AMPK對(duì)Rab-GAP的調(diào)節(jié)作用研究

廖健文，岳瑩瑩，牛文彥

（天津醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)系，天津300070）

糖尿病是一種常見的以糖代謝紊亂、血糖水平增高為特征的代謝內(nèi)分泌疾病[1]。90%的糖尿病是2型糖尿病，其特征是胰島素抵抗[1]，通過非胰島素依賴途徑提高組織器官對(duì)葡萄糖的攝取是預(yù)防和治療2型糖尿病的關(guān)鍵。單磷酸腺苷激活蛋白激酶（AMPK）是細(xì)胞能量變化的感受器[2]，當(dāng)AMPK被激活，通過調(diào)節(jié)下游的信號(hào)通路，例如，直接磷酸化乙酰-CoA羧化酶（ACC）和3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶（HMGCR），能抑制合成代謝并促進(jìn)分解代謝。激活A(yù)MPK能增加骨骼肌對(duì)葡萄糖的攝取，增強(qiáng)胰島素敏感性[3]，運(yùn)動(dòng)/肌肉收縮可激活A(yù)MPK[4]。TBC1D1和TBC1D4（又稱AS160）是小G蛋白 Rab的GTP酶活化蛋白（Rab-GAP），通過調(diào)節(jié)其下游的Rab參與GLUT4從細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存囊泡到細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)位[5-7]。TBC1D1和TBC1D4都包含一個(gè)Rab-GAP結(jié)構(gòu)域和多個(gè)磷酸化位點(diǎn)。迄今發(fā)現(xiàn)TBC1D1的磷酸化位點(diǎn)有 Ser237、Ser263、Ser507、Ser565、Thr590和 Thr596[8]，TBC1D4 的磷酸化位點(diǎn)有 Ser318、Ser341、Ser570、Ser588、Ser591、Ser666、Ser704、Ser751、Thr6 42、Thr649[6]。運(yùn)動(dòng)收縮激活A(yù)MPK，磷酸化 TBC1D1 和TBC1D4，促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4（GLUT4）向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)位轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞[7，9]，但AMPK是否位于TBC1D1和TBC1D4的上游，直接調(diào)節(jié)它們的磷酸化，特別是AMPK對(duì)TBC1D1 Thr590和TBC1D4 Ser318的調(diào)節(jié)作用尚不清楚。本研究應(yīng)用激活型AMPK腺病毒（Ad-AMPK-CA）感染骨骼肌細(xì)胞，檢測(cè)AMPK對(duì)TBC1D1 Thr590和TBC1D4 Ser318的直接作用，明確它們之間的上下游關(guān)系。

1　材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料小鼠骨骼肌細(xì)胞株C2C12（美國(guó)ATCC公司），HEK293β5細(xì)胞和激活型AMPK腺病毒重組質(zhì)粒（Ad-AMPK-CA）由廈門大學(xué)林圣彩教授實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)與，DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)GIBCO公司），胎牛血清（以色列Bioind公司），抗磷酸化ACC、TBC1D1、TBC1D4和β-actin抗體（美國(guó)CST公司），偶聯(lián)HRP的山羊抗兔抗體（美國(guó)JacksonImmuno Research公司），增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光底物檢測(cè)試劑盒（美國(guó)Millipor公司），Tanon-5200化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（北京原平皓生物技術(shù)有限公司）。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1Ad-AMPK-CA擴(kuò)增和提取將HEK293細(xì)胞接種在6孔板中，待細(xì)胞密度長(zhǎng)至70%~80%，加入含腺病毒的上清液，感染48~72 h，出現(xiàn)細(xì)胞變圓、漂浮、破裂的病變現(xiàn)象。當(dāng)孔底只剩下50%貼附細(xì)胞時(shí)，收集細(xì)胞，液氮速凍后37℃水浴溶解，反復(fù)操作3次，離心收集上清，分裝凍存于-80℃。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)C2C12小鼠骨骼肌細(xì)胞分別用含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基接種于6孔板中，在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞密度達(dá) 100%時(shí)分別加入 0、40、80、160、320、750 μL的腺病毒，孵育12 h后棄去培養(yǎng)基，加入新鮮的含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基分別孵育 0、24、48、72 h。

