旋毛蟲肌幼蟲蟲體蛋白對(duì)小細(xì)胞肺癌H446細(xì)胞凋亡的影響

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肺癌在全球腫瘤相關(guān)死亡原因中占據(jù)首位，是我國(guó)第4大主要死亡原因，其發(fā)病率和死亡率均高，并呈逐年上升趨勢(shì)。據(jù)2016年國(guó)際癌癥研究中心報(bào)告顯示，在2012年全球由于肺癌造成的死亡人數(shù)達(dá)160萬(wàn)人，占惡性腫瘤死亡病例的19%。肺癌種類較多，小細(xì)胞肺癌 (small cell lung cancer, SCLC)屬于其中一種，占肺癌總比例15%～18%，侵襲性強(qiáng)，惡性程度高，對(duì)化療最敏感[1]。研究學(xué)者發(fā)現(xiàn)，旋毛蟲(T.spiralis)具有抑制腫瘤作用，且有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，旋毛蟲感染可以體內(nèi)抵抗腫瘤[2]。旋毛蟲排泄分泌產(chǎn)物通過激活機(jī)體的固有免疫細(xì)胞、 產(chǎn)生細(xì)胞因子或腫瘤相關(guān)活性物質(zhì)，從而可以體外抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[3]，因此為腫瘤生物治療的研究提供了一個(gè)方向[4]。旋毛蟲生活史包括3個(gè)階段，成蟲、新生幼蟲和肌幼蟲，其中肌幼蟲寄生在宿主肌肉組織內(nèi)。在旋毛蟲感染過程中肌幼蟲較成蟲和新生幼蟲易獲取，羅婧梅[5]等實(shí)驗(yàn)表明，旋毛蟲肌幼蟲排泄分泌蛋白(ESP)有抗腫瘤活性物質(zhì)，而旋毛蟲蟲體蛋白是否對(duì)小細(xì)胞肺癌H446細(xì)胞的增殖有抑制作用,以及是否誘導(dǎo)其凋亡，為本實(shí)驗(yàn)的研究目的。

1　材料與方法

1.1旋毛蟲、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞株實(shí)驗(yàn)所用旋毛蟲為河南豬源旋毛蟲，由本實(shí)驗(yàn)室小鼠保種。6周齡健康小鼠，清潔級(jí)，雌性昆明小鼠，體重20-25 g，購(gòu)自本校動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。H446細(xì)胞株購(gòu)自上海北諾生物科技有限公司。

1.2旋毛蟲肌幼蟲的收集和蟲體蛋白的制備昆明小鼠經(jīng)口感染300條肌幼蟲45 d后頸椎離斷處死。參照文獻(xiàn)[6]的方法收集純凈的旋毛蟲肌幼蟲。肌幼蟲用含500 U/mL青鏈霉素的無(wú)菌生理鹽水反復(fù)清洗3次，將蟲體于4 ℃和-20 ℃反復(fù)凍存5次，用勻漿器冰上研磨蟲體30 min，鏡下觀察蟲體徹底分離斷開即可，收集研磨后的液體于4 ℃過夜，12 000 r/min、4 ℃離心30 min，取上清即為蟲體蛋白，0.22 μm濾器過濾后分裝，-80 ℃保存。

1.3H446細(xì)胞的培養(yǎng)與傳代將于-80 ℃冰箱保存的H446細(xì)胞取出，迅速放入37 ℃水中快速搖晃直至完全溶解，再放入普通離心機(jī)以1 000 r/min速度離心 3 min，棄掉凍存液。加入1 mL配好的含10%血清和1%青鏈霉素混合液的RPMI1640培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞后移入培養(yǎng)皿中放入37 ℃、CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。每2 d更換含血清的RPMI1640培養(yǎng)基，待細(xì)胞長(zhǎng)到培養(yǎng)皿的70%～80%，即可用含0.25%胰酶消化細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞傳代，3次傳代后取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞待用。

1.4MTT法檢測(cè)H446細(xì)胞增殖抑制率收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期H446細(xì)胞，調(diào)整為8×104/mL的細(xì)胞密度，按每孔100 μL接種于96孔培養(yǎng)板，于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，實(shí)驗(yàn)組蟲體蛋白濃度分別為0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL、1.0 mg/mL、1.2 mg/mL的RPMI1640培養(yǎng)基，陰性對(duì)照組更換為不含蟲體蛋白的RPMI1640培養(yǎng)基，每孔200 μL，每組各設(shè)5個(gè)復(fù)孔。分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后加入20 μL MTT(5 mg/mL)，37 ℃培養(yǎng)4 h后棄掉培養(yǎng)基，加入150 μL DMSO，振板10 min，通過酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度(A490值)的OD值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次，計(jì)算抑制率和半數(shù)抑制率(IC50)的濃度。抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/陰性對(duì)照組OD值)×100%。

