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    硼替佐米對(duì)骨髓瘤細(xì)胞株RPMI8226增殖和凋亡影響的研究

    2018-04-08 03:29:02李錄克時(shí)艷榮趙文華
    癌癥進(jìn)展 2018年1期
    關(guān)鍵詞:佐米骨髓瘤多發(fā)性

    李錄克,時(shí)艷榮,趙文華

    平煤神馬醫(yī)療集團(tuán)總醫(yī)院血液科,河南 平頂山4670000

    多發(fā)性骨髓瘤,又稱骨髓瘤、漿細(xì)胞骨髓瘤、Kaher病,是一種來(lái)源于漿細(xì)胞的惡性腫瘤[1],是因骨髓原始漿細(xì)胞過(guò)度增殖導(dǎo)致的疾病,具有較高的發(fā)病率和病死率[2‐4]。多發(fā)性骨髓瘤是最為常見(jiàn)的血液系統(tǒng)惡性腫瘤之一,也是目前仍不可治愈的一種疾病。硼替佐米(bortezomib)是一種新型抗腫瘤藥物,獲美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)上市[5],用于難治性、復(fù)發(fā)性、多發(fā)性骨髓瘤的治療[6‐7],目前仍是多發(fā)性骨髓瘤的首選治療藥物。但隨著硼替佐米在臨床中的長(zhǎng)期使用,其治療多發(fā)性骨髓瘤的效果越來(lái)越不理想,追其原因是由于多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞對(duì)硼替佐米產(chǎn)生了高度耐藥性使其復(fù)發(fā)[8],其作用機(jī)制迄今仍不完全清楚。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)骨髓瘤細(xì)胞株RPMⅠ8226進(jìn)行體外培養(yǎng),并采用增殖和凋亡實(shí)驗(yàn),觀察細(xì)胞Wnt/β‐catenin 信號(hào)通路相關(guān)蛋白β‐catenin 和 c‐myc及PⅠ3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白Bcl‐2和Bax的表達(dá)情況,進(jìn)一步探討硼替佐米對(duì)多發(fā)性骨髓瘤的調(diào)控機(jī)制,現(xiàn)報(bào)道如下。

    1 材料與方法

    1.1 試劑與儀器

    多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株RPMⅠ8226購(gòu)自美國(guó)模式菌種收集中心(American Type Culture Collec‐tion,ATCC);硼替佐米購(gòu)自西安楊森制藥有限公司;10%胎牛血清購(gòu)自浙江四季青公司;RPMⅠ1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司;MTT和DMSO購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;磷酸鹽緩沖液(PBS)購(gòu)自上海艾睿生物Gibco公司;Trizol購(gòu)自上海Ⅰnvitrogen公司。RNA PCR Kit Ver.3.0、SYBR Premix Ex TaqⅡ和 Annexin V‐FⅠTC/PⅠ試劑盒購(gòu)自德國(guó) Bender公司;Western Blot試劑盒購(gòu)自美國(guó)KPL公司;酶標(biāo)儀購(gòu)自上海BⅠO‐TEK公司。流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD 公司;β‐actin、β‐catenin、c‐myc、Bcl‐2和 Bax 鼠抗人一抗多克隆抗體購(gòu)自上海Santa Cruz公司;兔抗鼠二抗多克隆抗體購(gòu)自中杉金橋生物技術(shù)有限公司。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。低溫高速離心機(jī)和二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(GBB‐16)均購(gòu)自上海Heraeus公司。

    1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

    在含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的RPMⅠ1640培養(yǎng)基中進(jìn)行多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞株RPMⅠ8226的懸浮培養(yǎng)。在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d后換液進(jìn)行傳代培養(yǎng),收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

    1.3 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

    使用MTT法檢測(cè)RPMⅠ8226細(xì)胞的增殖能力。將上述培養(yǎng)的對(duì)數(shù)期細(xì)胞濃度調(diào)至每孔5×103/ml后接種于96孔培養(yǎng)板上,每孔接種100 μl。設(shè)5個(gè)處理組,分別加入終濃度為20、40、60、80及100 nmol/L的硼替佐米,每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,以不含硼替佐米的細(xì)胞作為對(duì)照組,以空白孔調(diào)零,培養(yǎng) 24 h,每 孔 加 入 MTT 100 μl作 用 4 h,加 入DMSO 100 μl孵育30 min。在酶標(biāo)儀570 nm處測(cè)吸光度A值,根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率:抑制率=([A對(duì)照組-A處理組)(/A對(duì)照組-A空白組)]×100%。

    1.4 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)

    設(shè)硼替佐米濃度分別為20、40、60、80和100nmol/L的5個(gè)處理組和1個(gè)不含硼替佐米的對(duì)照組,取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞,分別處理24 h采用后胰酶消化收集細(xì)胞,PBS洗滌,離心。取100 μl細(xì)胞懸浮液加入5 μl Annexin V‐FⅠTC和5 μl PⅠ,置于室內(nèi)避光處理15 min。按照Annexin V FⅠTC/PⅠ試劑盒說(shuō)明書對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色,采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡,計(jì)算細(xì)胞凋亡率。每組重復(fù)3次,計(jì)算平均值。

