腰臀比性狀的全基因組通路關(guān)聯(lián)分析研究

張苗苗 ，Struan Grant，Hakon Hakonarson，R.Arlen Price，張 愿 ，李衛(wèi)東 ，焦紅肖

（1.天津醫(yī)科大學(xué)遺傳學(xué)系，天津300070；2.美國(guó)費(fèi)城兒童醫(yī)院應(yīng)用基因組學(xué)中心，費(fèi)城PA 19104；3.美國(guó)賓夕法尼亞大學(xué)醫(yī)學(xué)院精神醫(yī)學(xué)系，費(fèi)城PA 19104；4.天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中心，天津300070）

腰臀比（waist to hip ratio,WHR）反映人體腹部皮下脂肪及內(nèi)臟脂肪的聚集程度，是判斷中心性肥胖的重要測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)。最近研究表明，人體脂肪分布是一種重要的代謝健康量度，不同的脂肪分布與不同的代謝風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)[1]。腰圍（waist circumference,WC）與腰臀比作為判定中心性肥胖的測(cè)量指標(biāo)是高度遺傳的[2]。多個(gè)影響腰臀比的常見(jiàn)遺傳變異位點(diǎn)已經(jīng)通過(guò)全基因組關(guān)聯(lián)分析研究（Genome-wide association study，GWAS）確認(rèn)。Lindgren 等[3]確認(rèn) 2個(gè)與WC相關(guān)的基因位點(diǎn)（TFAP2B和MSRA）及1個(gè)在女性中與WHR相關(guān)的基因位點(diǎn)（LYPLAL1）。Heid等[4]在歐洲人群中確認(rèn)了14個(gè)基因位點(diǎn)與脂肪分布相關(guān)，其中包括已經(jīng)確認(rèn)的LYPLAL1基因。WHR作為復(fù)雜性狀，由多種基因控制。傳統(tǒng)的GWAS由于其有限的檢測(cè)效能，一些與WHR相關(guān)的微效基因在多重檢驗(yàn)校正后變得不顯著，同時(shí)也忽略了基因之間的交互作用，致使一些利用GWAS篩選出來(lái)的基因不足以解釋W(xué)HR性狀的較高遺傳度[4]。為了彌補(bǔ)傳統(tǒng)GWAS的不足，許多新的分析方法應(yīng)運(yùn)而生，Wang等[5]在基因集合富集分析GSEA（Gene Set Enrichment Analysis）算法的基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)出應(yīng)用于GWAS數(shù)據(jù)進(jìn)行全基因組通路關(guān)聯(lián)分析的方法GenGen[6]。本研究采用GenGen軟件檢測(cè)與WHR相關(guān)的基因集合/通路，通過(guò)已有的生物學(xué)通路知識(shí)確定與WHR相關(guān)的基因集合/通路，為挖掘WHR候選基因提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1　資料與方法

1.1研究對(duì)象本研究收集1 071名無(wú)血緣關(guān)系的歐洲裔美國(guó)人作為研究對(duì)象，其中526名極度肥胖者 （BMI＞35 kg/m2），545 名體質(zhì)量正常者（BMI＜25 kg/m2且一生中未超過(guò)25kg/m2）。極度肥胖者全部選自肥胖三聯(lián)體和肥胖家系中的先證者。肥胖三聯(lián)體要求父母雙方至少有一個(gè)正常；肥胖家系要求同時(shí)具備肥胖同胞對(duì)和正常-肥胖同胞對(duì)。選取正常體質(zhì)量者與極度肥胖者間無(wú)血緣關(guān)系，且匹配性別、年齡和地理分布。研究對(duì)象中，1 058例樣本含有腰圍/臀圍資料，其中女性1017例，男性41例。調(diào)查取樣均已征得本人同意并簽署知情同意書(shū)，該研究獲得美國(guó)賓夕法尼亞大學(xué)人類(lèi)研究委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2腰臀比分組腰臀比病例/對(duì)照分析時(shí)，根據(jù)1999年世界衛(wèi)生組織WHO對(duì)中心性肥胖的診斷定義，將 WHR:男＞0.90，女＞0.85 樣本作為病例組，WHR:男≤0.90，女≤0.85樣本作為對(duì)照組。

1.3方法

1.3.1提取全基因組DNA采用高鹽法獲取人外周血全基因組DNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度及純度確保質(zhì)量，DNA樣本于-80℃保存。

