空腸彎曲菌喹諾酮類抗生素敏感性檢測及其耐藥機理分析

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彎曲菌是主要的食源性病原菌，主要導(dǎo)致人類細(xì)菌性腸炎[1-2]。在歐美等發(fā)達(dá)國家，彎曲菌病是報道最多的食源性胃腸道疾病，其發(fā)病率甚至超過了沙門菌、志賀氏菌以及大腸桿菌O157∶H7[3-5]。彎曲菌病通常是自限性疾病，但是對于免疫力低下及病程遷延不愈的患者進(jìn)行抗生素的治療是必須且有效的[6]。氟喹諾酮類藥物(如環(huán)丙沙星)和大環(huán)內(nèi)酯類藥物(如紅霉素)是臨床上治療彎曲菌病的首選藥物[7]。但是目前彎曲菌對氟喹諾酮類抗生素耐藥嚴(yán)重。2013年，美國CDC將耐氟喹諾酮類和大環(huán)內(nèi)酯類彎曲菌列為影響公共衛(wèi)生的耐藥威脅之一[8]。2017年，WHO將氟喹諾酮耐藥彎曲菌列為優(yōu)先2級(高度耐藥)[9]。

研究發(fā)現(xiàn)在編碼DNA回旋酶的gyrA基因內(nèi)有一個被稱之為熱點的喹諾酮類耐藥決定區(qū)(QRDR)[10]。在這個區(qū)域內(nèi)發(fā)生突變是彎曲菌產(chǎn)生喹諾酮耐藥的主要原因。另外研究發(fā)現(xiàn)，主動外排系統(tǒng)與多種抗生素的耐藥相關(guān)，可以造成彎曲菌的多重耐藥，也是導(dǎo)致彎曲菌對氟喹諾酮類抗生素耐藥的另一個重要的機制[11]。為進(jìn)一步了解近年我國不同宿主來源分離菌株喹諾酮類耐藥現(xiàn)狀及耐藥機理機制，本研究通過對近期分離菌株萘啶酸、環(huán)丙沙星敏感性的分析以及耐藥菌株gyrA基因，gyrB基因的DNA序列分析，獲得我國近期分離菌株喹諾酮類抗生素耐藥現(xiàn)狀及主要耐藥機理。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗菌株分離于2015-2017年不同宿主來源234株空腸彎曲菌菌株，其中98株來源于腹瀉病人，20株來源于雞糞，59株來源于牛糞，46株來源于食品動物(雞肉，雞胗，雞腎，雞肝，豬肉)，11株來源于鴨糞。質(zhì)控菌株C.jejuni(ATCC33560)為本研究室保存。

1.1.2試劑CAMPYLOBACTER AGAR BASE (Karmali) (CM0935)購自O(shè)XOID公司，脫纖維羊血購自北京蘭博瑞生物制品有限公司，DNA提取試劑盒QIAamp DNA Mini Kit (250)購自QIAGEN(北京)公司，Gelred 10 000×染料(Cat: 41003, Lot: 11G0127) 購自美國BIOTIUM公司，2×EsayTaq PCR SurperMix(CAT:AS111)購自全式金生物技術(shù)有限公司，Trans2K DNA Marker(BM101)購自全氏金生物技術(shù)有限公司，Regular Agarose G-10 (LOT:111860)購自法國BIOWEST公司，彎曲菌瓊脂稀釋法抗生素最低抑菌濃度(MIC)檢測試劑盒(ZC-CAMPY-013)購自青島中創(chuàng)生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)菌培養(yǎng)及藥敏試驗將菌株接種于含有 5%脫纖維羊血的Karmali培養(yǎng)基上，置于37 ℃微需氧(5%O2、10%CO2、85%N2)條件下培養(yǎng)48 h，挑取3代單克隆后增菌[12]。

根據(jù)CLSI推薦的彎曲菌瓊脂稀釋法(Agar Dilution Method)對菌株進(jìn)行藥敏試驗。ATCC33560作為質(zhì)控菌株。37 ℃微需氧培養(yǎng)48 h后讀取結(jié)果。根據(jù)NARMS-2014規(guī)定，萘啶酸≤16 μg/mL為敏感，32 μg/mL為中介，≥64 μg/mL為耐藥；環(huán)丙沙星≤1 μg/mL為敏感,2 μg/mL為中介，≥4 μg/mL為耐藥。

