肝硬化大鼠ALPPS模型的建立

肖遵強　黃靜　于茜　張孔亮　熊超杰　陸才德

原發(fā)性肝癌是國人最常見的惡性腫瘤之一[1]。目前臨床治療肝癌最有效的方法是手術切除，但我國大部分肝癌患者有乙型肝炎肝硬化背景，肝硬化后肝臟可切除體積減少，術后往往出現(xiàn)肝臟剩余體積不足，導致肝衰竭。2012年德國學者首次報道了一種新的手術方式-聯(lián)合門靜脈結扎與原位肝臟劈離的二步肝切除術（associating liver partition with portal vein ligation for staged hepatectomy,ALPPS）[2]。ALPPS可在短期內大大增加術后肝臟剩余體積，提高手術切除率，但該術式主要應用于轉移性肝癌[3]，應用于原發(fā)性肝癌的報道少見。目前已有正常大鼠ALPPS模型建立的報道[4-5]。本研究在肝硬化大鼠上成功建立ALPPS模型，現(xiàn)報道如下，以供同行參考。

1　材料和方法

1.1材料113只健康雄性SD大鼠購于浙江省醫(yī)學科學院，飼養(yǎng)于寧波大學無特定病原體（SPF）級動物房，周齡6～8周，體重（200±20）g。四氯化碳（CCl4）、1%戊巴比妥鈉購于寧波航景生物有限公司，青霉素購于山東圣旺藥業(yè)有限公司，蘇木素-伊紅購于北京索萊寶科技有限公司。手術顯微鏡購于美國Olympus公司，顯微外科手術器械為北京北方三友醫(yī)療器械有限公司產品，托盤天平購于寧波市義久電子科技有限公司，單微級電凝購于廣州市邦善醫(yī)療器械有限公司，2-0絲線、5-0絲線、8-0絲線為美國強生公司產品，自制鼠臺。

1.2方法

1.2.1大鼠肝硬化模型建立采用腹腔注射CCl4的方法建立大鼠肝硬化模型[6]，60%CCl4的橄欖油溶液3ml/g腹腔皮下注射，3次/周。50只大鼠按腹腔注射CCl4的時間分為正常組和實驗組，實驗組又分為4周組、8周組、12周組、16周組，每組10只。4個實驗組分別于第4、8、12、16周末處死大鼠，正常組于16周末處死大鼠。

1.2.2肝硬化大鼠ALPPS模型建立[圖1、圖2（見插頁）]選取成模率最高的實驗組，按照該組方法再建肝硬化大鼠模型50只。該50只肝硬化大鼠行ALPPS。所有操作均在清潔的環(huán)境下實施。所有大鼠術前禁食12 h、禁水4 h。手術方法：1%戊巴比妥鈉（40mg/kg）腹腔注射麻醉，腹部剃毛后，固定于鼠板，消毒鋪巾，放置于顯微鏡下，作正中切口，逐層開腹；開腹后首先游離大鼠鐮狀韌帶，沿肝葉游離肝周韌帶，充分松解肝臟，用濕潤棉簽將肝葉翻出腹腔，暴露肝門結構，注意切勿暴力翻轉，避免肝臟劃傷；自門靜脈下端向上端分離門靜脈，避免損傷膽管；沿各肝葉外解剖門靜脈分支，并使與之伴行的肝動脈與肝膽管之間有較充分的空隙。大鼠肝臟按順時鐘方向分為尾葉、右葉、中葉、左內葉、左外葉、乳頭葉，各葉具有相對獨立的Glisson系統(tǒng)和脈管回流系統(tǒng)，用5-0絲線分別結扎大鼠尾葉、右葉、左外葉、左內葉處門靜脈分支，保留中葉及乳頭葉血供。當出現(xiàn)右葉與左內葉缺血線后作標記，采用8-0絲線結扎左右肝實質后用顯微剪沿缺血線標記進行肝實質劈離。肝斷面出血點用8-0絲線結扎或用微單級電凝止血。最后，用無菌塑料薄膜包裹肝斷面，防止術后斷面粘連，術后用5%葡萄糖氯化鈉溶液5ml腹腔內滴注，予2-0絲線關腹；術畢，青霉素20萬U/kg大腿內側肌肉注射，38℃電熱毯復溫至大鼠蘇醒。術后7d處死大鼠，觀察肝臟結構。

圖1　SD大鼠各門靜脈分支、肝葉比重及ALPPS示意圖

1.3觀察指標各組肝硬化大鼠處死后，肝臟組織固定保存于甲醛溶液中，組織切片后行HE染色，在Olympus顯微鏡下觀察肝臟組織形態(tài)學變化，以出現(xiàn)假小葉視為建模成功，比較各組大鼠成模率。肝硬化大鼠ALPPS模型以大鼠術后存活7d及以上視為建模成功，觀察肝硬化大鼠ALPPS建模成功率。

2　結果

2.1肝硬化大鼠建模結果

2.1.1一般情況4周組、8周組、正常組大鼠至處死時間前全部存活（死亡率0.0%），12周組大鼠至處死時間前死亡2只（死亡率20.0%，），16周組大鼠至處死時間前死亡7只（死亡率70.0%）。解剖死亡大鼠，腹腔未見明顯損傷，考慮長時間腹腔注射CCl4，個體劑量不耐受，中樞抑制、呼吸衰竭致死亡。12周組成模率最高，為80.0%，各組大鼠成模率比較見表1。

