氣相色譜法測定己酸菌發(fā)酵液中的己酸等有機(jī)酸含量

袁華偉 ，楊澤剛 ，蘭著璽 ，游　玲 ，劉光錢 ，胡永奇 ，3，王松濤 ，3，沈才洪 ，3

（1.宜賓學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，四川宜賓 644000； 2.瀘州老窖股份有限公司，四川瀘州 646000；3.國家固態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心，四川瀘州 646000）

白酒中的有機(jī)酸可以調(diào)節(jié)口味使酒體醇和爽口，更主要的是酸類物質(zhì)是形成相對應(yīng)的乙酯類香味成分的前體物質(zhì)。不同的有機(jī)酸與醇在微生物酶的催化作用下，生成不同的酯，沒有有機(jī)酸就沒有相對應(yīng)的酯類物質(zhì)生成。其中己酸乙酯在濃香型白酒中的含量最高，對濃香型白酒的貢獻(xiàn)也最大，是濃香型白酒的主體香味物質(zhì)，也是判定濃香型白酒質(zhì)量等級的關(guān)鍵指標(biāo)[1]。同時，己酸乙酯也是醬香型白酒三大典型原酒之一的窖底香型中最突出的香味物質(zhì)，賦予其芳香濃郁的顯著特征[2]。在白酒特定的釀造環(huán)境下，己酸乙酯主要是在窖池內(nèi)通過微生物的酯化作用合成。由己酸菌產(chǎn)生的己酸和酵母菌產(chǎn)生的乙醇生物合成[3-4]。由于己酸菌的生長速度緩慢，生長繁殖需要嚴(yán)格的厭氧條件，所以研究濃香型白酒中的產(chǎn)酸細(xì)菌重點(diǎn)在己酸菌[5-6]。己酸菌培養(yǎng)液中己酸等有機(jī)酸的組成及其含量往往隨菌種的種類、純度和發(fā)酵工藝的不同而不同，分析其中的有機(jī)酸組成與含量對開發(fā)己酸菌菌種資源、完善己酸菌發(fā)酵生產(chǎn)工藝條件和科學(xué)指導(dǎo)白酒生產(chǎn)都具有重要意義。因此，己酸菌在篩選、培養(yǎng)過程中如何快速、準(zhǔn)確測定發(fā)酵液中的己酸等有機(jī)酸的含量是非常值得研究的。

目前測定己酸菌發(fā)酵液中己酸的方法主要有：以醋酸銅與己酸反應(yīng)生成藍(lán)色己酸銅沉淀，被乙醚抽提出來使乙醚層呈現(xiàn)藍(lán)色的顯色反應(yīng)為原理的比色法[7-8]；己酸菌發(fā)酵液進(jìn)行蒸餾后，在毛細(xì)管色譜柱上直接進(jìn)樣檢測[9]；經(jīng)乙醚萃取后用非極性毛細(xì)管色譜柱分析的氣相色譜法[10]。比色法分析發(fā)酵液中的己酸含量時，培養(yǎng)基中醋酸鈉及其他有機(jī)酸的存在對己酸定性顯色反應(yīng)有影響[11-12]。采用蒸餾或乙醚萃取的方法處理己酸菌發(fā)酵液，用氣相色譜法測定己酸含量，可避免比色法的誤差，提高分析準(zhǔn)確度，但前處理操作復(fù)雜，并且分析時間也較長。本研究對氣相色譜法測定己酸菌發(fā)酵液中己酸的方法作了改進(jìn)，建立了一種利用毛細(xì)管色譜柱、直接進(jìn)樣氣相色譜法定量測定己酸菌發(fā)酵液中的己酸、丁酸、乙酸等有機(jī)酸的方法。

1　材料與方法

1.1　材料、試劑及儀器

菌株：使用瀘州老窖股份有限公司自行分離篩選自老窖泥的產(chǎn)己酸細(xì)菌進(jìn)行己酸發(fā)酵。

己酸菌培養(yǎng)基（巴氏合成培養(yǎng)基）：(NH4)2SO40.05%、K2HPO40.04%、MgSO4·7H2O 0.02%、乙酸鈉0.5%、酵母膏0.1%、CaCO31%、乙醇2%。

