蒿鱉養(yǎng)陰軟堅方對刀豆球蛋白A誘導(dǎo)的肝纖維化Nrf2/HO-1信號通路影響

盧娜，方步武

（天津醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)系，天津300070）

肝纖維化是肝臟對持續(xù)性肝損傷的創(chuàng)傷再修復(fù)反應(yīng)的病理產(chǎn)物，其病理特征主要表現(xiàn)為肝臟內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix,ECM）的過度異常沉積[1]。肝纖維化是慢性肝病發(fā)展為肝硬化甚至是肝癌的必經(jīng)階段，美國Friedman等[2]指出肝纖維化是一個可逆的過程，因而通過有效的抗肝纖維化治療，早期的肝纖維化可以得到很好地逆轉(zhuǎn)。氧化應(yīng)激是肝纖維化發(fā)生的重要機(jī)制，Nrf2、HO-1蛋白是調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激的關(guān)鍵蛋白[3]。蒿鱉養(yǎng)陰軟堅方（HYRP）是一種養(yǎng)陰活血軟堅、涼血清熱解毒的中藥復(fù)方。本課題組以往研究發(fā)現(xiàn)，HYRP可以抑制肝星狀細(xì)胞活化，降低肝細(xì)胞的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激水平[4-5]。我國是乙肝大國，目前，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為乙型肝炎病毒感染引起的肝損傷主要與機(jī)體免疫應(yīng)答有關(guān)，免疫性肝損傷是多種急慢性肝病和繼發(fā)的肝纖維化發(fā)生的共同病理基礎(chǔ)，刀豆球蛋白A（ConA）誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷模型已被證實為以T淋巴細(xì)胞為主介導(dǎo)的免疫性肝損傷[6]。因此，本實驗擬通過蒿鱉養(yǎng)陰軟堅方對ConA誘導(dǎo)小鼠肝纖維化模型中肝臟組織病理及肝纖維化指標(biāo)、Nrf2和HO-1蛋白的表達(dá)作用，探討該方是否能夠激活Nrf2/HO-1信號通路，降低肝纖維化水平，抑制免疫性肝損傷。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗動物Balb/c小鼠240只，SPF級，雌雄各半，體質(zhì)量為18~22 g，購自解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心。飼養(yǎng)過程中自由進(jìn)食水和食物，室溫20~22℃，適應(yīng)環(huán)境3 d后用于實驗。

1.1.2儀器設(shè)備CX31-12C04型光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司），VIS-7220紫外可見分光光度計（北京瑞利分析儀器公司），HZS-H型水浴振蕩器，電熱鼓風(fēng)干燥箱。

1.1.3試劑蒿鱉養(yǎng)陰軟堅方制備成原料藥粉，用前配成混懸液；ConA、秋水仙堿和L-羥脯氨酸（Hyp）均為美國Sigma公司產(chǎn)品，批號分別為：C5275，C391，56250；烏來糖：上海潤捷化學(xué)試劑有限公司；氯胺T：天津市化學(xué)試劑一廠，批號010708；高氯酸、對二甲氨基苯甲醛：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；DAB顯色試劑盒：博士德生物，批號AR1002；超敏二步法免疫組化檢測試劑盒：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號PV-9001；Nrf2兔源多克隆抗體：北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號bs-1074R；HO-1鼠源單克隆抗體：美國Santa Cruze公司，批號sc-390991；二甲苯、無水乙醇：天津市天新精細(xì)化工開發(fā)中心；過氧化氫、磷酸氫二鈉、氯化鈉：天津市江天化工技術(shù)有限公司；枸櫞酸、磷酸二氫鈉、三水醋酸鈉、鹽酸：天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；異丙醇、檸檬酸三鈉：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；中性樹脂：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號10004160；生物染色劑：Mayer蘇木素染液、蘇木精染液、伊紅染液、天狼猩紅-飽和苦味酸液、天青石藍(lán)液。

1.2方法

1.2.1ConA模型制備及實驗分組實驗分為6組，即正常、模型、秋水仙堿（0.13 g/kg）和蒿鱉養(yǎng)陰軟堅方低、中、高劑量（1.16 g/kg3、.36 g/kg、11.58 g/kg）組，ConA用量15 mg/kg，溶解于無菌無熱源的0.9%NaCl生理鹽水注射液中，配制成1.5mg/mL，經(jīng)0.22μm微孔濾器過濾除菌。尾靜脈注射10 μL/g ConA進(jìn)行造模，每周1次，持續(xù)10周，末次注射后1周內(nèi)處死小鼠。各組復(fù)制模型開始即同時經(jīng)口灌胃相應(yīng)藥物，灌胃體積為0.1 mL/10 g體質(zhì)量，正常組和模型組均經(jīng)口灌胃相應(yīng)體積的蒸餾水，每日1次，每周用藥6 d至實驗結(jié)束。

