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    免疫親和柱—超高效液相色譜法測定維生素飲料中維生素B12

    2018-04-04 08:35:30余以剛黃焯枝郭文婷郭偉鵬
    中國食物與營養(yǎng) 2018年3期
    關鍵詞:親和柱色譜法液相

    周 黎,余以剛,徐 紅,黃焯枝,郭文婷,郭偉鵬

    (1華南理工大學,廣州 510006;2達能(中國)食品飲料有限公司,廣州 510000;3省部共建華南應用微生物國家重點實驗室,廣州 510070;4廣東省微生物研究所,廣州 510070;5廣東省微生物分析檢測中心,廣州 510070)

    我國對維生素B12的允許添加量有明確的規(guī)定[1-2],其中飲料類產(chǎn)品的允許添加量為0.6~1.8μg/kg。目前檢測維生素B12的方法主要有微生物法[3]、原子吸收法[4]、高效液相色譜法[5]等。其中,微生物法具有工作效率低、操作復雜、成本較高的缺點;原子吸收法由于受基質(zhì)影響,檢測結果不準確,特別是分析含量低的樣品;高效液相色譜法具有操作簡單、分析準確等優(yōu)點,但是對于成分復雜、維生素含量低的樣品難以進行定量或者定性分析,因此本檢測方法采取對高效液相色譜法進行改進,將超高效液相色譜法結合免疫親和柱對樣品進行分析,免疫親和柱對維生素B12具有較高的選擇性,可以對樣品維生素B12進行純化和富集,再經(jīng)超高效液相色譜法檢測樣品從而達到分析準確、快速、成本低、操作簡單的目的。因此,將免疫親和柱—超高效液相色譜法運用到成分復雜的飲料中低含量維生素B12的測定具有重大的意義。

    1 試驗與材料

    1.1 儀器與試劑

    超高效液相色譜儀(美國Waters公司);超聲波清洗儀,美國Auto science公司;氮吹儀,中國安譜公司;固相萃取儀,美國CNW公司;超純水機,美國Millipore公司;維生素B12標準品,99.9%,美國supelco公司;免疫親和柱,德國拜發(fā)公司;甲酸、乙腈、甲醇、三氟乙酸,色譜純,美國CNW公司;乙醇,分析純,廣州化學試劑廠。

    1.2 色譜條件

    色譜柱HSS T3(2.1mm*75mm,1.8μm,流動相為乙腈-0.1%甲酸梯度洗脫,柱溫35℃,進樣量50μL,流速0.6 mL/min,檢測波長360nm,洗脫溶劑A相為乙腈,B相為0.1%甲酸,梯度洗脫參數(shù)如表1所示。

    表1 流動相梯度時間、流速與比例參數(shù)

    1.3 樣品前處理

    1.3.1標準溶液的配制維生素B12的標準儲備液:稱取維生素B12標準品12.0mg溶于5%的乙醇溶液中,用50mL棕色容量瓶定容,混勻后備用。取1mL標準儲備液用水稀釋至250mL棕色容量瓶中,得到維生素B12的標準中間溶液,再分別取0.5、1.0、2.0、3.0、4.0mL標準中間溶液用水稀釋至1 000mL棕色容量瓶中,得到維生素B12的標準溶液,現(xiàn)配現(xiàn)用。

    1.3.2免疫親和柱純化和富集取25mL維生素飲料進樣到真空處理除去緩沖液的免疫親和柱上,用10mL超純水淋洗后,真空抽干殘留液使親和柱干燥,再用3mL甲醇溶液反沖洗3次(1次反沖洗用1mL甲醇,共3次)。洗脫時控制為1滴/秒的流速滴到試管中,于60~70℃下用氮氣吹干洗脫液,再用0.3mL 0.025%三氟乙酸溶液溶解后得到的溶液用于上機分析。

    2 結果與討論

    2.1 前處理凈化柱的選擇

    維生素飲料經(jīng)免疫親和柱和Watres Sep-Pak C18(500mg/6cc)柱純化后得到的圖譜如圖1和圖2所示。經(jīng)免疫親和柱過濾后的圖譜相比WatresSep-Pak C18(500mg/6cc)柱過濾后的圖譜顯示出更好的分離效果,基線平穩(wěn)且維生素B12出峰無干攏,雜質(zhì)少。因此,為了對維生素飲料中B12進行定性與定量的分析,選擇免疫親和柱過濾純化后得到的樣品進行后續(xù)測定。

    圖1 維生素飲料經(jīng)免疫親和柱過濾后的色譜圖

    圖2    維生素飲料經(jīng)Watres Sep-Pak C18(500mg/6cc)柱過濾后的色譜圖

    2.2 洗脫過程中甲醇量的選擇

    采用4種洗脫方法進行比較確定洗脫過程中最佳的甲醇量:(1)3mL甲醇洗脫1次;(2)1mL甲醇洗脫1次;(3)分別取3次1mL甲醇洗脫3次;(4)分別取3次1mL甲醇反復來回抽到針筒洗脫3次樣品。以上4種洗脫方法速度均為1滴/秒,結果表明,4種洗脫方法的回收率分別為82.1%、65.2%、88.2%、94.3%,故選擇第4種方法比較理想。