    1.5 β-catenin、c-myc、Bcl- 2和Bax mRNA表達(dá)

    處理24 h后,收集各組細(xì)胞于1.5 ml離心管中,加入1 ml Trizol,提取總RNA。逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程按照RNA PCR Kit Ver.3.0試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。根據(jù)SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒說(shuō)明書配制PCR反應(yīng)體系25 μl,在熒光定量PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增,于2%瓊脂糖凝膠中對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳,凝膠成像觀察、照相。使用Gel‐pro Analyzer軟件進(jìn)行灰度分析,以灰度反映mRNA的表達(dá)量,以β‐actin為內(nèi)參,mRNA的相對(duì)含量=目的基因條帶灰度值/內(nèi)參基因條帶灰度值,每組重復(fù)3次,計(jì)算平均值。各基因的引物序列,詳見(jiàn)表1。

    表1 各基因的引物序列

    1.6 WesternBlot法檢測(cè)蛋白表達(dá)

    收集經(jīng)0、20、40、60、80和100 nmol/L硼替佐米處理24 h后的RPMⅠ8226細(xì)胞,置于1.5 ml的離心管中,經(jīng)PBS洗滌,充分裂解后,離心,提取總蛋白。其中以0 nmol/L的硼替佐米為對(duì)照組,其他為處理組。電泳結(jié)束后,轉(zhuǎn)膜,封閉,特異性一抗(鼠抗人 c‐myc、β‐catenin、Bcl‐2、Bax 和β‐actin 抗體)4℃孵育過(guò)夜。然后室溫二抗(兔抗鼠)反應(yīng)1 h,ECL顯色,顯影,定影。以β‐actin為內(nèi)參,計(jì)算各組蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

    1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    采用SPSS 19.0軟件對(duì)-數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,兩組間比較采用LSD‐t檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 硼替佐米對(duì)RPMI8226細(xì)胞的增殖抑制作用

    與對(duì)照組(0 nmol/L硼替佐米)相比,不同濃度(20、40、60、80和100 nmol/L)硼替佐米處理組的RPMⅠ8226細(xì)胞增殖抑制率均升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);且細(xì)胞增殖抑制率隨硼替佐米濃度的增加而增大,詳見(jiàn)圖1。經(jīng)計(jì)算,硼替佐米的半抑制濃度(half maximal inhibitory concentra‐tion,ⅠC50)為31.95 nmol/L。

    圖1 不同濃度的硼替佐米對(duì)RPMⅠ8226細(xì)胞的增殖抑制作用

    2.2 硼替佐米對(duì)RPMI8226細(xì)胞的凋亡促進(jìn)作用

    不同濃度(20、40、60、80和100 nmol/L)硼替佐米處理組的RPMⅠ8226細(xì)胞凋亡率分別為(11.80±0.56)%、(19.45±1.25)%、(36.82±2.26)%、(43.56±3.50)%和(56.62±5.02)%,均高于對(duì)照組的(8.02±0.45)%,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。(圖2)

    圖2 硼替佐米對(duì)RPMⅠ8226細(xì)胞的凋亡促進(jìn)作用

    2.3 硼替佐米對(duì) β-catenin、c-myc、Bcl- 2 和 Bax mRNA表達(dá)水平的影響

    處理組c-myc、β-catenin和Bcl-2mRNA的表達(dá)水平低于對(duì)照組,且隨硼替佐米濃度的增加而下降;而BaxmRNA的表達(dá)水平高于對(duì)照組,且隨硼替佐米濃度的增加而升高。(表2)

    2.4 硼替佐米對(duì) β-catenin、c-myc、Bcl- 2和Bax蛋白表達(dá)水平的影響

    處理組β‐catentin、c‐myc和Bcl‐2蛋白的表達(dá)水平低于對(duì)照組,且隨硼替佐米濃度的增加而下降;而Bax蛋白的表達(dá)水平高于對(duì)照組,且隨硼替佐米濃度的增加而升高。(圖3、表3)

    表2 不同濃度的硼替佐米處理后各基因的mRNA表達(dá)水平(± s)

    表2 不同濃度的硼替佐米處理后各基因的mRNA表達(dá)水平(± s)

    注:與對(duì)照組比較,P<0.05

    組別對(duì)照組20 μmol/L 40 μmol/L 60 μl/L 80 μmol/L 100 μmol/L 2.48±0.52 2.02±0.28 1.86±0.31 1.54±0.25*1.12±0.32*0.86±0.18*2.72±0.46 2.26±0.53 1.75±0.38*1.20±0.44*0.92±0.22*0.63±0.23*1.82±0.38 1.28±0.25 0.96±0.30*0.52±0.15*0.31±0.20*0.18±0.16*1.36±0.11 1.52±0.32 1.84±0.24*2.18±0.36*2.62±0.26*2.91±0.42**c‐mycβ‐cateninBcl‐2Bax