1.2.2標(biāo)本采集末次用藥24 h后，小鼠用乙醚麻醉，留取肝右葉組織（1.0 cm×1.0 cm）2塊。一部分以10%福爾馬林中性緩沖液固定后石蠟包埋切片；另一部分置于氯仿-甲醇脫水脫蠟液（V/V=2:1）中，每天換液1次，持續(xù)6 d，備測Hyp濃度。

1.3指標(biāo)測定

1.3.1小鼠一般狀態(tài)每日注意觀察小鼠的精神狀態(tài)、活動、進(jìn)食量、體質(zhì)量變化等情況。

1.3.2肝組織病理學(xué)觀察常規(guī)石蠟切片做HE染色檢查肝組織結(jié)構(gòu)和Siriusred染色觀察膠原纖維形成的情況。

1.3.3肝組織羥脯氨酸濃度測定采用Jamall氏法[7]。

1.3.4肝組織Nrf2、HO-1蛋白的表達(dá)情況采用免疫組化法，光鏡下觀察Nrf2、HO-1蛋白的表達(dá)情況。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析利用SPSS 16.0軟件分析處理數(shù)據(jù)，各項計量數(shù)據(jù)均以±s表示，兩組間樣本比較采用t檢驗，P＜0.05時，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1小鼠一般情況及死亡情況正常組小鼠一般狀態(tài)良好，皮毛柔順有光澤，飲食量正常；模型組小鼠隨著給藥時間延長，活動量減少，精神萎靡，皮毛松弛無光澤，飲食量減少，體質(zhì)量減輕；各治療組小鼠一般狀態(tài)明顯好于ConA模型組，皮毛少光澤，體質(zhì)量減輕。

2.2蒿鱉養(yǎng)陰軟堅方對ConA模型小鼠肝組織病理學(xué)的影響HYRP對ConA模型小鼠肝組織形態(tài)的影響見圖1；HYRP對ConA模型小鼠肝臟膠原纖維的影響見圖2。

圖1　HYRP對Con A誘導(dǎo)肝纖維化小鼠肝組織形態(tài)的影響（HE 染色，×200）Fig 1　Effect of HYRP on histological profiles of liver tissues in mice with hepatic fibrosis induced by ConA(HE staining×200)

圖2　HYRP對ConA模型小鼠肝臟膠原纖維的影響（Siriusred染色，×500）Fig 2 Effect of HYRP on hepatic fibrosis induced by ConA(Siriusred staining,×500)

HE染色和Siriusred染色顯示正常組小鼠肝細(xì)胞形態(tài)大小正常，肝小葉結(jié)構(gòu)正常，無炎性細(xì)胞浸潤，匯管區(qū)纖維組織無增生。模型組小鼠肝組織出現(xiàn)嚴(yán)重的損傷性病理改變，少數(shù)細(xì)胞腫脹及嗜酸性變，散在不同程度的小葉內(nèi)壞死，有較多炎性細(xì)胞浸潤，肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞索排列紊亂，匯管區(qū)纖維組織增生，并可見厚薄不一的纖維間隔形成。與模型組比較，蒿鱉養(yǎng)陰軟堅方各劑量組和秋水仙堿組小鼠肝組織損傷性病理改變明顯減輕，炎性細(xì)胞浸潤和壞死減少，肝小葉結(jié)構(gòu)接近正常，肝細(xì)胞索排列接近正常，匯管區(qū)纖維組織增生減少。

2.3蒿鱉養(yǎng)陰軟堅方對ConA模型小鼠肝組織羥脯氨酸濃度的影響與正常組相比，模型組小鼠肝組織羥脯氨酸濃度顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，各治療組羥脯氨酸濃度均有不同程度的降低（P＜0.05）。結(jié)果見表 1。

表1　HYRP對ConA模型小鼠肝組織羥脯氨酸濃度的影響（±s）Tab 1 Effect of HYRP on hydroxyproline concentration in mice with hepatic fibrosis induced by ConA（±s）

表1　HYRP對ConA模型小鼠肝組織羥脯氨酸濃度的影響（±s）Tab 1 Effect of HYRP on hydroxyproline concentration in mice with hepatic fibrosis induced by ConA（±s）

