羅格列酮對(duì)家兔腦出血模型病灶周圍內(nèi)皮素-1表達(dá)及血腦屏障通透性的影響

李穎慧，李軍，任思穎，王麗琨，伍國鋒

在亞洲，腦出血（Intracerebral Hemorrhage，ICH）所有腦卒中類型的20%～30%[1]，發(fā)病后1個(gè)月的病死率高達(dá)40%[2]。ICH后血紅蛋白毒性、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)等繼發(fā)性損傷嚴(yán)重?fù)p害神經(jīng)功能[3]。內(nèi)皮素1（endothelin-1，ET-1）是目前已知的最強(qiáng)、最持久的縮血管活性多肽，其在ICH病理生理中的作用鮮有報(bào)道。噻唑烷二酮類藥物可通過激活過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR）-γ，抑制炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激反應(yīng)，促進(jìn)膠質(zhì)細(xì)胞吞噬作用，減輕ICH后繼發(fā)性損害。羅格列酮為噻唑烷二酮類藥物的一種，其減輕下游繼發(fā)性腦損傷的發(fā)生是否與ET-1相關(guān)尚不知。本研究探討羅格列酮病灶區(qū)灌注治療后，血腫周圍腦組織ET-1表達(dá)及血腦屏障通透性的情況，探討其減輕ICH后繼發(fā)性損傷與ET-1的相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)別健康新西蘭大耳白兔45只，由貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體質(zhì)量2.8～3.4 kg，雌雄不拘，在光照充足，10℃～30℃環(huán)境飼養(yǎng)。

1.1.2 主要儀器及試劑 ZH-藍(lán)星B型兔腦立體定位儀購于淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司；臺(tái)式高速離心機(jī)Eppendorf 5415D購于德國Eppendorf公司；SynergyH4酶標(biāo)儀購于美國伯騰儀器有限公司；ET-1單克隆抗體、SABC免疫組化試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司；ET-1二抗、DAB顯色試劑盒購于中山公司生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 45只家兔隨機(jī)分為3組，正常對(duì)照組（NC組）、模型組（MC組）、藥物灌注組（RSG組），各15只。每組在制模后1、3或7 d各處死5只家兔行相關(guān)指標(biāo)測(cè)定。

1.2.2 模型及標(biāo)本制備方法 造模前12 h禁食，6 h禁飲。家兔麻醉后固定在立體定位儀上，取十字縫與人字縫交叉點(diǎn)為0點(diǎn)，于AP0/L6為穿刺點(diǎn)，深度約12 mm。NC組緩慢注入生理鹽水0.3 mL，MC組及RSG組注入家兔耳中央動(dòng)脈血0.3 mL，留針10 min后緩慢拔出；6 h后NC組及MC組再次緩慢注入生理鹽水0.1 mL，RSG組注入含有羅格列酮0.2 mg/kg的生理鹽水0.1 mL，留針10 min后緩慢拔出。模型制備完成后肌注40萬單位青霉素預(yù)防感染。家兔在處死前2 h行Purdy神經(jīng)功能評(píng)分，耳緣靜脈注入2%伊文思藍(lán)（2 mL/kg）。行心臟灌洗生理鹽水及中性甲醛固定腦組織，取腦后置于冰盤，將針道中心直徑1.5 cm以外的腦組織切除，四分法切割后用于檢測(cè)。

1.2.3 免疫組織化學(xué)檢測(cè) 取兔腦組織制作石蠟切片，片厚3 μm，常規(guī)法行免疫組化染色，小鼠ET-1作為一抗（1∶120），山羊抗鼠IgG抗體-HRP為二抗，DAB顯色。細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色物質(zhì)者為ET-1陽性細(xì)胞。MIAS圖像分析系統(tǒng)測(cè)定陽性細(xì)胞的平均光密度值，400倍視野下每張切片選擇5處陽性細(xì)胞測(cè)定其平均光密度值。