    2.3 洗脫過程中pH的選擇

    如圖3所示,pH7.0條件下經(jīng)免疫親和柱富集純化后樣品的維生素B12的含量為0.16μg/100mL左右,而pH3.0條件下經(jīng)免疫親和柱富集純化后樣品的維生素B12的含量為0.12μg/100mL左右。結果表明,pH7.0條件下更有利于免疫親和柱對維生素B12的富集和洗脫,因此選擇調(diào)整維生素飲料的pH為7.0時進行免疫親和柱富集和洗脫。

    圖3    維生素飲料在pH 3.0和pH 7.0條件下經(jīng)免疫親和柱洗脫后維生素B12含量的變化情況

    2.4 樣品的保存與分析

    將同一批次生產(chǎn)的維生素飲料分別于20℃、45℃和日光燈條件下存放1個星期,所測得的維生素B12含量結果見表2。不同條件下放置的樣品維生素B12的含量依次為20℃>45℃>日光燈,表明光照以及高溫會加速維生素B12的分解,因此含有維生素B12的維生素飲料更適合在20℃室溫與避光條件下存放。

    表2維生素飲料的維生素B12含量單位:μg/L

    條件20℃45℃日光燈含量145125113

    2.5 線性關系及回收率實驗

    在濃度為0.4~10μg/L內(nèi)測定維生素B12的標準曲線,所得的線性回歸方程為Y=4 040X-364,相關系數(shù)為0.997 00,顯示出較好的線性關系。同時對樣品進行含量分析,在已知濃度的樣品中加入標準溶液重復測定4次,加入值為30.1μg/L時,測定值為28.5μg/L,所得回收率為94.68%,檢出限為0.1μg/L,顯示出較高的準確性。表明運用免疫親和柱—超高效液相色譜法測定維生素飲料中低濃度維生素B12的含量是非常準確可靠的。

    2.6 系統(tǒng)精密度試驗

    同一瓶維生素飲料,在1d內(nèi)連續(xù)測定6次,其精密度數(shù)據(jù)如表3所示,維生素B12的峰面積的RSD為0.65%,精密度良好。說明免疫親和柱—超高效液相色譜法測定維生素飲料中低濃度維生素B12的含量具有較高的精密度,因此該方法應用到維生素飲料中低濃度維生素B12的含量測定是切實可行的。

    表3 樣品精密度

    3 結論

    針對維生素飲料中成分復雜、維生素B12含量很低的特點,直接采用超高效液相色譜法測定維生素B12很難對其進行定性或定量的分析,因此本研究建立了免疫親和柱—超高效液相色譜法測定維生素飲料中B12的方法。由于免疫親和柱對維生素B12具有很高的選擇性,可以有效的去除雜質(zhì)的干擾,對維生素B12進行純化。同時根據(jù)儀器與色譜柱的特性,采用乙腈-0.1%甲酸溶液梯度洗脫樣品,具有較好分離效果,基線穩(wěn)定。結果表明,采用免疫親和柱—超高效液相色譜法測定維生素飲料中維生素B12具有較高的回收率為94.68%,且檢出限低至0.1μg/mL。因此該檢測方法非常適用于成分復雜、結構復雜、維生素含量低的飲料中維生素B12的測定,相比傳統(tǒng)的高效液相色譜法具有工作效率高、分析時間短且更準確的優(yōu)點?!?/p>

    [1]吳楠,姜金斗,等.免疫親和柱凈化/高效液相色譜法測定乳粉中B12的含量[J].分析測試學報,2013,32(3):389-392.

    [2]中華人民共和國衛(wèi)生部.GB 2760-2011 食品安全國家標準食品添加劑使用標準[S].北京:中國標準出版社,2011.

    [3]中華人民共和國衛(wèi)生部.GB 5413.14-2010 食品安全國家標準嬰幼兒食品和乳品中維生素B12的測定[S].北京:中國標準出版社,2010.

    [4]李妹.紫外吸光光度法測定維生素B12[J].理化檢驗(化學分冊),2005,41(1):53-54.

    [5]中華人民共和國衛(wèi)生部.GB/T5009.217-2008保健食品中維生素B12的測定[S].北京:中國標準出版社,2008.

    [6]姜學群.高效液相色譜法測定維生素B12片的含量[J].咸寧學院學報(醫(yī)學版),2010,24(1):70-72.

    [7]高旭.高效液相色譜法同時測定食品中8種水溶性維生素[J].中國醫(yī)藥指南,2008,6(19):36-39.

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