異丙酚影響基質(zhì)金屬蛋白酶對肺腺癌細胞株增殖侵襲能力的作用

張永強　劉俊　陳勝陽　劉國澤　田建民　岳修勤

新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院麻醉科（河南新鄉(xiāng) 453100）

目前，臨床上針對肺癌的常規(guī)治療包括手術、藥物及放化療等手段，雖有一定效果，但由于肺癌細胞株增殖快，易侵襲轉(zhuǎn)移等原因效果不甚理想［1-2］，治療方向最終要回歸到早期藥物阻斷，以盡可能減緩病情進展。因此，尋求一種安全有效的肺癌治療方案用以降低肺癌患者發(fā)病率和病死率已經(jīng)成為目前臨床亟需解決的難題。早先葉慧瑾等［3］提出異丙酚確有抑制肺癌細胞侵襲的能力，主要通過下調(diào)水通道蛋白3及基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）得以實現(xiàn)；最新研究顯示MMP?2亦參與了異丙酚影響肺癌細胞株的調(diào)控過程［4-6］，但研究尚未深入。劑量反應關系值的進一步分析，反應機制的探討極有必要。因此，筆者通過分析不同濃度異丙酚通過影響基質(zhì)金屬蛋白酶進而抑制肺癌細胞株增殖侵襲能力的差異，探究異丙酚與肺癌細胞株增殖侵襲能力的劑量效應關系及其作用機制，為下一步異丙酚廣泛應用于肺癌的輔助治療提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實驗材料及儀器肺癌細胞株A549購于武漢大學生命科學院培養(yǎng)物保藏中心；RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清為美國Hyclone公司產(chǎn)品；胰蛋白酶、異丙酚（批號：1001741585）及DMSO（批號：D2711）購于Sigma公司；Transwell小室及細胞計數(shù)試劑盒（CCK?8）購于美國Santa Cruz公司；兔抗人基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP?2）單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記羊抗兔二抗購于杭州瑞晶有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及總RNA提取試劑盒購于上海碧云天生物技術研究所；Multiskan Spectrum全波長酶標儀、蛋白印跡系列儀器以及熒光定量PCR儀為美國RioRad公司產(chǎn)品。

1.2細胞培養(yǎng)將肺癌細胞株A549接種于RP?MI1640培養(yǎng)基（100 μg/mL青霉素和鏈霉素+10%胎牛血清）中，并置于恒溫密閉培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)，密切觀察細胞株狀態(tài)，80%細胞貼壁融合時，采用0.25%胰蛋白酶對細胞進行消化傳代，并取處于對數(shù)生長期的細胞施行后續(xù)實驗操作。

1.3細胞處理及分組配制異丙酚溶液：母液采用DMSO溶解異丙酚配制，濃度為120 μmol/L，經(jīng)預實驗篩選后，實驗選取濃度為：60、100、120 μmol/L。以0 μmol/L異丙酚、相同體積濃度DMSO的肺癌細胞作為對照組，根據(jù)濃度高低分為L組、M組、H組。

1.4細胞后續(xù)處理細胞后續(xù)處理轉(zhuǎn)染MMP?2沉默腺病毒載體，MMP?2沉默的腺病毒載體構(gòu)建由晨光生物科技有限公司完成；siRNA干擾MMP?2腺病毒序列設計為 5′?CCGGGCTGAAGGACACAC?TAAAGAACTCGAGTTCTTTAGTGTGTCCTTCAGCT?TTTTG?3′；感染24 h后加藥篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞，置于細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.5CCK?8檢測肺癌細胞株增殖狀況取處于對數(shù)生長期的上述四組細胞置于96孔板中，每孔配置約100 μL細胞懸液置于培養(yǎng)箱內(nèi)，加入CCK?8溶液，分別培養(yǎng)24、48、72 h，于450 nm處采用全波長酶標儀測定個組在不同異丙酚濃度下的觀密度（OD）值。根據(jù)我們前期證實的MMP?2沉默的腺病毒載體轉(zhuǎn)染最佳濃度和時間，將50 nmol/mL siRNA干擾MMP?2腺病毒和siRNA空病毒載體分別轉(zhuǎn)染肺癌細胞，繼續(xù)培養(yǎng)48 h再次以CCK?8法測定各處理組細胞的OD值。實驗重復3次，取8孔計算平均值，以濃度為橫坐標，各組OD值為縱坐標繪制曲線，再次觀察四組細胞增殖情況。細胞活力（%）=［A（加藥）-A（空白）］/［A（未加藥）-A（空白）］×100。