1.2.2gyrA和gyrB基因篩查gyrA基因篩查所用的引物：上游引物：5′-ATAGGTCGTGCTTTGCC-3′,下游引物：5′-GCTCTCATCTCTTACTTCAGA-3′，產(chǎn)物長度為700 bp；gyrB基因篩查所用的引物：上游引物5′-ATGGCAGCTAGAGGAAGAGA-3′，下游引物5′-GTGATCCATCAACATCCGCA-3′，產(chǎn)物長度為650 bp。50 μL PCR反應(yīng)體系：2×EsayTaq PCR SurperMix 25 μL,上游引物(10 μmol/L)2.0 μL, 下游引物(10 μmol/L)2.0 μL，模板200 ng。按照以下程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，并送天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司測序。

1.2.3統(tǒng)計學(xué)分析采用SAS9.4軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行導(dǎo)入、整理和分析。對不同宿主來源菌株耐藥情況進(jìn)行卡方檢驗分析，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2　結(jié)　果

2.1藥敏試驗結(jié)果234株空腸彎曲菌中共篩查到218株(93.16%)萘啶酸耐藥菌株，其中雞糞來源菌株耐藥率是100.00%，鴨糞來源菌株耐藥率是100.00%，腹瀉病人糞便來源菌株耐藥率是97.96%，食品動物來源菌株耐藥率是97.83%，牛糞來源菌株耐藥率是77.97%，耐藥率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，鴨糞和雞糞來源菌株耐藥率最高；211株(90.17%)環(huán)丙沙星耐藥菌株，其中雞糞和鴨糞來源菌株耐藥率均為100%，食品動物來源菌株耐藥率是95.65%，腹瀉病人糞便來源菌株耐藥率是91.84%，牛糞來源菌株耐藥率是77.97%，耐藥率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，雞糞和鴨糞來源菌株耐藥率最高。結(jié)果見表1。

表1空腸彎曲菌對萘啶酸和環(huán)丙沙星的耐藥情況
Tab.1Resistance for nalidixic acid and ciprofloxacin of Campylobacter jejuni

AntibioticsResistantisolates(%)Total(n/T)Humanfeaces(n/T)Chickenfeaces(n/T)Cowfeaces(n/T)Duckfeaces(n/T)Foodanimal(n/T)Nalidixicacid93．16(218/234)97．96(96/98)100．00(20/20)77．97(46/59)100(11/11)97．83(45/46)Ciprofloxacin90．17(211/234)91．84(90/98)100．00(20/20)77．97(46/59)100(11/11)95．65(44/46)

n, 耐藥菌株的數(shù)量；T, 檢測菌株的總數(shù)量

2.2基因測序分析結(jié)果選擇對萘啶酸(MIC≥64 μg/mL)或環(huán)丙沙星(MIC≥4 μg/mL)其中一種藥物耐藥或者是同時耐藥的菌株共102株進(jìn)行g(shù)yrA基因和gyrB基因測序；選取空腸彎曲菌敏感菌株(萘啶酸MIC≤16 μg/mL并且環(huán)丙沙星MIC≤1 μg/mL)共27株進(jìn)行g(shù)yrA基因測序。測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)：

2.2.1耐藥菌株gyrA基因相關(guān)區(qū)域測序共發(fā)現(xiàn)23個突變位點，其中有義突變5個,分別是Thr-86-Ile，Val-149-Ile，Ser-203-Asn，Thr-206-Ala，Lys-285-Arg。所有耐藥菌株都存在Thr-86-Ile點突變，但所有敏感菌株不存在該點突變。除Thr-86-Ile突變外，耐藥菌株在Val-149-Ile，Ser-203-Asn，Thr-206-Ala，Lys-285-Arg位點也存在有義突變，但這些突變位點均不在喹諾酮類耐藥決定區(qū)范圍內(nèi)(區(qū)間：69-120)[13]。并且與耐藥菌株相比，敏感菌株在Ser-203-Asn，Thr-206-Ala，Lys-285-Arg 3個點也存在有義突變，表明這3個點的突變均可能與耐藥無關(guān)。gyrA基因突變的詳細(xì)結(jié)果見表2。

2.2.2耐藥菌株gyrB基因相關(guān)區(qū)域測序顯示不存在有義突變，92.16%(94/102)的耐藥菌株存在Arg-389-Arg突變，89.22%(91/102)的耐藥菌株存在Leu-403-Leu突變，但都屬于無義突變。

表2耐藥及敏感空腸彎曲菌gyrA基因突變特征
Tab.2Mutations in the gyrA for both the resistant and sensitive C.jejuni

MutationResistantisolatesSensitiveisolatesThr?86?IleVal?149?IleSer?203?AsnThr?206?AlaLys?285?ArgSer?203?AsnThr?206?AlaLys?285?ArgIsolatesNo．102628997162710Proportion/%1005．8813．5997．066．867．771009．80

