6種酵母發(fā)酵菠蘿酒香氣成分的GC-MS分析及其篩選

龐惟俏，曲鵬宇，魏程程，郭德軍

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江大慶 163319； 2.欽州學(xué)院食品工程學(xué)院，廣西欽州 535000)

菠蘿（Ananas comosus（Linn.）Merr.），又名鳳梨，含有豐富的糖類、蛋白質(zhì)和維生素等，同時(shí)菠蘿還具有清熱解暑、生津止渴，改善消化不良、小便不利等藥用價(jià)值[2]。由于菠蘿香氣濃郁、出汁量高，在微生物的作用下適合進(jìn)行發(fā)酵釀酒，不但可使菠蘿的營養(yǎng)成分充分溶出，也可發(fā)揮其藥用功效[3]。目前，我國菠蘿種植面積較大，收獲期價(jià)格低廉，但市售的菠蘿飲品的種類相對(duì)較少，如菠蘿果汁、菠蘿啤酒，而菠蘿發(fā)酵酒卻很少見。因此，開發(fā)香氣濃郁的菠蘿酒是十分有必要的。

在果酒的釀造中，發(fā)酵菌種直接影響菠蘿酒的品質(zhì)、酒精度、香氣和發(fā)酵速度[4]。根據(jù)已報(bào)道文獻(xiàn)，對(duì)篩選菠蘿酒釀酒酵母的研究相對(duì)較少，都集中研究其發(fā)酵工藝和其揮發(fā)性成分。陳文學(xué)等[5]優(yōu)化菠蘿酒的發(fā)酵工藝，當(dāng)工藝參數(shù)為添加糖219.8 g/L，調(diào)pH3.5，發(fā)酵溫度為19.8℃時(shí)，菠蘿酒的口感最佳?？谆劬甑萚6]采用GC-MS對(duì)菠蘿鍵合態(tài)香氣成分進(jìn)行分析和鑒定，確定醇和酚對(duì)其香氣成分貢獻(xiàn)較大。因此，本實(shí)驗(yàn)以菠蘿為原料，使用6種不同的工業(yè)化釀酒酵母菌株進(jìn)行發(fā)酵釀制菠蘿酒，并采用頂空固相微萃取法和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，對(duì)其揮發(fā)性香氣成分進(jìn)行定性定量分析，明確其發(fā)酵香氣；通過測(cè)定其酒精度、總酸等理化指標(biāo)，并結(jié)合感官評(píng)價(jià)結(jié)果，篩選釀造菠蘿酒的最佳釀酒酵母，為更好地釀造色澤鮮亮，果香味濃郁，口味協(xié)調(diào)，酒體穩(wěn)定的菠蘿酒提供參考依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　材料、試劑及儀器

菠蘿，購自大慶九區(qū)批發(fā)市場(chǎng)；果酒干酵母RC212、AC、71B、2323、EVYRED、K1、酒明串珠菌，購自煙臺(tái)帝伯仕自釀機(jī)械有限公司。

試劑：果膠酶、對(duì)甲氧基苯甲醛、亞硫酸（分析純），上海生工生物工程股份公司。

儀器設(shè)備：7890A氣相色譜儀、5975質(zhì)譜儀，Agilent公司；色譜柱：DB-5(60m×0.25mm×0.25μm)，固相微萃取裝置，PDMS/DVB 50/30μm萃取頭，J&W Sci.公司。DK-8D電熱恒溫水槽，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；722S可見光分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；TD25-WS多管架自加平衡離心機(jī)，長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.2　實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1　菠蘿酒的制備

菠蘿酒釀造工藝見圖1，其操作要點(diǎn)如下。

圖1　菠蘿酒制備工藝流程圖

（1）制備菠蘿酒：挑選成熟度高的菠蘿作為原料，削皮，榨汁。添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.03%的果膠酶，以提高菠蘿的出汁率，50℃恒溫水浴2 h。添加蔗糖，其中菠蘿汁發(fā)酵的總糖度應(yīng)控制在24%～25%，分3次加入；添加0.03%的硫酸銨，以補(bǔ)充氮源；添加200 mg/L亞硫酸，抑制雜菌繁殖和護(hù)色[7-8]。