1.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)H446細(xì)胞凋亡率收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期H446細(xì)胞，取1×106/mL的細(xì)胞密度接種于6 cm培養(yǎng)皿中，過夜培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后棄掉培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組用含 0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL蟲體蛋白的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，同時(shí)設(shè)立不含蟲體蛋白的RPMI1640培養(yǎng)基的陰性對(duì)照組。蟲體蛋白作用24 h后收集H446細(xì)胞并計(jì)數(shù)，用1×Buffer調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL，每組各取100 μL細(xì)胞放入流式BD管，加入5 μL Annexin V FITC和5 μL PI染色抗體，室溫避光孵育15 min，補(bǔ)加400 μL Buffer，過300鉬尼龍網(wǎng)上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.6Real-timePCR檢測(cè)Cyt-C、Apaf-1 mRNA表達(dá)情況將對(duì)數(shù)期H446細(xì)胞接種到6孔板，CO2培養(yǎng)箱孵育過夜貼壁，實(shí)驗(yàn)組分別加入0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL蟲體蛋白，陰性對(duì)照組加入不含血清1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后按TRIzol 試劑說明書提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度儀檢測(cè)RNA的濃度。依照TAKARA RT-PCR試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。取1 μg 總RNA 為模板反轉(zhuǎn)錄成cDNA， 反應(yīng)條件為：37 ℃反轉(zhuǎn)錄15 min,95 ℃ 5 s,4 ℃。后續(xù)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s，退火60 s。引物序列見表1。

表1Cyt-C、Apaf-1、GAPDH引物序列
Tab.1Primer sequence of Cyt-C, Apaf-1 and GAPDH

基因名稱Genename序列Sequence擴(kuò)增片段長(zhǎng)度/bpAmplifiedfragmentlengthCyt?C上游引物5′?ACACCTGACCAGAAACTTTGTCTCC?3′下游引物5′?GCCAAAGCAGCAGCTCAGTATGTA?3′79Apaf?1上游引物5′?GCCAGTGCCAAGATGCACA?3′下游引物5′?ATCAGATGAGCAGGGCCTACAAG?3′95GADPPH上游引物5′?GCACCGTCAAGGCTGAGAAC?3′下游引物5′?TGGTGAAGACGCCAGTGGA?3′138

1.7Western blot檢測(cè)Cyt-C、Apaf-1蛋白表達(dá)情況將對(duì)數(shù)期H446傳代到100 mm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞長(zhǎng)到70%～80%，實(shí)驗(yàn)組分別加入0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL蟲體蛋白，陰性對(duì)照組加入不含血清1640培養(yǎng)基，作用24 h后按細(xì)胞裂解液說明書提取細(xì)胞總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。每孔加樣100 μg，電壓80 V轉(zhuǎn)120 V進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，穩(wěn)流冰浴電轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，5%脫脂奶粉封閉3 h，室溫下與兔抗人Cyt-C、Apaf-1、β-actin單克隆抗體分別孵育2 h后，4 ℃過夜。TBST洗膜3次，每次10 min，二抗室溫孵育1.5 h。TBST洗膜3次，每次10 min。使用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光(ECL) 試劑盒按照說明進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。應(yīng)用Quntity One 4.62 軟件對(duì)蛋白質(zhì)印跡條帶進(jìn)行定量分析。

2　結(jié)　果

2.1MTT對(duì)H446細(xì)胞增殖抑制率MTT結(jié)果顯示，蟲體蛋白對(duì)H446細(xì)胞有明顯的抑制作用，并隨著劑量增大和時(shí)間的延長(zhǎng)，蟲體蛋白對(duì)H446細(xì)胞的抑制作用也在增加，呈現(xiàn)出劑量-時(shí)間依賴性,見表2。

2.2流式細(xì)胞術(shù)誘導(dǎo)H446細(xì)胞凋亡利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，蟲體蛋白作用于H446細(xì)胞24 h后，實(shí)驗(yàn)組濃度分別為0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL的蟲體蛋白凋亡率高于對(duì)照組(P<0.05)見表3，圖1。

2.3Real-time PCR及Western blot檢測(cè)Cyt-C、Apaf-1 mRNA和蛋白表達(dá)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組Cyt-C、Apaf-1 mRNA和蛋白的表達(dá)均高于對(duì)照組(圖2、圖3)。各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較，均有差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表4。

蟲體蛋白濃度Polypideproteinconcentration(mg/mL)24h48h72h0．26．5±5．37?8．1±5．67?10．9±6．74?0．411．83±4．56?14．3±3．3?15．6±1．15?0．619．8±4．84?28．1±1．61?43．36±2．87?0．833．03±1．87?39．87±6．15?54．97±7．97?1．037．03±3．3?56．83±3．58?71．97±5．25?1．249．26±1．3?70．13±6．85?85．07±5．89?

注：P<0.05。

組別Group凋亡率ApoptosisrateControl6．49±1．120．2mg/mL14．67±0．47?0．4mg/mL20．32±1．28?0．6mg/mL25．1±2．98?

