Klk6在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展中起到一定的作用，與臨床分期有一定的相關(guān)性。與佟麗波等[14，15]研究Klk6及Klk7在子宮內(nèi)膜癌中的意義相一致。

Her-2基因是某些腫瘤分子靶向治療檢測(cè)基因之一，如胃癌、乳腺癌等[8，16，17]，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Her-2蛋白在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)水平明顯高于正常增生期子宮內(nèi)膜和其他子宮內(nèi)膜病變（P<0.05）。但在子宮內(nèi)膜癌不同分級(jí)及淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），提示Her-2基因在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生的早期起到一定作用。

Ki-67可檢測(cè)癌細(xì)胞增殖指數(shù)，表示癌細(xì)胞增殖活性，對(duì)內(nèi)膜癌的診斷與預(yù)后的評(píng)估起到一定的作用[18，19]。本實(shí)驗(yàn)顯示Ki-67增殖指數(shù)在子宮內(nèi)膜癌中表達(dá)高于單純性增生，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），而在其他子宮內(nèi)膜病變無明顯差異。

Klks家族主要是編碼絲氨酸蛋白酶[3]，即一種重要的蛋白水解酶，其中Klk6作用是降解細(xì)胞外基質(zhì)中纖維蛋白，加強(qiáng)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的可能[20]。Her-2是表皮生長因子受體家族成員之一，主要是通過與EGF結(jié)合從而促進(jìn)細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移[21]。我們?cè)O(shè)想Klk6和Her-2同時(shí)表達(dá)是否加強(qiáng)腫瘤轉(zhuǎn)移的可能性，雙重判斷預(yù)后，但由于本實(shí)驗(yàn)樣本數(shù)較少，暫時(shí)未做相關(guān)統(tǒng)計(jì)，有待后續(xù)進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究提示Klk6、Her-2、Ki-67對(duì)子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展起到一定的作用。并且Klk6與臨床分期有一定的相關(guān)性，且提示Klk6有可能成為臨床早期篩查子宮內(nèi)膜癌重要標(biāo)志物，可能成為腫瘤治療的有效靶點(diǎn)。

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（收稿日期：2017-11-01）