1.6Transwell實驗當各組細胞融合至80%左右時，將細胞置于無血清培養(yǎng)基中，饑餓處理12 h，而后繼續(xù)培養(yǎng)。將0.05 g/L的Mataigel基質(zhì)膠按1∶8的比例稀釋，稀釋后的matrigel膠均勻鋪在Transwell小室膜上；小室的下室中RPMI 1640培養(yǎng)基。取出Transwell上室，用棉簽擦去PVPF膜靠近小室內(nèi)面的細胞后，無水甲醇常溫固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色20 min，于400倍顯微鏡下隨機記數(shù)5個視野的細胞數(shù)，計算細胞侵襲抑制率，計算公式為：（1?侵襲組細胞數(shù)/對照組細胞數(shù)）×100%。此后，siRNA干擾MMP?2，步驟同上，轉(zhuǎn)染后24 h，再次檢測各組細胞侵襲抑制率。

1.7實時熒光定量PCR法檢測不同處理濃度下各組mRNA含量Trizol試劑裂解細胞，將裂解液轉(zhuǎn)移至離心管后加入氯仿。提取上層的RNA，加入等體積異丙醇，混勻后離心10 min。收集沉淀，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。內(nèi)參基因為GAPDH，反應條件為98℃ 3 min；98℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min（35個循環(huán)）；72℃10 min。分別檢測內(nèi)參基因和各組目的基因的Ct值，采用公式2-△△CT計算目的基因的相對表達量，實驗重復3次。本實驗中，內(nèi)參基因及目的基因引物序列如表1。

表1　目標基因引物序列Tab.1　Prime sequence of real time fluorescent quantitative PCR

1.8Western blot檢測各組MMP?2蛋白含量取對數(shù)生長期肺癌細胞株，RIPA蛋白裂解液提取細胞總蛋白，加入上樣緩沖液（1∶4）后煮沸5 min，冷卻至室溫后裝入EP管冷凍保存；SDS?PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜，封閉1 h；加入一抗稀釋液（1∶1 000），4 ℃過夜孵育；次日洗膜，加入二抗，于37℃恒溫孵育1.5 h。以GAPDH蛋白為對照，化學發(fā)光法（ECL）檢測條帶，試驗重復3次。

1.9統(tǒng)計學方法采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，采用重復測量方差分析比較不同藥物濃度組的細胞增殖活性以及沉默MMP?2基因后各組的細胞活性差異；單因素方差分析各組細胞侵襲抑制率的差異以及沉默MMP?2基因后的變化，兩組間差異比較采用SNK?q檢驗；分析各組癌細胞中MMP?2蛋白及mRNA的表達水平，探究異丙酚濃度與MMP?2基因表達產(chǎn)物的關系。

2　結(jié)果

2.1異丙酚對肺癌細胞株增殖的影響CCK?8法檢測結(jié)果顯示，細胞培養(yǎng)第24、48及72 h后，與實驗對照組相比，M組和H組增殖活性顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其中H組在上述各時間節(jié)點下的增值活性最低（P＜0.05）；組間比較可知，H組增殖活性低于M組（FM?H=9.382，PM?H=0.000），而 M 組則低于 L 組（FM?L=7.468，PM?L=0.000），見表2。