（2）活化酵母：分別取6種干酵母1 g，35℃條件下置于20 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%蔗糖溶液中并攪拌15 min，30℃恒溫靜置1.5 h活化后即可使用[9]。

（3）主發(fā)酵：將活化后的酵母菌液按質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%接種于菠蘿果汁中，25℃恒溫發(fā)酵14 d。

（4）降酸：由于菠蘿酸度過高，使得菠蘿酒口感酸澀，因此添加酒明串珠菌(1 g/200 L)促進(jìn)蘋果酸乳酸發(fā)酵，20℃恒溫發(fā)酵28 d，以降低其酸度。

1.2.2　菠蘿果汁及酒揮發(fā)性成分分析

取約10 mL樣品加入40 mL樣品瓶中，加入濃度為1.121 μg/mL對(duì)甲氧基苯甲醛內(nèi)標(biāo)溶液0.1 μL，將樣品瓶放入60℃的水浴中平衡10 min，將老化好的萃取針頭插入樣品瓶中，將石英纖維頭暴露于樣品瓶的頂空氣體中，恒溫60℃萃取40 min，用手柄將纖維頭推回針頭內(nèi)拔出，插入GC-MS的進(jìn)樣器于250℃條件下解析1 min，同時(shí)啟動(dòng)儀器采集數(shù)據(jù)。

（1）色譜條件。參照楊華等[10]的研究，將色譜條件設(shè)為進(jìn)樣口溫度250℃，載氣He，流速1.0 mL/min。采用程序升溫方式，由室溫升至80℃保持5 min，然后以4℃/min升至240℃,在此溫度下保持2 min，選擇不分流進(jìn)樣。

（2）質(zhì)譜條件。MS離子源在225℃全掃描，電離方式：EI，電子能量70 eV；掃描質(zhì)量范圍：50～500 amu。

1.2.3　定性定量分析菠蘿酒

（1）定性分析。利用計(jì)算機(jī)對(duì)采集到的質(zhì)譜圖進(jìn)行檢索，輔助人工解析圖譜，與NIST 02.L標(biāo)準(zhǔn)譜庫進(jìn)行對(duì)照匹配。

（2）定量分析。根據(jù)對(duì)甲氧基苯甲醛內(nèi)標(biāo)物的濃度，按下面公式計(jì)算出菠蘿酒中每種揮發(fā)性組分的含量。

式中：X—菠蘿酒中揮發(fā)性成分的濃度，ng/mL；

A0—內(nèi)標(biāo)物對(duì)甲氧基苯甲醛的峰面積；

Ai—揮發(fā)性成分的峰面積；

m—內(nèi)標(biāo)物對(duì)甲氧基苯甲醛的質(zhì)量，μg；

V—處理前樣品的體積，mL。

1.2.4　菠蘿酒感官評(píng)定

參照《葡萄酒工業(yè)手冊(cè)》及GB/T 15038—2006，選取10名實(shí)驗(yàn)室有經(jīng)驗(yàn)的品評(píng)成員（男女各5人）對(duì)菠蘿酒進(jìn)行感官評(píng)定，從色澤、香氣、口味、風(fēng)格4個(gè)方面進(jìn)行評(píng)分。具體感官評(píng)分指標(biāo)見表1[5，7]。

2　結(jié)果與分析

2.1　主要香氣成分分析

對(duì)菠蘿酒的揮發(fā)性成分的研究有助于解釋其酒體香氣及味道。不同酵母發(fā)酵的菠蘿果汁及酒的主要香氣成分分析結(jié)果見表2。由表2可知，采用HS-SPME和GC-MS技術(shù)，在6種不同酵母發(fā)酵的菠蘿酒中共檢出60種揮發(fā)性成分，主要包括酯類27種、醇類8種、酸類6種、酚類5種、烷烴類2種、酮和醛類5種、其他類7種。而在菠蘿果汁中僅鑒定出8種香氣成分，與菠蘿酒相比較，未檢出醇類、酚類和烷烴類；菠蘿果汁的揮發(fā)性成分相對(duì)單一，僅有少數(shù)的3種酯、1種酸、3種酮醛、1種其他化合物。