注：P<0.05。

A為對(duì)照組，B為0.2 mg/mL蟲體蛋白組，C為0.4 mg/mL蟲體蛋白組，D為0.6 mg/mL蟲體蛋白組A is control group, B is 0.2 mg/mL somatic protein group, C is 0.4 mg/mL somatic protein group, and D is 0.6 mg/mL somatic protein group 圖1　蟲體蛋白誘導(dǎo)H446細(xì)胞凋亡Fig.1　Somatic proteins induced apoptosis on H446 cell

圖2　Cyt-C和Apaf-1 mRNA表達(dá)Fig.2　mRNA expression of Cyt-C and Apaf-1

表4各組Cyt-C和Apaf-1與對(duì)照組相比的結(jié)果
Tab.4Results of Cyt-C and Apaf-1 in each group conpare with the contrd group

組別GroupCyt?CApaf?1control110．4mg/mL1．37±0．14?1．43±0．1?o．6mg/mL1．47±0．12?1．52±0．12?0．8mg/mL1．85±0．33?1．95±0．33?

注：*P<0.05。

圖3　Cyt、Apaf-1、Actin蛋白表達(dá)Fig.3　The protein expression of Cyt-C, Apaf-1 and Actin

3　討　論

腫瘤生物制劑的發(fā)現(xiàn)已經(jīng)成為當(dāng)今研究熱點(diǎn)。有研究發(fā)現(xiàn)，天然抗腫瘤活性物質(zhì)存在于多種生物中，如喜樹堿、鬼臼毒素、苔蘚蟲素-1、苦參堿等天然抗腫瘤藥物[7]，此外一些寄生蟲如棘阿米巴滋養(yǎng)體[8]、瘧原蟲[9]、旋毛蟲[10]也發(fā)現(xiàn)對(duì)多種腫瘤有抵抗作用。旋毛蟲蟲體感染或其分泌物、提取物與抑制腫瘤的研究越來越多。旋毛蟲的生活史經(jīng)歷成蟲、新生幼蟲和肌幼蟲3個(gè)階段，成蟲寄生于宿主的小腸，產(chǎn)出新生幼蟲，研究表明，旋毛蟲的成蟲和新生幼蟲有抑制腫瘤增殖的作用[11]，但是成蟲和新生幼蟲在腸道生活時(shí)間較短，不易獲得，旋毛蟲肌幼蟲寄生于肌肉組織中，較成蟲和新生幼蟲更易獲取。Luo JM[12]等研究發(fā)現(xiàn)旋毛蟲肌幼蟲排泄分泌蛋白(ESPs)能夠通過線粒體凋亡通路誘導(dǎo)H446腫瘤細(xì)胞的凋亡。劉箐等[13]以BALB/c裸鼠右側(cè)腋下注射人肝癌H7402細(xì)胞為研究對(duì)象，探討旋毛蟲A200711蛋白對(duì)BALB/c裸鼠皮下人肝H7402細(xì)胞實(shí)體瘤的抑制作用, 建立裸鼠實(shí)體瘤模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，注射A200711蛋白的對(duì)照組12d后裸鼠實(shí)體瘤體積明顯縮小，抑瘤率達(dá)到 39.67%，證實(shí)了旋毛蟲蟲體蛋白A200711可調(diào)控腫瘤細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)選用旋毛蟲肌幼蟲蟲體蛋白作為研究對(duì)象，應(yīng)用MTT和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，結(jié)果表明旋毛蟲肌幼蟲蟲體蛋白對(duì)小細(xì)胞肺癌H446細(xì)胞增殖有抑制作用，并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，Cyt-C和Apaf-1高表達(dá)。

Cyt-C是線粒體中第一個(gè)被鑒定出在細(xì)胞凋亡過程中起重要作用的細(xì)胞凋亡因子[14]。線粒體受損之后導(dǎo)致Cyt-C釋放，Cyt-C從線粒體釋放到胞質(zhì)中，并且與Apaf-1結(jié)合，聚集ProCaspase-9，形成Cyt-C,Apaf-1,ProCaspase-9三者的復(fù)合物，即“凋亡復(fù)合體”，導(dǎo)致Caspase-3活化切割底物使細(xì)胞凋亡。其中，Cyt-C是唯一能啟動(dòng)Apaf-1的凋亡分子，發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[15]。Apaf-1是線粒體凋亡途徑中的一個(gè)促凋亡因子，是重要的腫瘤抑制基因，是凋亡復(fù)合體的核心，在凋亡復(fù)合體的形成過程中起關(guān)鍵作用，其表達(dá)升高可恢復(fù)腫瘤細(xì)胞凋亡的敏感性[16]。Apaf-1作為線粒體凋亡途徑中的核心組成部分，它的變化與細(xì)胞凋亡的程度呈正相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)中線粒體凋亡因子Cyt-C、Apaf-1高表達(dá)，考慮旋毛蟲肌幼蟲蟲體蛋白可能會(huì)通過線粒體內(nèi)源性凋亡途徑誘導(dǎo)H446細(xì)胞發(fā)生凋亡。本研究結(jié)果為尋找抗腫瘤藥物提供了新設(shè)想，為腫瘤生物治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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