1.3.2基因分型及質(zhì)量控制采用Illumina公司Illumina HumanHap 550 SNP array對(duì)大約55萬(wàn)個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行基因分型，其中剔除次等位基因頻率（MAF）小于0.01或哈迪-溫伯格平衡（HWE）檢測(cè)值小于0.001的SNP位點(diǎn)，共計(jì)約518 230個(gè)SNPs，17 437個(gè)基因，基因分型結(jié)果保存于Illumina BeadStudio 3.0進(jìn)行整理。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS17.0軟件對(duì)樣本表型資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)描述。運(yùn)用GenGen軟件對(duì)全基因組約55萬(wàn)個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行腰臀比二分類(lèi)變量（病例/對(duì)照）全基因組通路關(guān)聯(lián)分析，運(yùn)算方法如下：（1）經(jīng)χ2檢驗(yàn)確定病例/對(duì)照試驗(yàn)中每一個(gè)SNP位點(diǎn)對(duì)應(yīng)χ2值，選取每個(gè)基因內(nèi)SNP位點(diǎn)最大χ2值作為該基因的統(tǒng)計(jì)值；（2）利用GSEA運(yùn)算法則計(jì)算基因集/通路 S 富集值 ES（S）；（3）為了調(diào)整不同基因的大小和同一基因內(nèi)不同SNP位點(diǎn)之間的連鎖不平衡，進(jìn)行以下校正：①隨機(jī)對(duì)樣本進(jìn)行1 000次表型重排（每次重排后病例/對(duì)照組樣本量不變），計(jì)算每次重排后相應(yīng)富集值 ES（S，π），②根據(jù)1 000次表型重排富集值計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)化富集值NES，NES=[ES（S）-mean(ES(S,π))]/SD[ES(S,π)]，從而不同基因集/通路S間可進(jìn)行比較；（4）計(jì)算實(shí)驗(yàn)P值（empirical P），重排后 ES（S，π）值大于實(shí)際 ES（S）值的次數(shù)的百分比即為實(shí)驗(yàn)P值；（5）對(duì)所得結(jié)果進(jìn)行多重假設(shè)檢驗(yàn)，其中假陽(yáng)性發(fā)現(xiàn)率（false-discovery rate，F(xiàn)DR）用來(lái)控制預(yù)期的假陽(yáng)性發(fā)現(xiàn)比例小于一定閾值，參照Aravind等[7]的GSEA法分析研究，本次研究FDR顯著性標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定為FDR≤0.25。

2　結(jié)果

2.1WHR基本特征描述本研究共納入研究對(duì)象1 058例，其中病例組700例，對(duì)照組358例，對(duì)照組與病例組間WHR水平差異顯著（P＜0.0001），見(jiàn)表1。

表1　病例/對(duì)照組WHR特征描述Tab 1　Traits distributions of WHR in cases and controls

2.2統(tǒng)計(jì)結(jié)果分析通過(guò)對(duì)腰臀比性狀在約55萬(wàn)個(gè)SNP位點(diǎn)、1 347條通路/基因集合中全基因組通路關(guān)聯(lián)分析研究發(fā)現(xiàn)：65條通路/集合達(dá)到顯著水平（P＜0.05），其中3條通路經(jīng)多重檢驗(yàn)校正后FDR≤0.25。如圖1、表2所示。在65條通路/集合中，rasPathway（Ras信號(hào)通路）最為顯著（empirical P=0.003，F(xiàn)DR=0.238）。另外，ceramidePathway（神經(jīng)酰胺信號(hào)通路）和hcmvPathway（人巨細(xì)胞病毒與MAPK通路）是另外兩條結(jié)果顯著的通路（分別為empirical P=0.004，F(xiàn)DR=0.196、empirical P=0.005，F(xiàn)DR=0.203）。如表3所示，Ras信號(hào)通路包含23個(gè)基因，其下游分支PI3K/AKT途徑相關(guān)基因BAD、AKT1、PIK3CA、PIK3CG、PIK3R1；MAPK/ERK 途 徑相關(guān)基因 RAF1、MAP3K1、MAPK1、MAPK3、MAP2K1和IKKβ/NF-κB途徑相關(guān)基因NFKB1和RELA等均廣泛分布于與WHR性狀相關(guān)的ceramidePathway和hcmvPathway中，提示rasPathway基因集合與WHR性狀可能存在一定的關(guān)聯(lián)性。

圖1　WHR（case/control）通路分析empirical P值分布圖Fig 1 Distribution of empirical P value of WHR related pathways in cases and controls

表2　WHR（case/control）顯著相關(guān)通路Tab 2　Significant pathways of WHR in cases and controls