表1　菠蘿酒感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)

表2　不同酵母發(fā)酵的菠蘿果汁及酒的主要香氣成分

續(xù)表2　不同酵母發(fā)酵的菠蘿果汁及酒的主要香氣成分

菠蘿果汁經(jīng)酵母發(fā)酵，其揮發(fā)性成分的種類和含量明顯增多。在71B酵母釀造的菠蘿酒中，共檢測(cè)出21種香氣成分，揮發(fā)性成分總含量為769.73 ng/mL，其主要揮發(fā)性成分為乙酸乙酯（45.48 ng/mL）、3,3-二甲基-1,2-環(huán)氧丁烷（515.01ng/mL）、苯乙醇（43.17ng/mL）、辛酸（45.48 ng/mL）。在2323酵母釀造的菠蘿酒中，揮發(fā)性成分比71B多4種，揮發(fā)性成分總含量為473.87 ng/mL，主要香氣成分為3,3-二甲基-1,2-環(huán)氧丁烷（138.367 ng/mL）、苯乙醇（66.90 ng/mL）、辛酸（41.91ng/mL）、甲苯-2,4-二異氰酸酯（120.55ng/mL）、酞酸二乙酯（25.06 ng/mL）。在AC酵母釀造的菠蘿酒中揮發(fā)性成分最多，為29種，總含量為561.86 ng/mL。包括甲酸異戊酯（74.64ng/mL）、苯乙醇（68.63ng/mL）、3,3-二甲基-1,2-環(huán)氧丁烷（209.95 ng/mL）、4-羥基-2-丁酮（30.49 ng/mL）等主要成分。28種揮發(fā)性成分在EVYRED酵母釀造的菠蘿酒中被檢出，總含量為502.00 ng/mL，主要香氣成分為1-戊醇（26.71 ng/mL）、異戊醇（24.15 ng/mL）、苯乙醇（82.04 ng/mL）、辛酸（24.01 ng/mL）、3,3-二甲基-1,2-環(huán)氧丁烷（219.91 ng/mL）。K1酵母釀造的菠蘿酒的總揮發(fā)性成分含量為571.39 ng/mL，包含24種揮發(fā)性成分，主要香氣成分為乙酸乙酯（26.73 ng/mL）、異戊醇（82.22 ng/mL）、苯乙醇（79.28 ng/mL）、辛酸（22.16 ng/mL）、3,3-二甲基-1,2-環(huán)氧丁烷（266.53ng/mL）。RC212酵母釀造的菠蘿酒中被檢出的揮發(fā)性成分種類最少，僅有16種，總含量為763.41ng/mL，主要香氣成分為乙酸乙酯（44.70ng/mL）、苯乙醇（84.25 ng/mL）、己酸（20.55 ng/mL）、辛酸（36.84 ng/mL）、3,3-二甲基-1,2-環(huán)氧丁烷（510.08ng/mL）。

2.2　不同酵母發(fā)酵的菠蘿酒揮發(fā)性成分的比較分析

2.2.1　酯類成分的比較分析

酯類物質(zhì)是發(fā)酵酒揮發(fā)性成分的重要組成部分，也是構(gòu)成其香氣骨架的重要成分。分別經(jīng)6種酵母發(fā)酵的菠蘿酒中，酯類化合物的種類和含量較菠蘿原液均明顯增加，賦予其明顯的發(fā)酵香氣；酵母菌2323菌株發(fā)酵的菠蘿酒中酯含量最高，為176.32 ng/mL，是原液含量的10倍；EVYRED菌株發(fā)酵的酯含量最低，為76.51 ng/mL，這表明不同酵母菌株發(fā)酵所能產(chǎn)生的酯類含量差異性較大。乙酸乙酯、3-甲基-1-丁醇乙酸酯、甲苯-2,4-二異氰酸酯、十四酸乙酯是6種菠蘿酒的共有酯類物質(zhì)，且經(jīng)酵母發(fā)酵后含量大量增加，這是因?yàn)榻湍改艽龠M(jìn)酯化反應(yīng)的產(chǎn)生[11]。酞酸二乙酯僅在2323菌株的發(fā)酵酒中被檢出，含量為25.06 ng/mL，具有芳香氣味，目前，未見在菠蘿酒中檢出的報(bào)道。經(jīng)6種酵母發(fā)酵后的菠蘿酒中增加的酯類還包括乙酸乙酯、乙酸苯乙酯等，這些化合物可增加酒體的整體香氣并豐富香氣的復(fù)雜性，具有輔助增香作用[12]。