1.2.4 血腦屏障通透性檢測(cè) 將4 mg伊文思藍(lán)融入100 mL生理鹽水中，加入甲酰胺配成溶液濃度分別為8、4、2、1、0.5、0.25和0.125 μg/mL。加入64孔板中，放入酶標(biāo)儀，在632 nm處作出標(biāo)準(zhǔn)曲線。精確稱取腦組織濕重3次取平均值并記錄，浸泡入4 mL甲酰胺溶液中，恒溫水浴箱54℃水浴24 h后，2 400轉(zhuǎn)/分離心5 min，取上清液加入64孔板中，632 nm處檢測(cè)吸光度。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程y=0.0053x+0.0608(R=0.9899)計(jì)算出樣本的伊文思藍(lán)含量（B值），然后測(cè)出腦組織伊文思藍(lán)含量=B×甲酰胺容積(mL)/濕重(g)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以（±s）表示，符合正態(tài)分布且Levene檢驗(yàn)方差齊同，組間比較采用方差分析；若數(shù)據(jù)不服從正態(tài)分布或方差不齊同則行近似F檢驗(yàn)或非參數(shù)秩和檢驗(yàn)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組Purdy評(píng)分變化

NC組在各時(shí)間點(diǎn)均未見明顯神經(jīng)損害；MC組在各時(shí)間點(diǎn)均出現(xiàn)顯著神經(jīng)功能損害，第3天最明顯；與MC組比較，RSG組各時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能均有改善，見圖1。

2.2 各組ET-1表達(dá)情況

NC組ET-1在不同時(shí)間表達(dá)穩(wěn)定，水平較低；與NC組比較，MC組及RSG組ET-1表達(dá)顯著升高，MC組ET-1表達(dá)在第1天即顯著升高，第3天達(dá)高峰，第7天開始明顯下降；與MC組比較，RSG組在相同時(shí)間點(diǎn)ET-1表達(dá)均顯著下降；見圖2、3。

2.3 各組腦組織伊文思藍(lán)含量比較

圖1 各組不同時(shí)間Purdy評(píng)分比較

圖2 各組不同時(shí)間ET-1表達(dá)情況比較

圖3 各組不同時(shí)間血腫周圍腦組織ET-1表達(dá)（×400）

NC組腦組織伊文思藍(lán)含量穩(wěn)定在較低水平；與NC組比較，MC組在各時(shí)間點(diǎn)伊文思藍(lán)含量均顯著升高，表明MC組血腦屏障通透性顯著增加，其中第3天增加最明顯；與MC組比較，RSG組伊文思藍(lán)含量降低，表明羅格列酮病灶區(qū)灌注治療對(duì)血腦屏障有保護(hù)作用；見圖4。

2.4 ET-1表達(dá)水平與血腫周圍腦組織伊文思藍(lán)含量及Purdy神經(jīng)功能評(píng)分相關(guān)性分析

血腫周圍腦組織ET-1表達(dá)水平與伊文思藍(lán)含量及Purdy評(píng)分均呈顯著的正相關(guān)，見圖5。

3 討論

圖4 各組不同時(shí)間伊文思藍(lán)含量比較

圖5 ET-1表達(dá)水平與血腫周圍腦組織伊文思藍(lán)含量（A）及Purdy神經(jīng)功能評(píng)分（B）相關(guān)性分析

研究表明，腦內(nèi)血腫的發(fā)生發(fā)展在ICH后的繼發(fā)性損害發(fā)揮重要作用[3,4]。ICH后破入腦實(shí)質(zhì)的紅細(xì)胞及其裂解產(chǎn)物血紅素分別通過與局部的小膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞膜上的CD36受體和Toll樣受體4結(jié)合，激活小膠質(zhì)細(xì)胞，一方面增強(qiáng)其吞噬作用，另一方面激活細(xì)胞內(nèi)核因子κB（NF-κB），促進(jìn)促炎介質(zhì)及基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）的表達(dá)，促進(jìn)炎癥反應(yīng)及血腦屏障的破壞[4-7]，加重腦損害。缺血性腦損傷研究中證實(shí)活性氧物質(zhì)可以激活PI3K/Akt、MAPK/P38、NFPK通路介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[8]；在ICH的研究中也表明，氧自由基可以導(dǎo)致腦細(xì)胞凋亡增加[9,10]，但具體機(jī)制尚不明確[11]，可能與 PKC/CK2[12]、ERK[13]、JNK[14]、細(xì)胞色素C[15]、MMP-9[15,16]等信號(hào)通路有關(guān)。