表3　信號(hào)通路基因集合Tab 3　Gene set of pathways

3　討論

脂肪中心性積累與一系列的疾病如糖尿病、高血壓和心臟病等相關(guān)[8-10]，其關(guān)聯(lián)性甚至超出了廣義肥胖[11]。研究發(fā)現(xiàn)[12]，腹部肥胖者脂肪在腹腔內(nèi)臟分布，內(nèi)臟脂肪的聚集及分泌代謝多種細(xì)胞因子進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，包括IL-6、TNF-α、脂聯(lián)素、瘦素等，導(dǎo)致一系列代謝異常，如胰島素抵抗、血脂代謝異常、糖調(diào)節(jié)受損、慢性炎癥反應(yīng)等。1999年WHO將中心性肥胖（WHR:男＞0.90，女＞0.85 和（或）BMI＞30 kg/m2）作為代謝綜合征MS的診斷標(biāo)準(zhǔn)之一。2005年，國(guó)際糖尿病聯(lián)盟工作組IDF將中心性肥胖作為MS的必要診斷條件。作為一項(xiàng)重要的臨床指標(biāo)，復(fù)雜性狀WHR群體水平的遺傳學(xué)研究具有深刻的意義。本研究中，利用改良后的基因集合富集分析法對(duì)復(fù)雜性狀WHR進(jìn)行全基因組通路關(guān)聯(lián)分析，研究發(fā)現(xiàn)Ras信號(hào)通路與WHR顯著相關(guān)，其下游分支PI3K/AKT途徑、MAPK/ERK途徑和NF-κB途徑位于多條與WHR相關(guān)的通路中，如神經(jīng)酰胺信號(hào)通路和人巨細(xì)胞病毒與MAPK通路，提示Ras信號(hào)通路基因集合與WHR性狀存在一定的關(guān)聯(lián)性。

PI3K/AKT途徑和MAPK/ERK途徑及其它們的下游途徑NF-κB途徑影響細(xì)胞內(nèi)多種生物學(xué)功能，如細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞遷徙、細(xì)胞周期、免疫炎癥等。PI3K/AKT途徑是胰島素信號(hào)通路中的經(jīng)典途徑，胰島素主要通過(guò)PI3K途徑介導(dǎo)胰島素對(duì)葡萄糖、蛋白質(zhì)及脂肪代謝的調(diào)控作用。最近的研究發(fā)現(xiàn)胰島素和瘦素信號(hào)可通過(guò) PI3K/AKT、Foxo1、MAPK和mTOR通路相互作用共同調(diào)節(jié)能量代謝。MAPK/ERK途徑同樣與細(xì)胞的增殖、分化和凋亡相關(guān)，并參與炎癥、腫瘤等疾病的發(fā)生。NF-κB途徑作為PI3K/AKT途徑和MAPK/ERK途徑的下游分支，可調(diào)控多種炎癥因子的表達(dá)，在細(xì)胞凋亡、免疫、炎癥等生物學(xué)進(jìn)程中發(fā)揮作用。Zhang等[13]證實(shí)下丘腦內(nèi)側(cè)基底部的IKKβ/NF-κB途徑激活可導(dǎo)致中央胰島素和瘦素抵抗。Yuan等[14]研究發(fā)現(xiàn)炎癥反應(yīng)和IKKβ/IκB/NF-κB途徑激活是造成肥胖和飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗的主要原因。整體、器官和組織對(duì)胰島素作用的反應(yīng)性降低，可促進(jìn)肌肉、脂肪等外周組織攝取和利用葡萄糖，抑制肝糖輸出，促進(jìn)糖原與脂肪的合成，造成一系列代謝紊亂。越來(lái)越多的證據(jù)表明外周組織的脂肪累積與肥胖和2型糖尿病中發(fā)現(xiàn)的胰島素抵抗相關(guān)。在之前的通路關(guān)聯(lián)研究中，我們已經(jīng)證實(shí)Ras信號(hào)通路與歐洲裔美國(guó)人群中血漿脂聯(lián)素水平相關(guān)[15]。人體脂聯(lián)素水平與糖尿病、肥胖呈負(fù)相關(guān)，在人體內(nèi)具有廣泛的調(diào)節(jié)功能，可促進(jìn)脂肪酸氧化、增強(qiáng)葡萄糖攝取和改善胰島素抵抗等，提示Ras信號(hào)通路中PI3K/AKT途徑和MAPK/ERK途徑及其它們的下游途徑NF-κB途徑可能借助脂聯(lián)素、胰島素等信號(hào)進(jìn)行一系列代謝調(diào)控，造成糖代謝紊亂，脂肪合成增加與代謝減少，造成腹部脂肪累積，進(jìn)而影響腰臀比。

總之，本研究利用全基因組通路關(guān)聯(lián)分析全面展示了與復(fù)雜性狀WHR相關(guān)的通路網(wǎng)絡(luò)，提示Ras信號(hào)通路可能與歐洲裔美國(guó)人群中復(fù)雜性狀腰臀比具有關(guān)聯(lián)。我們準(zhǔn)備擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證，并進(jìn)行相關(guān)的功能性研究。

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