1.2.3細(xì)胞內(nèi)熒光分布檢測(cè)細(xì)胞成像系統(tǒng)對(duì)C2C12小鼠骨骼肌細(xì)胞進(jìn)行熒光檢測(cè)分析，確定腺病毒在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。

1.2.4MTS 實(shí)驗(yàn)檢測(cè) 0、40、80、160、320、750 μL的腺病毒作用于C2C12細(xì)胞48 h對(duì)細(xì)胞生存率的影響，MTS法測(cè)定細(xì)胞生存率的改變。

1.2.5Western blot檢測(cè)蛋白磷酸化用含蛋白酶抑制劑（1 mmol/L Na3VO4，0.5 mmol/L NaF，200 μmol/L PMSF，1 μmol/L PIC）的細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞后，4 ℃12 000 r/min離心20 min，收集上清。按照BCA Protein Assay Kit說明書測(cè)定蛋白濃度，再與5×LSB緩沖液按4∶1的比例混合，沸水浴5 min，10%（v/v）SDS-PAGE電泳分離蛋白樣品，轉(zhuǎn)到PVDF膜上，用5%牛奶蛋白封閉1.5 h，再分別用各自一抗4℃孵育過夜，二抗使用偶聯(lián)HRP的山羊抗兔IgG孵育1.5 h，蛋白條帶用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)。β-actin為內(nèi)參，Image J軟件定量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用GraphPad Prism6統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以±sx表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1不同濃度的腺病毒在C2C12細(xì)胞中的表達(dá)腺病毒質(zhì)粒中帶有綠色熒光蛋白GFP，可通過細(xì)胞成像系統(tǒng)檢測(cè)腺病毒在C2C12細(xì)胞的表達(dá)。分別加入0、40、80、160、320、750 μL 的腺病毒感染 C2C12 細(xì)胞48 h。如圖1所示，腺病毒均在C2C12中表達(dá)，說明腺病毒已轉(zhuǎn)染到C2C12細(xì)胞中。

圖1　不同濃度的Ad-AMPK-CA在C2C12細(xì)胞中的表達(dá)Fig 1 Expressions of Ad-AMPK-CA in different concentrations in C2C12 cells

2.2感染不同時(shí)間后腺病毒在C2C12細(xì)胞中的表達(dá)加入80 μL的腺病毒分別感染C2C12細(xì)胞0、24、48、72 h。如圖 2 所示，在 C2C12 細(xì)胞中，腺病毒均有表達(dá)，48 h達(dá)高峰，72 h后減弱。

圖2C2C12感染Ad-AMPK-CA不同時(shí)間后在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)Fig 2　Expressions of Ad-AMPK-CA in different time after infection in C2C12 cells

2.3MTS法檢測(cè)腺病毒對(duì)C2C12細(xì)胞活性的影響分別加入 40、80、160、320、750 μL 的腺病毒感染 C2C 12細(xì)胞48h。如圖3所示，40、80、160、320、750μL處理組的細(xì)胞存活率分別為對(duì)照組（0μL）的100.95%、94.23% 、90.64%（P<0.01）、93.25%（P<0.05）、88.56%（P<0.001），說明腺病毒在 160、320、750 μL 時(shí)對(duì)C2C12細(xì)胞具有明顯的細(xì)胞毒性，而在低于80 μL時(shí)則未表現(xiàn)出細(xì)胞毒性，后續(xù)實(shí)驗(yàn)應(yīng)用80 μL腺病毒感染細(xì)胞48 h。

圖3Ad-AMPK-CA對(duì)C2C12細(xì)胞生存率的影響Fig 3 The effect of Ad-AMPK-CA on the viability of C2C12 cells

2.4Western blot檢測(cè)ACC S79磷酸化通過檢測(cè)AMPK下游蛋白分子ACC的磷酸化明確AMPK的活性。如圖4所示，80 μL Ad-AMPK-CA感染細(xì)胞48 h后，感染效率約為90%，ACC磷酸化水平升至對(duì)照組的（1.99±0.31）倍（*P<0.05），表明腺病毒發(fā)揮作用。