    圖3 硼替佐米對(duì) β‐catenin、c‐myc、Bcl‐ 2和Bax蛋白表達(dá)水平的影響

    表3 不同濃度的硼替佐米處理后各蛋白的表達(dá)水平(± s)

    表3 不同濃度的硼替佐米處理后各蛋白的表達(dá)水平(± s)

    注:*與對(duì)照組比較,P<0.05

    組別對(duì)照組20 μmol/L 40 μmol/L 60 μmol/L 80 μmol/L 100 μmol/L c‐myc 1.41±0.38 1.06±0.26 0.88±0.31*0.46±0.23*0.25±0.12*0.08±0.05*β‐catenin 1.26±0.23 1.12±0.18 0.92±0.12 0.76±0.16*0.58±0.10*0.18±0.22*Bax 0.76±0.23 0.83±0.15 0.90±0.11 0.99±0.20 1.03±0.28 1.15±0.35*Bcl‐2 1.21±0.32 0.96±0.16 0.85±0.24 0.66±0.25*0.42±0.16*0.20±0.07*

    3 討論

    多發(fā)性骨髓瘤多發(fā)于65歲左右的老年人,發(fā)病率與性別無(wú)關(guān),隨著社會(huì)老齡化的進(jìn)展,多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)病率呈逐年增加趨勢(shì)[4,9]。多發(fā)性骨髓瘤的主要特征是骨髓中漿細(xì)胞克隆性增殖,分泌片段或單克隆免疫球蛋白,伴有廣泛的感染、貧血、腎功能損害及溶骨病變等臨床表現(xiàn)[10]。多發(fā)性骨髓瘤的治療包括初始治療、干細(xì)胞移植(stem cell transplantation,SCT)、維持治療和復(fù)發(fā)的治療。目前,多發(fā)性骨髓瘤的病因和發(fā)病機(jī)制尚未研究清楚。針對(duì)多發(fā)性骨髓瘤的難治、復(fù)發(fā)等情況,大多采用聯(lián)合用藥方案[11‐14],但均以硼替佐米為主,硼替佐米是26S蛋白酶體抑制劑,通過(guò)阻斷細(xì)胞內(nèi)多種調(diào)控細(xì)胞凋亡及信號(hào)傳導(dǎo)的蛋白質(zhì)的降解,以及多個(gè)通路發(fā)揮著抗腫瘤作用。

    本實(shí)驗(yàn)采用MTT法檢測(cè)硼替佐米對(duì)骨髓瘤細(xì)胞株RPMⅠ8226的增殖抑制作用,與對(duì)照組相比,不同濃度(20、40、60、80和100 nmol/L)硼替佐米處理組的RPMⅠ8226細(xì)胞增殖抑制率均升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);且細(xì)胞增殖抑制率隨硼替佐米濃度的增加而增大,呈劑量效應(yīng)。不同濃度(20、40、60、80和100 nmol/L)硼替佐米處理組的RPMⅠ8226細(xì)胞凋亡率均高于對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。處理組 c‐myc、β‐catenin 及Bcl‐2的mRNA和蛋白表達(dá)水平均低于對(duì)照組,且隨硼替佐米濃度的增加而下降;而Bax的mRNA和蛋白表達(dá)水平均高于對(duì)照組,且隨硼替佐米濃度的增加而升高。

    研究表明,Wnt/β‐catenin信號(hào)通路中c-myc和β-catenin基因的異常變化與多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[15]。硼替佐米通過(guò)抑制NF‐?B信號(hào)通路中Bax和Bcl‐2的活性阻止多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)展[8]。這說(shuō)明,在多發(fā)性骨髓瘤發(fā)生和發(fā)展的過(guò)程中,Wnt/β‐catenin和NF‐κB信號(hào)通路發(fā)揮重要作用。孫紅生[16]在研究硼替佐米對(duì)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制中也得出,硼替佐米可誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞凋亡,抑制Wnt/β‐catenin信號(hào)通路可能是其作用機(jī)制之一。研究已證實(shí)聯(lián)合用藥可提高多發(fā)性骨髓瘤的療效[17],聯(lián)合用藥的作用機(jī)制不盡相同,了解硼替佐米對(duì)骨髓瘤的作用機(jī)制是尋找最好、最有效的治療方案的前提,而其對(duì)骨髓瘤細(xì)胞的作用機(jī)制還需要進(jìn)一步更深入的研究。

    綜上所述,硼替佐米可抑制多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的增殖,促進(jìn)其凋亡,作用機(jī)制可能與調(diào)控Wnt/β‐catenin和PⅠ3K/AKT信號(hào)通路有關(guān)。

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