3　討　論

研究發(fā)現(xiàn)在臨床和獸醫(yī)藥中的不規(guī)范使用是導(dǎo)致彎曲菌喹諾酮類抗生素耐藥率升高的最主要原因[7]。歐美等發(fā)達(dá)國家彎曲菌對喹諾酮類抗生素的耐藥率要低于發(fā)展中國家。美國耐環(huán)丙沙星彎曲菌在1990年開始出現(xiàn)，1997年開始呈現(xiàn)增加趨勢[14]，2001-2002年美國腹瀉病人糞便源彎曲菌環(huán)丙沙星的耐藥率為13.5%，雞來源環(huán)丙沙星耐藥率為19%[15]。2011-2013年加拿大對腹瀉病人源空腸彎曲菌的耐藥率為30.8%，對結(jié)腸彎曲菌的耐藥率是41%[16]。印度在上個世紀(jì)90年代開始出現(xiàn)耐氟喹諾酮類彎曲菌[17]，在1994年未有對氟喹諾酮類耐藥彎曲菌的相關(guān)報道，2001-2006年升高到79%[17-18]2008-2010年高達(dá)到97%，耐藥情況非常嚴(yán)重[19]。

我國空腸彎曲菌對喹諾酮類抗生素的耐藥情況非常嚴(yán)重。1995-2010年腹瀉病人來源的空腸彎曲菌對環(huán)丙沙星的耐藥率為80.2%，對萘啶酸的耐藥率為79.3%，且隨著時間的推移，萘啶酸和環(huán)丙沙星的MIC有明顯增高的趨勢[20]。858株不同宿主來源的空、結(jié)腸彎曲菌對喹諾酮類抗生素的耐藥率接近95%[21]。2011年我國寧夏和山東兩個地區(qū)豬來源的結(jié)腸彎曲菌對環(huán)丙沙星的耐藥率高達(dá)95%以上[22]。最近研究表明，耐喹諾酮類彎曲菌在17年內(nèi)增長迅速，在2000年就增長到93.7%-100%[23]。本研究中，234株空腸彎曲菌中共篩查到218株(93.16%)萘啶酸耐藥菌株，211株(90.17%)環(huán)丙沙星耐藥菌株，兩者都是鴨糞和雞糞來源菌株耐藥率最高為100.00%，是和在家禽的養(yǎng)殖過程中萘啶酸和環(huán)丙沙星作為飼料添加劑用于預(yù)防和治療細(xì)菌性疾病有關(guān)系。

空腸彎曲菌對喹諾酮類抗生素的耐藥與gyrA基因上QRDR特異性點突變密切相關(guān)[24-26]，且最重要最常見的是gyrA基因發(fā)生的Thr-86-Ile突變[27-30]。本研究中所有的耐喹諾酮類空腸彎曲菌均有Thr-86-Ile突變，且1株菌只發(fā)生Thr-86-Ile突變，其萘啶酸的MIC可達(dá)到512 ug/mL，環(huán)丙沙星MIC達(dá)到32 ug/mL，說明Thr-86-Ile突變是導(dǎo)致空腸彎曲菌對氟喹諾酮類抗生素的高水平耐藥的主要原因。

與喹諾酮類敏感菌株相比，耐喹諾酮類空腸彎曲菌除Thr-86-Ile突變外，Val-149-Ile也是特異性突變，雖然Val-149-Ile突變已有報道，但并未描述該突變是否可導(dǎo)致空腸彎曲菌對喹諾酮類抗生素高水平耐藥[29]。本研究中發(fā)生Val-149-Ile協(xié)同突變的菌株和未發(fā)生協(xié)同突變菌株相比，MIC值沒有增高。本研究測序結(jié)果顯示：菌株萘啶酸MIC值大于等于64 μg/mL，環(huán)丙沙星MIC值大于等于4 μg/mL時Thr-86-Ile已經(jīng)發(fā)生突變；而菌株的萘啶酸MIC值大于64 μg/mL，環(huán)丙沙星MIC值為2 μg/mL時，也發(fā)生Thr-86-Ile突變，提示菌株gyrA基因發(fā)生Thr-86-Ile突變就可以導(dǎo)致萘啶酸和/或環(huán)丙沙星耐藥。

本研究中，未發(fā)現(xiàn)耐藥菌株存在gyrB基因的有義突變。研究結(jié)果與目前耐喹諾酮類空腸彎曲菌gyrB基因不存在有意義突變的報道一致[28]。

本研究通過對不同宿主來源空腸彎曲菌萘啶酸及環(huán)丙沙星的耐藥現(xiàn)狀及遺傳特點分析，確定所有耐藥菌株均存在gyrA基因QRDR的熱點突變Thr-86-Ile，該突變能引起空腸彎曲菌對喹諾酮類抗生素產(chǎn)生高水平耐藥。

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