ET-1是由21個(gè)氨基酸構(gòu)成的血管活性多肽鏈，是目前已知的最強(qiáng)、最持久的縮血管活性多肽。內(nèi)皮素不僅存在于血管內(nèi)皮，也廣泛存在于各種組織和細(xì)胞中，是調(diào)節(jié)心血管功能的重要因子，對(duì)維持基礎(chǔ)血管張力與心血管系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)起重要作用。ET-1與NO的平衡對(duì)保持正常血管內(nèi)皮功能起到重要作用。ET-1合成釋放增加，導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙，參與高血壓、II型糖尿病、腎病、肺動(dòng)脈高壓、缺血再灌注損傷等多種病理生理過程。ET-1有2種受體分別為ETA和ETB受體，均為G蛋白偶聯(lián)受體。在生理狀態(tài)下，腦組織星型膠質(zhì)細(xì)胞幾乎不表達(dá)ET及受體，但在受到腦缺血、腦外傷、腦炎等病理損害時(shí)，星型膠質(zhì)細(xì)胞可以表達(dá)ET-1、ET-3、ETA及ETB等內(nèi)皮素系統(tǒng)所有成分[17,18]。對(duì)膠質(zhì)細(xì)胞的體外研究表明，ET-1可激活G蛋白偶聯(lián)受體ETB，使細(xì)胞質(zhì)內(nèi)酪氨酸激酶磷酸化，通過P13K/AKt及p42/p44MAPK通路激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，促進(jìn)炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生、iNOS表達(dá)及NO合成，NO通過硝化酪氨酸激活MMP-9[19]，進(jìn)而破壞血腦屏障結(jié)構(gòu)而加重腦水腫[20]。

PPAR-γ是位于細(xì)胞核核膜上的轉(zhuǎn)錄因子，當(dāng)其被激活后與視黃酸受體形成異源二聚體調(diào)控目的基因的轉(zhuǎn)錄[23]。PPAR-γ激活后可抑制NF-κB激活，從而減輕血腫周圍腦組織的炎癥反應(yīng)[23]；PPAR-γ通過激活NrF2通路和促進(jìn)過氧化物酶、超氧化物歧化酶的表達(dá)，減輕ICH后氧化應(yīng)激反應(yīng)[5,24,25]。本課題組前期研究表明，ICH后血腫周圍組織ET-1表達(dá)增加，微創(chuàng)血腫清除治療可降低ET-1表達(dá)并減輕ICH后的繼發(fā)性損害[21,22]。本研究表明，ICH后ET-1表達(dá)增加，給予羅格列酮灌注治療后血腫周圍腦組織ET-1表達(dá)降低，血腦屏障通透性降低，預(yù)后顯著改善，由此推測(cè)羅格列酮可能通過作用于ET-1，進(jìn)而影響下游的變化。

綜上所述，ICH后血腫周圍腦組織ET-1表達(dá)及血腦屏障通透性增加，血腫周圍腦組織ET-1的表達(dá)水平與血腦屏障通透性及神經(jīng)功能損害程度存在相關(guān)性。羅格列酮病灶區(qū)灌注治療可降低血腫周圍腦組織ET-1表達(dá)及血腦屏障通透性，推測(cè)羅格列酮可能部分通過降低ET-1的表達(dá)減輕ICH后的繼發(fā)性損傷，為進(jìn)一步的研究及臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

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