2.2.2　醇類成分的比較分析

酵母代謝菠蘿原液中的糖類物質(zhì)，轉(zhuǎn)化成醇類化合物[13]。除乙醇外，菠蘿汁分別經(jīng)6種酵母發(fā)酵后產(chǎn)生的醇類主要包括1-戊醇、異戊醇、苯乙醇，每種醇的含量均大于10 ng/mL。6種菠蘿酒中共有的醇類成分只有苯乙醇，同時(shí)含量也較高，苯乙醇具有清甜的玫瑰花香和水果香氣[14]，符合中國人的口味偏好；酵母RC212釀造的菠蘿酒中苯乙醇含量最高，為84.25 ng/mL?？谆劬闧6]在菠蘿酒中檢出50 ng/mL的苯乙醇，并證實(shí)其給人柔和的愉悅感。K1酵母發(fā)酵的菠蘿酒中異戊醇含量較高，為82.22 ng/mL，但異戊醇有令人不悅的苦杏仁味道，影響其口感[15]，除EVYRED和K1菌株以外的其他酵母釀造的菠蘿酒中未檢出該物質(zhì)。

2.2.3　酸類、酚類成分的比較分析

有機(jī)酸是保持果酒中酒體平衡和口感清爽特性的主要物質(zhì)[16]。菠蘿酒中的酸類物質(zhì)使得其略帶酸味，主要是糖的丁酸發(fā)酵和蛋白質(zhì)氧化時(shí)的產(chǎn)物。6種菠蘿酒中共有的酸類香氣成分有辛酸和己酸，且含量也較多；它增加了菠蘿酒的柔和口感，但原液中未檢出，這兩種酸應(yīng)該是釀酒酵母的代謝產(chǎn)物；其中，71B酵母釀制的菠蘿酒中辛酸含量最高，為45.48 ng/mL。在菠蘿果汁中檢出3.31 ng/mL肉桂酸，但在所有菠蘿酒中未檢出肉桂酸，這可能是因?yàn)榫泼鞔榫鷮⒃撍徂D(zhuǎn)化為醇，使得含量減少[17]。4.76 ng/mL的棕櫚酸在酵母EVYRED菌株發(fā)酵的菠蘿酒中檢出，張慶慶[13]在紅曲菠蘿酒中也檢出少量棕櫚酸；導(dǎo)致其含量較低的原因可能是其與醇發(fā)生酯化反應(yīng)生成棕櫚酸乙酯。菠蘿果汁中未檢出酚類物質(zhì)，但4-乙烯基-2-甲氧基苯酚在所有果酒中被檢出，呈強(qiáng)烈丁香和發(fā)酵似香氣，有炒花生氣息。71B酵母發(fā)酵的酒中該化合物的含量較多，為17.94 ng/mL，該酚是酵母菌代謝產(chǎn)生的次級(jí)產(chǎn)物。6種果酒中其他酚類化合物含量相對(duì)較少，但其與醇、酸和酯共同組成菠蘿酒圓潤的香氣。2.2.4醛酮類成分的比較分析