試劑：己酸、丁酸、乙酸、2-乙基丁酸（均為標(biāo)準(zhǔn)品），天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；無水乙醇（色譜純），天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心。準(zhǔn)確稱取己酸、丁酸、乙酸、2-乙基丁酸100 mg于100 mL容量瓶中，用25%色譜純乙醇溶液定容至刻度。配制標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為己酸1000 mg/L、丁酸1000 mg/L、乙酸1000 mg/L、2-乙基丁酸1000 mg/L。

儀器設(shè)備：色譜儀為日本島津公司GC-2010型氣相色譜儀，F(xiàn)ID氫火焰檢測器，配N2000工作站。色譜柱為日本島津公司的Inert CapTMPure Wax毛細(xì)管柱，長30 m，內(nèi)徑0.25 mm，膜厚0.25 μm。

1.2　樣品處理

取樣品40 mL加2 M硫酸酸化至pH2，加無水乙醇至50 mL，在12000 r/min、4℃條件下進(jìn)行冷凍離心5 min，取上清液，過0.2 μm微孔濾膜。進(jìn)樣前將樣品和內(nèi)標(biāo)1∶1混勻。

1.3　氣相色譜分析條件

采用Inert CapTMPure Wax毛細(xì)管柱，載氣為高純氮?dú)?，燃燒氣為H2。內(nèi)標(biāo)為以25%乙醇配制的1000 mg/L的2-乙基丁酸。檢測器溫度260℃，汽化溫度250℃，柱溫150℃。進(jìn)樣量為0.5 μL，分流比50∶1，采樣時間10 min。N2000色譜工作站，采用保留時間定性，內(nèi)標(biāo)法定量。

2　結(jié)果與討論

2.1　發(fā)酵液預(yù)處理方法

直接進(jìn)樣毛細(xì)管柱氣相色譜法分析己酸菌發(fā)酵液中的己酸等有機(jī)酸，進(jìn)樣的樣品需達(dá)到色譜進(jìn)樣要求。要求進(jìn)樣的樣品無固形物，關(guān)鍵要對樣品進(jìn)行處理。發(fā)酵培養(yǎng)基中添加了碳酸鈣，發(fā)酵液中己酸等有機(jī)酸很大一部分以鹽的形式存在，因此酸化處理己酸發(fā)酵液是必要的。己酸等有機(jī)酸沸點(diǎn)都比較高，不容易蒸餾出，蒸餾后的殘液中己酸含量占很大部分[13]。如用鹽酸酸化，鹽酸與發(fā)酵液中的碳酸鈣反應(yīng)生成溶于水的氯化鈣，樣品中存在一定的鹽分，對色譜柱的使用壽命有不良影響。用硫酸酸化后生成難溶于水的硫酸鈣，可離心分離去除，減少樣品中的鹽分，確保色譜柱的正常使用。通過處理?xiàng)l件實(shí)驗(yàn)，確定己酸發(fā)酵液用2 M硫酸酸化至pH2后以12000 r/min、4℃進(jìn)行高速冷凍離心5 min，取上清液，再用0.2 μm微孔濾膜過濾，所得樣品直接進(jìn)樣分析。

2.2　色譜條件的優(yōu)化

經(jīng)處理后的己酸發(fā)酵液樣品pH值較低，故采用具有最高惰性、鍵合了聚乙二醇強(qiáng)極性固定相的Inert CapTMPureWax毛細(xì)管柱。應(yīng)用30 m×0.25 mm×0.25 μm Pure Wax毛細(xì)管柱進(jìn)行氣相色譜分離時，目標(biāo)峰可得到較好的分離效果。