與正常組比較，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05

實驗分組n羥脯氨酸濃度/（μ g/m L）正常組　6　0.2 3±0.0 4模型組　1 0　0.7 0±0.3 5**蒿鱉養(yǎng)陰軟堅方低劑量組　1 2　0.4 6±0.1 9蒿鱉養(yǎng)陰軟堅方中劑量組　9　0.4 1±0.1 8#蒿鱉養(yǎng)陰軟堅方高劑量組　6　0.3 7±0.1 5#秋水仙堿組　7　0.3 9±0.1 8#

2.4蒿鱉養(yǎng)陰軟堅方對ConA模型小鼠肝組織Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)的影響與模型組Nrf2細(xì)胞核內(nèi)淺棕紅著色比較，蒿鱉養(yǎng)陰軟堅方各劑量組大部分細(xì)胞核內(nèi)均呈較深棕紅色著色，且隨著藥物濃度的升高，Nrf2在胞核內(nèi)的表達(dá)逐漸增強(qiáng)，甚至出現(xiàn)棕褐色著色（圖3）。與模型組HO-1細(xì)胞漿的微棕色著色比較，蒿鱉養(yǎng)陰軟堅方各劑量組大部分細(xì)胞胞漿內(nèi)均呈較深棕黃著色，且隨著藥物濃度的升高，HO-1在胞漿內(nèi)的表達(dá)逐漸增強(qiáng)（圖4）。

圖3　HYRP對ConA模型小鼠肝組織Nrf2蛋白表達(dá)的影響（×40）Fig 3 Effect of HYRP on expression of Nrf2 protein in liver tissues of ConA-induced hepatic fibrosis（×40）

圖4　HYRP對ConA模型小鼠肝組織HO-1蛋白表達(dá)的影響（×40）Fig 4 Effect of Haobie yangyin ruanjian prescription on expression of HO-1 protein in liver tissues of ConA-induced hepatic fibrosis

3　討論

在肝纖維化發(fā)展過程中，多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的平衡被打破，多種促纖維化因子的合成增多、活性發(fā)生改變，而抗肝纖維化因子的作用減弱或受到抑制，最終導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)代謝失衡而過度沉積，誘發(fā)肝纖維化的發(fā)生。

氧化應(yīng)激是肝纖維化發(fā)生的重要機(jī)制。肝損傷時，細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）濃度顯著升高破壞了機(jī)體的氧化/抗氧化系統(tǒng)平衡，誘導(dǎo)肝細(xì)胞釋放大量的炎性細(xì)胞因子，進(jìn)而活化肝星狀細(xì)胞，加劇肝纖維化的演變。Nrf2屬于Capncollar轉(zhuǎn)錄因子家族成員，具有亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)蛋白，可與細(xì)胞核內(nèi)的小Maf蛋白形成異源二聚體，經(jīng)乙?；冉Y(jié)構(gòu)修飾后實現(xiàn)其高活性狀態(tài)，進(jìn)而與抗氧化反應(yīng)元件ARE結(jié)合啟動下游II相解毒酶及抗氧化蛋白基因的轉(zhuǎn)錄[8]。HO-1是II相解毒酶中最容易被誘導(dǎo)的抗氧化酶，它能夠?qū)⑺ダ匣蚱茡p的紅細(xì)胞釋放的血紅素降解為膽綠素、Fe2+和一氧化碳，而這3種催化產(chǎn)物對于維持細(xì)胞內(nèi)氧化平衡均有重要的作用[9-11]。

本研究選擇ConA作為誘導(dǎo)劑，建立小鼠自身免疫性肝纖維化動物模型。ConA誘導(dǎo)小鼠肝纖維化模型更適合用于研究人類自身免疫性肝病的病理機(jī)制和進(jìn)行抗肝損傷的藥物篩選[12]。研究結(jié)果顯示，正常組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)正常，模型組肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，匯管區(qū)可見大量炎性細(xì)胞浸潤，纖維組織增生，Nrf2、HO-1弱陽性表達(dá)，而與模型組相比，蒿鱉養(yǎng)陰軟堅方治療組大部分肝小葉結(jié)構(gòu)接近正常，肝細(xì)胞索排列接近正常，匯管區(qū)有少量炎性細(xì)胞浸潤，纖維組織增生減少，Nrf2、HO-1在細(xì)胞漿中的陽性表達(dá)明顯升高，呈深棕色，且Nrf2在細(xì)胞核中也有陽性表達(dá)，呈劑量依賴性。