6種菠蘿酒中的醛酮類香氣成分的種類和含量較少，在菠蘿果汁及果酒中未發(fā)現(xiàn)共同的羰基化合物。AC釀造的菠蘿酒中，4-羥基-2-丁酮含量最高，為30.49 ng/mL，其可賦予菠蘿酒芳香氣味。1.79 ng/mL的2-羥基-4-甲基苯甲醛和11.18 ng/mL的3-辛酮僅在菠蘿汁中被檢出，這可能是因?yàn)樵摶衔锉唤湍咐棉D(zhuǎn)化成醇類化合物。對(duì)比已發(fā)表文獻(xiàn)，在菠蘿酒中檢出的醛酮化合物含量均不高，但其與其他種類的化合物相互作用，有助于菠蘿酒的增香[18]。

2.2.5　其他類成分的比較分析

其他類化合物盡管種類和含量較少，但對(duì)菠蘿酒的香氣構(gòu)成也有貢獻(xiàn)作用。菠蘿酒中檢測(cè)到的其他類揮發(fā)性成分共7種，主要存在于71B、2323、AC、EVYRED酵母菌株釀造的菠蘿酒當(dāng)中，含量最多的為酵母AC釀造的菠蘿酒，為17.65 ng/mL。3,4-環(huán)氧四氫呋喃只在菠蘿汁中被發(fā)現(xiàn)，符楨華[19]在菠蘿發(fā)酵的果醋中也檢出該呋喃化合物，并證實(shí)其是菠蘿醋的典型風(fēng)味成分。

表3　不同酵母發(fā)酵的菠蘿酒的感官評(píng)價(jià)結(jié)果及理化指標(biāo)

2.3　菠蘿酒的理化性質(zhì)和感官評(píng)定結(jié)果

通過對(duì)不同菌株發(fā)酵的菠蘿酒的理化指標(biāo)和感官評(píng)價(jià)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表3。感官評(píng)分排名為2323＞EVYRED＞71B＞RC212＞AC＞K1。2323和EVYRED酵母的產(chǎn)酒能力強(qiáng)，殘?zhí)堑?，酸度較低，感官評(píng)價(jià)綜合評(píng)分比較高，且風(fēng)格和口味較佳，適合用于釀造菠蘿酒；71B酵母產(chǎn)酒能力強(qiáng)，酸度較低，但是風(fēng)味、口感皆不佳，感官評(píng)定總分低；RC212、K1、AC酵母釀制的菠蘿酒香氣較佳，但酒口感酸，綜合評(píng)分較低，不太受品鑒者歡迎。

不同酵母菌株發(fā)酵對(duì)菠蘿酒風(fēng)味的影響較大，其主要的影響來源于揮發(fā)性成分的差異。賈言言也報(bào)道梅奇酵母屬的M.agaves可用于菠蘿酒的釀造，并可獲得豐滿的酒體[11]。

3　結(jié)論

GC-MS分析表明，菠蘿汁經(jīng)發(fā)酵后，其揮發(fā)性化合物的種類和含量明顯增加，這與酵母的酶活和代謝中間產(chǎn)物種類關(guān)系較大。在菠蘿發(fā)酵酒中檢出60種揮發(fā)性成分，而在菠蘿汁中共有8種揮發(fā)性成分被檢出，增加了52種揮發(fā)性成分，其中兩者共有的主要成分有8種。不同酵母發(fā)酵的菠蘿酒香氣具有明顯的差異性，主要的揮發(fā)性香氣成分是酯類、醇類、酸類、酚類和醛酮類僅占少部分，這預(yù)示著酵母菌株是影響菠蘿酒發(fā)酵品質(zhì)的一個(gè)重要因素。同時(shí)，GC-MS分析結(jié)果也佐證了理化指標(biāo)和感官評(píng)定結(jié)果，酒的酯香可能是中國人偏愛的一個(gè)重要的香氣取向；側(cè)重感官評(píng)定，故選取2323酵母菌株為釀造菠蘿酒的最優(yōu)菌種。由于菠蘿果汁及菠蘿酒中的各種揮發(fā)性香氣成分的含量、種類、感官閾值以及相互作用決定其最終的香氣特征，所以菠蘿果酒中的某些特征組分的相互作用和發(fā)酵控制還需進(jìn)一步地探索與驗(yàn)證。

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