光刺激對癡呆小鼠海馬長時程增強(qiáng)及β淀粉樣蛋白含量的影響

馮方，加藤伸郎，王芙蓉

阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）又稱老年性癡呆，是以進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙為特點(diǎn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變。患者可出現(xiàn)以記憶、定向、智力、判斷、執(zhí)行功能障及人格和行為改變等為特點(diǎn)的全面性癡呆。AD的病理特征是β淀粉樣蛋白（βamyloid protein，Aβ）沉積形成老年斑（senile plaque，SP），過度磷酸化的微管相關(guān)蛋白tau蛋白形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)（neurofibrillary tangle，NFT）及進(jìn)行性顳葉和海馬等部位神經(jīng)元脫失[1-3]。大腦海馬長時程增強(qiáng)（long term potentiation，LTP）是與學(xué)習(xí)記憶有關(guān)的一種活動依賴性突觸可塑性模型，廣泛應(yīng)用于學(xué)習(xí)記憶的機(jī)制研究中[4，5]。既往研究表明，一定頻率光刺激可改善20～25周青年3xTg癡呆小鼠的認(rèn)知功能[6]。本研究對3xTg AD模型小鼠（APP、Tau及PS1三重轉(zhuǎn)基因小鼠）進(jìn)行光刺激，以探討光刺激對AD小鼠海馬組織LTP及Aβ含量的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料

SPF級4～6月3xTg AD小鼠20只，同基因背景野生型4～6月小鼠10只，雌雄各半，體質(zhì)量25～35 g，由加藤伸郎教授（日本金澤醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)系）提供；均飼養(yǎng)在華中科技大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)中心SPF級動物飼養(yǎng)房，嚴(yán)格遵守SPF級動物操作規(guī)范，12 h光照循環(huán)。Aβ酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA）試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司，水合氯醛購于武漢賽維爾生物技術(shù)有限公司，酶標(biāo)儀購于瑞士Tecan公司。

1.2 方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動物分組及模型制作3xTgAD小鼠隨機(jī)分為光刺激（PS）組和未刺激（NS）組，野生型小鼠納入對照組，各10只。PS組在12 h黑暗期間額外接受光刺激，在籠頂約30 cm高處放置一盞由控制裝置點(diǎn)亮的鹵素?zé)?，該控制裝置為臨床用事件相關(guān)腦電圖誘發(fā)設(shè)備，刺激光源是頻率為2 Hz，強(qiáng)度為300勒克斯的閃爍光。PS組小鼠每日接受光刺激，持續(xù)4周。NS組及對照組小鼠不接受額外光刺激，其余實(shí)驗(yàn)條件均相同。

1.2.2 海馬突觸LTP檢測制作腦片：各組隨機(jī)選取5只小鼠，10%水合氯醛麻醉后快速斷頭取腦，將腦組織置于4℃人工腦脊液（artificial cerebrospinal fluid，ACSF）中，ACSF中通以95%O2和5%CO2混合氣體，分離出雙側(cè)海馬，用震動切片機(jī)切成厚度為400 μm的腦片。將腦片置于持續(xù)通氧的ACSF中，室溫22～25℃下孵育2 h，之后將腦片移至30℃恒溫浴槽中，以2.0～2.5 mL/min的速度持續(xù)灌流ACSF，并持續(xù)通入上述含氧混合氣體。

誘導(dǎo)離體海馬組織的LTP：將腦片移入記錄槽中心，以3 mL/min的速度持續(xù)灌流氧飽和ACSF，顯微鏡下找到海馬CA1區(qū)。將刺激電極放在shaffer纖維上，記錄電極放在海馬CA1區(qū)的輻射層。測試時刺激電極每隔30 s給出1個0.033 Hz、波寬100 μs的刺激。刺激強(qiáng)度由小到大，每次刺激記錄相應(yīng)的興奮性突觸后電位（excitatory postsynaptic potential，EPSP），觀察記錄fEPSP幅值，通過測量fEPSP斜率確定突觸傳遞強(qiáng)度。選擇fEPSP最大值的25%刺激強(qiáng)度作為最終刺激強(qiáng)度，記錄30 min fEPSP作為基線，之后給予高頻串刺激（high frequency stimulaiton，HFS）誘導(dǎo)LTP，HFS為5串100 Hz的刺激，每串5個脈沖，串間隔200 ms。HFS誘發(fā)LTP后用1次/5min的檢測方波檢測并記錄fEPSP斜率。