蒿鱉養(yǎng)陰軟堅方為養(yǎng)陰活血軟堅、涼血清熱解毒中藥復(fù)方，由青蒿、鱉甲、生地、丹參、虎杖、白花蛇舌草等9味中藥組成，上述藥物在慢性肝?。ǜ卫w維化、肝硬化等）的臨床治療上使用頻率較高、療效好。前期研究表明，蒿鱉養(yǎng)陰軟堅方對牛血清白蛋白、血吸蟲病、酒精、CCl4復(fù)合因素所致的肝纖維化均有預(yù)防和治療作用[4-5,13-16]。本次研究發(fā)現(xiàn)，蒿鱉養(yǎng)陰軟堅方能夠減輕ConA誘導(dǎo)的肝纖維化增生程度，降低肝組織中羥脯氨酸濃度，抑制炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)Nrf2和HO-1蛋白的表達(dá)。

綜上所述，蒿鱉養(yǎng)陰軟堅方具有改善ConA模型小鼠的臨床癥狀和病理學(xué)變化及對抗免疫性肝損傷的作用，其機(jī)制可能與蒿鱉養(yǎng)陰軟堅方能夠激活Nrf2/HO-1信號通路有關(guān)，這為臨床上治療肝纖維化提供了新的思路。

參考文獻(xiàn)：

[1]Seki E,Brenner D A.Recent advancement of molecular mechanisms of liver fibrosis[J].J Hepatobiliary Pancreat Sci,2015,22(7):512

[2]Friedman S L.Hepatic fibrosis:emerging therapies[J].Dig Dis,2015,33(4):504

[3]Loboda A,Damulewicz M,Pyza E A,et al.Role of Nrf2/HO-1 system in development,oxidative stress response and diseases:an evolutionarily conserved mechanism[J].CellMol Life Sci,2016,73(17):3221

[4]劉紅艷，方步武，率紅莉，等．蒿鱉養(yǎng)陰軟堅方對肝纖維化大鼠抗氧化損傷與誘導(dǎo)凋亡的作用[J]．天津醫(yī)藥，2010，38（10）：884

[5]張永進(jìn)，方步武．蒿鱉養(yǎng)陰軟堅方藥物血清對肝星狀細(xì)胞的作用[J]．中藥藥理與臨床，2011，27（1）：89

[6]Ren F,Chen X,Hesketh J,et al.Selenium promotes T-cell response to TCR-stimulation and ConA,but not PHA in primary porcine splenocytes[J].PLoS One,2012,7(4):e35375

[7]Jamall I S,Finelli V N.Que Hee S S.A simple method to determine nanogram levels of 4-hydroxyproline in biological tissues[J].Anal Biochem,1981,112(1):70

[8]Chen B,Lu Y,Chen Y,et al.The role of Nrf2 in oxidative stressinduced endothelial injuries[J].J Endocrinol,2015,225(3):83

[9]Tell G,Gustincich S.Redox state,oxidative stress,and molecular mechanisms of protective and toxic effects of bilirubin on cells[J].Curr Pharm Des,2009,15(25):2908

[10]Farina M,Avila D S,Da Rocha J B,et al.Metals,oxidative stress and neurodegeneration:a focus on iron,mangenese and mercury[J].Neurochem Int,2013,62(5):575

[11]Fireman E.Ultrafine and nanoparticles-induced oxidative stress:the role of heme oxygenase-1 and carbon monoxide as antiinflammatory pathways[J].J Asthma,2012,49(1):8

[12]Wang H X,Liu M,Weng S Y,et al.Immune mechanisms of concanavalin A model of autoimmune hepatitis[J].World J Gastroenterol,2012,18(2):119

[13]邢偉，孔維涵，方步武．蒿鱉養(yǎng)陰軟堅方對免疫性肝纖維化大鼠的治療作用[J]．中草藥，2010，10（41）：1667

[14]寇詠梅，劉潔瑩，方步武．蒿鱉養(yǎng)陰軟堅方抗小鼠血吸蟲病肝纖維化及其機(jī)制的研究[J]．現(xiàn)代藥物與臨床，2013，3（28）：288

[15]趙敏，郭娟，方步武，等．蒿鱉養(yǎng)陰軟堅方對大鼠酒精性肝損傷的預(yù)防作用[J]．時珍國醫(yī)國藥，2010，11（21）：2887

[16]楊鳳蕊，婁建石，方步武．蒿鱉養(yǎng)陰軟堅方抗CCl4復(fù)合因素所致大鼠肝纖維化的作用[J]．中草藥，2011，3（42）：530