2.2沉默MMP?2后，各組肺癌細胞增殖活性比較沉默MMP?2基因，培養(yǎng)40 h后，以轉(zhuǎn)染了siRNA空白載體的4組作為對照，再次推算其細胞活性大小，結(jié)果顯示：siRNA干擾MMP?2細胞表達后，各組細胞活性值均較MMP?2未沉默組明顯下降（P＜0.05），此時異丙酚抑制肺癌細胞增殖的作用明顯加強，見圖1。

表2　不同時間點下各組細胞增殖活性的比較Tab.2　Comparison of four groups of proliferation activity at different times　±s

表2　不同時間點下各組細胞增殖活性的比較Tab.2　Comparison of four groups of proliferation activity at different times　±s

注：FM-L=7.468，PM-L=0.000；FM-H=9.382，PM-H=0.000；與對照組相比，*P ＜ 0.05；與L組相比，ΔP ＜0.05；與M組相比，#P ＜ 0.05

組別對照組L組M組H組0 h 0.825±0.041 0.787±0.036 0.811±0.037 0.799±0.047 24 h 1.438±0.036 1.482±0.055 0.988±0.027*△0.812 ± 0.051*△#48 h 1.654±0.034 1.590±0.044 1.178±0.036*△0.977 ± 0.031*△#72 h 1.958±0.044 1.856±0.030 1.548±0.042*△1.186 ± 0.027*△#

圖1　沉默MMP?2后各組肺癌細胞增殖活性的比較Fig.1　Comparison of proliferation activity of lung cancer cells in each group after silencing MMP?2

2.3不同濃度異丙酚對肺癌細胞株侵襲抑制率的影響Transwell侵襲實驗結(jié)果如下：相比于對照組細胞侵襲抑制率，H組侵襲抑制率為39.8%（t=12.189，P=0.000），M組為18.5%（t=9.563，P=0.000），L組為3.2%（t=4.052，P=0.003），差異均具有統(tǒng)計學意義；L、M、H組相比，L組低于M組、H組，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；而對照組和L組的細胞侵襲抑制率相比，差異無統(tǒng)計學意義（t=0.940，P=0.357），見圖2。沉默MMP?2基因后，Transwell侵襲實驗結(jié)果如下：相比于轉(zhuǎn)染空病毒載體的各濃度組，沉默后每組的侵襲抑制率均明顯上升，其中，對照組的侵襲抑制率為3.6%（t=4.175，P=0.022）、H 組為 63.2%（t=8.533，P=0.000），M 組為 31.9%（t=5.026，P=0.003）、L組為6.8%（t=3.541，P=0.032），差異均具有統(tǒng)計學意義，見圖3。

圖3　沉默MMP?2后各組肺癌細胞侵襲抑制率的差異Fig.3　Comparison of invasive inhibitory rate of lung cancer cells in each group after silencing MMP?2

2.4不同濃度異丙酚對癌細胞MMP?2表達產(chǎn)物的影響PCR及Western blot試驗結(jié)果提示：M組（t=4.386，P=0.017）、H組（t=6.947，P=0.000）癌細胞的MMP?2表達產(chǎn)物含量均低于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義；對比L、M和H三組細胞MMP?2表達產(chǎn)物的變化可知，L組癌細胞的MMP?2表達產(chǎn)物含量最高，而H組相對最低，見圖4。

圖4　異丙酚濃度對肺癌細胞MMP?2相對mRNA含量的影響Fig.4　MMP?2 mRNA expression level in different concentration group（compared with control group）

圖5　異丙酚濃度對肺癌細胞MMP?2蛋白含量的影響Fig.5　MMP?2 protein expression level in different concentration group