為防止氣相色譜分析所用的毛細(xì)管柱被氧化，采用99.9995%的高純氮?dú)鉃檩d氣，選擇載氣壓力為120 kPa[14]。綜合考慮己酸菌發(fā)酵液有機(jī)酸的分離度、分析時間、檢測器靈敏度和歧化效應(yīng)的影響，選定分流比為50∶1。由于己酸菌發(fā)酵液有機(jī)酸的組分較少，為提高分析速度、縮短分析周期，使組分快速流出色譜柱，保證有機(jī)酸組分峰具有較高的分離度，經(jīng)過大量的實(shí)驗(yàn)對比色譜條件，選擇毛細(xì)管柱的柱溫150℃，汽化溫度250℃，檢測器溫度260℃。進(jìn)樣量為0.5 μL，采樣時間10 min。在本色譜條件下，對濃度為1000 mg/L己酸、丁酸、乙酸和2-乙基丁酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示能將己酸、丁酸、乙酸和2-乙基丁酸完全分開?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)色譜圖見圖1，己酸菌發(fā)酵液色譜圖見圖2。有機(jī)酸之間的分離度非常好，分離效果良好，而且色譜出峰尖銳、對稱，可準(zhǔn)確定性。氣相色譜測定己酸菌發(fā)酵液中的己酸、丁酸、乙酸等有機(jī)酸分析時間在10 min以內(nèi)，分離時間快，分析周期短。

圖1　乙酸、丁酸、己酸混標(biāo)色譜譜圖

2.3　氣相色譜法精密度實(shí)驗(yàn)

圖2　己酸菌發(fā)酵液色譜圖

氣相色譜測定己酸、丁酸、乙酸等有機(jī)酸的方法精密度以測定待測組分含量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)評價(jià)。對同一個己酸菌發(fā)酵液樣品進(jìn)行6次重復(fù)性測試，其己酸、丁酸、乙酸等有機(jī)酸含量的各個測定值及平均值見表1，己酸、丁酸、乙酸的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.54%、2.22%、2.35%，說明該方法具有較好的精密度。

2.4　加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

分別取同一己酸菌發(fā)酵液為樣品，對該樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，添加“高中低”3個濃度的己酸、丁酸、乙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液作為加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個添加水平做3次平行，最后計(jì)算平均回收率，驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確度，結(jié)果見表2。通過對樣品進(jìn)行加標(biāo)測定，由表2可得出方法加標(biāo)回收率在96.83%～103.71%之間。說明該方法準(zhǔn)確性好，可保證己酸、丁酸、乙酸等有機(jī)酸測量結(jié)果的可靠性。

2.5　己酸菌發(fā)酵液中的己酸等有機(jī)酸含量的測定

取6個己酸菌發(fā)酵液樣品，分別編號為1、2、3、4、5、6，按照上述的預(yù)處理方法和分析步驟進(jìn)行試驗(yàn)，測定結(jié)果見表3。

從上述結(jié)果可以看出，利用氣相色譜法可一次性測定己酸菌發(fā)酵液中的己酸、丁酸、乙酸等有機(jī)酸含量。己酸菌發(fā)酵液樣品中檢測出的己酸含量在5250.46～10066.27 mg/L之間，丁酸含量在1129.78～2139.53 mg/L之間，乙酸含量在143.47～902.08 mg/L之間。

3　結(jié)論

本研究采用硫酸對己酸菌發(fā)酵液進(jìn)行酸化及高速離心機(jī)、微孔濾膜過濾預(yù)處理方法，排除了發(fā)酵液中的一些物質(zhì)對測定的影響。使用氣相色譜法可一次性快速分析己酸菌發(fā)酵液中的己酸、丁酸、乙酸等多種有機(jī)酸組分，具有準(zhǔn)確度高、簡便快速等優(yōu)點(diǎn)。該方法可應(yīng)用于己酸菌的篩選及己酸菌的發(fā)酵控制，測定發(fā)酵液中的己酸、丁酸、乙酸等有機(jī)酸含量。

表1　氣相色譜法精密度試驗(yàn)(n=6)

表2　己酸、丁酸、乙酸在3個加標(biāo)水平下的回收率

表3　發(fā)酵液中己酸等有機(jī)酸含量　(mg/L)

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