表1　各組大鼠成模率比較

2.1.2大鼠肝臟改變見圖3（插頁）。

由圖3可見，正常組大鼠肝臟被膜光滑，呈暗紅色，質地中等，邊緣銳利。實驗組大鼠隨著腹腔注射CCl4時間的延長，肝臟被膜見部分纖維化，色澤較正常肝臟暗淡，質地偏硬，邊緣圓鈍，肝臟被膜與鄰近器官有輕度粘連；肝臟病理改變?yōu)楦渭毎咀冃院脱装Y同時存在，肝組織出現(xiàn)不同程度的水樣變性及氣球樣變性，變性程度輕者肝細胞腫大，胞質疏松、淡染，有些肝細胞內可見小空泡形成，變性程度較重者細胞體積明顯增大變圓；隨著腹腔CCl4注射時間的延長，8周組炎癥及脂肪變性最明顯，12周組可見肝纖維化明顯增加。

2.2肝硬化大鼠ALPPS建模結果本研究選擇12周組肝硬化大鼠為行ALPPS的大鼠。50只肝硬化大鼠，術后存活7d及以上40只，建模成功率為80.0%，手術時間（26.75±12.15）min；死亡原因主要為術前麻醉過深，術中失血、膈肌穿孔、下腔靜脈損傷、肝靜脈分支損傷，術后肝功能衰竭、膽瘺、腹腔感染。存活大鼠7d后處死可見肝右中葉明顯增大。

3　討論

CCl4是建立肝硬化大鼠模型的常見誘導劑，其主要的誘導機制是是氧化應激反應，通過細胞色素p450介導活化引起的實驗性肝損傷的自由基[7]，影響肝細胞的細胞膜結構和功能，纖維結締組織明顯增生，最終形成肝硬化。腹腔注射具有操作簡便、動物吸收快、肝藥物濃度高、成模時間短、毒副作用降低等優(yōu)點，死亡率為20%～35%[8]。崔承虎等[9]報道腹腔注射給藥肝硬化建模效果優(yōu)于皮下注射和灌胃方法，大鼠死亡率腹腔注射、皮下注射、灌胃依次升高。本研究需二次建模，需選擇肝硬化成模率高且建模時間短的方法，保證行ALPPS手術時，大鼠盡可能處于壯年期，減少鼠齡對ALPPS效果的影響。

SD實驗大鼠是一種應用廣泛的實驗動物，在解剖和組織結構、生理現(xiàn)象、生化代謝、疾病的發(fā)生機理特點等方面與人類很相似。大鼠肝臟按順時鐘方向分為尾葉、右葉、中葉、左內葉、左外葉、乳頭葉，各葉具有相對獨立的Glisson系統(tǒng)和脈管回流系統(tǒng)，各肝葉形態(tài)、比例較為恒定，易行門靜脈分支的分離和結扎，而對其他肝葉無影響[10]。另外，大鼠肝中葉與左內葉解剖上雖然相連，但血供獨立，為肝實質離斷模型建立創(chuàng)造條件。有學者采用保留中葉的血供，劈離肝中葉與左內側葉術式的ALPPS模型，其保留的殘肝約為28%[10]。筆者曾用16周組大鼠與12周組大鼠行預實驗，結果顯示16周組與12周肝硬化大鼠行ALPPS后，7d內大鼠均死亡，考慮肝硬化后，術后肝剩余體積不足，出現(xiàn)肝衰竭死亡。為此，筆者參考SD大鼠肝葉的解剖[11]，增加了不結扎肝葉的數(shù)量，保留中葉及乳頭葉的血供，其保留的殘肝約為35%。但筆者發(fā)現(xiàn)16周組大鼠依然無法耐受手術，而12周組肝硬化大鼠尚能耐受手術，其原因可能是16周組大鼠肝硬化更為嚴重。另外，分析肝硬化大鼠成模率，16周組大鼠肝硬化成模率遠低于12周組，故本實驗采用12周組肝硬化大鼠作為ALPPS建模大鼠。

筆者總結ALPPS操作要點如下。（1）手術入路：開腹時應選擇正中切口，防止腹壁靜脈損傷，減少出血，且切口不易過大，以4～5cm為宜，避免腸管外露影響操作，同時避免術后感染風險的增加。（2）手術暴露：因大鼠肝臟位于橫膈下的上腹部，位置較高，常規(guī)難以暴露，可在大鼠背部墊高，使肝臟位置下移，易于暴露；肝鐮狀韌帶是肝中葉和左內葉的分隔標志，切斷此韌帶時，應在明視下操作，防止損傷膈肌，造成大鼠氣胸死亡。（3）術中結扎：肝十二指腸韌帶起于第一肝門，止于十二指腸，前窄后闊，可在顯微鏡下，先從十二指腸段處分離3者，以絲線分別懸吊；肝背下腔靜脈被肝中葉、左內葉及尾狀葉少許肝組織包繞，結扎右葉及尾葉時，應盡量在肝外解剖Glisson系統(tǒng)，且探針方向盡量沿矢狀位解剖，避免探針捅傷肝背下腔靜脈，引起術中難以控制的大出血。左外葉、左內葉血管共干，目前傾向于將左內葉與肝中葉視為同一解剖單位[11-12]，在肝外辨別其血管共干，避免單支結扎。（4）肝葉劈離：上述血管結扎后，正常大鼠可于中葉及左內葉見一明顯缺血線，但肝硬化大鼠肝臟色澤較深，有時并不明顯。行肝中葉及左內葉劈離時，可沿鐮狀韌帶右側約1mm進行。因肝中葉靜脈直接匯入腔靜脈，與肝鐮狀韌帶平面幾乎垂直，要避免損傷肝中葉靜脈，以免造成術中大出血及血管內氣栓。

綜上所述，在CCl4腹腔注射法建立肝硬化大鼠模型上行ALPPS是安全可行的，可增大術后肝臟剩余體積。

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