3　討論

多項研究表明，異丙酚具有調(diào)節(jié)PI3k/Akt信號通路進而下調(diào)MMP?2減弱癌細胞的增殖轉(zhuǎn)移能力［7］，MMP?2 是目前 MMPs中研究較多的兩個成員，其能降解ECM的蛋白成分，在抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中起關鍵性作用，其轉(zhuǎn)錄表達產(chǎn)物與腫瘤進展存在一定關聯(lián)［8-9］，故異丙酚可能具有抑制腫瘤的作用且此作用與MMP?2相關。而目前對于肺癌腫瘤的抑制效果研究甚少，尚未達成廣泛共識。因此，筆者研究了不同濃度異丙酚對肺癌細胞株增殖的影響，并分析了該作用機制與MMP?2的關聯(lián)，以進一步探究異丙酚用于治療肺癌患者的臨床價值。

肺癌細胞由于其獨特的病理特征和生物學行為，使得細胞增殖速度快，且惡性程度較高［10-11］。在基礎實驗研究中，通常采用光密度值來反映細胞增殖活性。本次研究中，運用了CCK?8法檢測不同濃度異丙酚作用下，肺癌細胞增殖活性以及組間差異。結(jié)果如下：異丙酚處理后各濃度組癌細胞光密度值均有所下降，提示異丙酚對于肺癌細胞的增殖存在一定的抑制作用。進一步比較不同濃度異丙酚作用下肺癌細胞光密度的差異，筆者發(fā)現(xiàn)肺癌細胞的活力與異丙酚濃度存在一定聯(lián)系，H組的細胞活性顯著低于L組和M組，而M組的細胞活性同樣顯著低于L組，這一結(jié)果提示，異丙酚對于肺癌細胞增殖作用可能與其濃度相關，兩者間可能存在劑量依賴關系［12-13］。筆者進一步探究后發(fā)現(xiàn)，MMP?2基因表達下調(diào)后，與轉(zhuǎn)染空白載體的各組相比，沉默基因后各組細胞增殖活性均明顯下降，且濃度越高，下降越顯著；此現(xiàn)象提示MMP?2基因可能參與了異丙酚抑制肺癌細胞增殖的過程。國外學者CHETTY等［14］在研究中提示MMP?2通過下調(diào)VEGF抑制肺腺癌細胞的增殖，此作用受經(jīng)典信號通路PI3k/Akt的影響。同時，學者張靜等［15］人亦發(fā)現(xiàn)，異丙酚能促進人肺癌細胞凋亡，在此過程中，Caspase?3表達上調(diào)，MMP?2表達下調(diào)。二者結(jié)論均與本研究一致，異丙酚調(diào)控肺腺癌細胞株增殖活性的能力與MMP?2基因息息相關。

本實驗采用Transwell侵襲實驗研究不同濃度異丙酚在沉默MMP?2基因后對于肺癌細胞侵襲抑制率影響的差異，結(jié)果如下：在沉默MMP?2基因前后，相比于實驗對照組，M組和H組的肺癌細胞侵襲抑制率均明顯上升，而L組與實驗對照組相比，侵襲抑制率均變化并不明顯，這一結(jié)果提示異丙酚可能減弱了肺癌細胞的侵襲能力。分析在沉默MMP?2基因前后不同異丙酚濃度組的侵襲抑制率可得知，H組侵襲抑制率均最高，而L組均最低，且沉默MMP?2基因后L、M及H組的侵襲抑制率均高于空白載體各組，這一結(jié)果提示，異丙酚對于肺癌細胞的侵襲抑制作用的大小可能與其濃度相關，并且此關聯(lián)可能通過下調(diào)MMP?2基因的表達所致。同時，PCR及Western blot試驗結(jié)果如下：經(jīng)異丙酚處理并培養(yǎng)后，肺癌細胞MMP?2蛋白及mRNA相對含量均降低，且H組低于M組、L組，提示異丙酚可能影響MMP?2的表達，其抑制肺癌細胞的增殖效應可能是通過MMP?2產(chǎn)生。

綜上，本次實驗證實了異丙酚對于肺癌細胞的增殖以及侵襲能力的抑制作用，同時，此作用極有可能與MMP?2基因的下調(diào)有關。異丙酚作為抑制肺癌細胞增值侵襲的研究目標之一，具有潛在的臨床治療價值。

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