圖4C2C12細(xì)胞ACC的磷酸化Fig 4 Phosphorylation of ACC in C2C12 cells

2.5Western blot檢測(cè)TBC1D1和TBC1D4的磷酸化如圖5所示，80 μL Ad-AMPK-CA感染48 h后，TBC1D1 Thr590和TBC1D4 Ser318分別升至對(duì)照組的（1.68±0.01）倍和（1.71±0.11）倍 ，表明 AMPK可以直接磷酸化這兩個(gè)Rab-GAP。

圖5C2C12細(xì)胞TBC1D1和TBC1D4的磷酸化Fig 5 Phosphorylation of TBC1D1 and TBC1D4 in C2C12 cells

3　討論

AMPK是絲氨酸/蘇氨酸激酶，其信號(hào)通路是治療2型糖尿病的靶點(diǎn)[10-11]。AMPK包括α、β和γ 3種亞基，β和γ亞基起調(diào)節(jié)作用，α亞基起催化作用，主要代表AMPK的活性。α亞基又分為α1和α2兩個(gè)亞型，α1亞型廣泛表達(dá)，α2亞型高表達(dá)于肝臟、骨骼肌和心肌細(xì)胞中[12]。AMPK在不同組織中的調(diào)節(jié)方式不同，在骨骼肌等外周組織，AMPK激活后，通過增加葡萄糖攝取降低血糖；在肝組織中，激活的AMPK主要通過抑制肝臟葡萄糖的異生和脂質(zhì)的合成，促進(jìn)脂質(zhì)氧化而降低血糖；在脂肪組織中激活A(yù)MPK減少脂質(zhì)生成?？傊?，AMPK在上述不同的組織中均廣泛表達(dá)，降低了機(jī)體中葡萄糖和脂肪酸水平，減少了脂質(zhì)過度堆積，從而改善骨骼肌、脂肪和肝臟的胰島素抵抗，提高胰島素敏感性[13]。AMPK感受細(xì)胞能量的變化，細(xì)胞內(nèi)AMP濃度升高激活A(yù)MPK，本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)AMPK下游信號(hào)分子ACC的磷酸化判斷AMPK的活性。

小G蛋白R(shí)ab是一類GTP酶，有與GTP結(jié)合的活化形式和與GDP結(jié)合的失活形式，作用于特定細(xì)胞器使囊泡依次出芽、移動(dòng)，然后與細(xì)胞膜融合等，調(diào)節(jié)囊泡內(nèi)吞和外排。TBC1D1和TBC1D4是Rab的GTP酶激活蛋白，其主要功能為通過調(diào)節(jié)Rab的活性調(diào)節(jié)GLUT4囊泡向細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)位，調(diào)節(jié)骨骼肌細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)[7,9]。TBC1D1和TBC1D4磷酸化水平升高，其GAP活性被抑制，相關(guān)的Rabs被解除抑制，從而促進(jìn)GLUT4轉(zhuǎn)位。TBC1D1和TBC1D4有多個(gè)磷酸化位點(diǎn)。

胰島素和運(yùn)動(dòng)是促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的兩個(gè)重要生理因素[14]。TBC1D1和TBC1D4受胰島素調(diào)節(jié)，參與 GLUT4 轉(zhuǎn)位。TBC1D4 Thr642、Ser341、Ser704 位點(diǎn)在運(yùn)動(dòng)和胰島素作用下均能被磷酸化[15]。AMPK是運(yùn)動(dòng)的信號(hào)分子，很多研究顯示運(yùn)動(dòng)/骨骼肌收縮激活A(yù)MPK是引起TBC1D4磷酸化的重要中間信號(hào)分子[16-17]。小鼠離體骨骼肌收縮可導(dǎo)致TBC1D4 Ser588、Ser591、Thr642 磷酸化水平升高[18]。有研究者提出，AMPK可能是TBC1D1磷酸化的觸發(fā)器，磷酸化的TBC1D1通過加強(qiáng)與14-3-3蛋白結(jié)合使Rab-GAP活性下降，從而導(dǎo)致GLUT4轉(zhuǎn)位[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，激活型AMPK直接磷酸化TBC1D1 Thr590和 TBC1D4 Ser318，提示 AMPK是 TBC1D1和TBC1D4的上游激酶，可調(diào)節(jié)TBC1D1 Thr590和TBC1D4 Ser318。

綜上所述，AMPK是兩個(gè) Rab-GAP（TCB1D1和TCB1D4）的上游激酶，可直接磷酸化TBC1D1和TBC1D4。

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