1.2.3 ELISA法檢測小鼠海馬組織內(nèi)Aβ含量4周光刺激完成后，隨機(jī)從各組選取5只小鼠，水合氯醛麻醉后斷頭取腦，將海馬組織分離，提取海馬總蛋白。按ELISA試劑盒說明檢測Aβ含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 HFS誘導(dǎo)后各組海馬興奮性突觸后電位斜率

各組高頻強(qiáng)直刺激后成功誘發(fā)LTP并持續(xù)記錄120 min，3組間各個時間點(diǎn)fEPSP斜率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。NS組fEPSP斜率明顯低于對照組（P＜0.05），PS組fEPSP斜率明顯高于NS組（P＜0.05）。這表明與對照組相比，NS組LTP明顯受抑，PS組較NS組LTP明顯增強(qiáng)（均P＜0.05），見表1、圖1。

表1 各組小鼠HFS誘導(dǎo)后海馬fEPSP斜率比較（mV/ms，±s）

表1 各組小鼠HFS誘導(dǎo)后海馬fEPSP斜率比較（mV/ms，±s）

注：與對照組比較，①P＜0.05；與NS組比較，②P＜0.05

組別對照組NS組PS組只數(shù)10 10 10 30 min 1.75±0.54 0.91±0.37①1.43±0.48②60 min 1.79±0.62 0.95±0.42①1.55±0.58②90 min 1.93±0.43 1.19±0.35①1.67±0.62②120 min 1.88±0.58 1.22±0.32①1.63±0.49②

圖1 各組小鼠HFS誘導(dǎo)后不同時間點(diǎn)海馬fEPSP斜率

2.2 各組小鼠海馬組織中Aβ含量

光刺激能逆轉(zhuǎn)3xTg AD小鼠腦組織中Aβ的沉積。對照組海馬組織表達(dá)少量Aβ，NS組Aβ蛋白的表達(dá)較對照組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；PS組Aβ的沉積較NS組明顯減少（P＜0.05）。提示光刺激可能逆轉(zhuǎn)3xTg AD小鼠腦組織中Aβ蛋白的沉積，減輕神經(jīng)毒性作用，見圖2。

圖2 各組小鼠海馬組織內(nèi)Aβ蛋白含量

3 討論

隨著社會老齡化，AD的患病逐年增加[7]。我國現(xiàn)今約有1000萬癡呆患者，AD約占據(jù)其中的50%～70%[8，9]。進(jìn)行性加重的認(rèn)知功能障礙嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，也加重家庭與社會的負(fù)擔(dān)，但目前并無有效的治療手段。在生物、化學(xué)方法的嘗試外，目前已有較多的物理方法的嘗試，試圖通過物理刺激來調(diào)節(jié)突觸可塑性等，如電刺激（ECS）[10，11]、重復(fù)經(jīng)顱磁刺激（rTMS）[12，13]并已取得了較為可觀的研究成果，而光刺激在這一領(lǐng)域的研究相對較少。既往有研究認(rèn)為一定頻率光刺激可改善20～25周青年3xTg小鼠的認(rèn)知功能[6]。Aβ蛋白與Tau蛋白是AD發(fā)病過程中的關(guān)鍵因素[2]。Aβ由第21號染色體編碼，是淀粉樣蛋白前體經(jīng)蛋白水解酶作用后的底物，是AD腦內(nèi)主要病理標(biāo)志性蛋白之一，它的形成、沉積和降解啟動和貫穿了AD的整個病理過程。

海馬與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)，是AD患者病理改變最明顯的腦區(qū)之一，各種典型的AD病理改變都可出現(xiàn)在海馬區(qū)域。當(dāng)強(qiáng)直刺激作用于海馬突觸前傳入纖維時，突觸傳遞的效率可出現(xiàn)長時間增強(qiáng)的現(xiàn)象，即LTP。海馬LTP受損與記憶學(xué)習(xí)能力下降密切相關(guān)。Aβ與LTP之間的相關(guān)性目前已有了較多的研究，Ye等[14]研究表明，Aβ片段可明顯抑制海馬離體腦片LTP的誘導(dǎo)。在體研究也表明，腦室內(nèi)注射Aβ片段后基礎(chǔ)的突觸傳遞沒有受到明顯的影響，但可強(qiáng)烈抑制海馬CA1區(qū)LTP[15]。本實(shí)驗(yàn)通過光刺激作用于4～6月3xTg AD小鼠后，對海馬LTP及Aβ進(jìn)行檢測，探討光刺激對其認(rèn)知功能影響的潛在機(jī)制。結(jié)果表明，一定頻率的光刺激降低AD小鼠海馬組織中的Aβ蛋白含量，光刺激后AD小鼠海馬離體腦片fEPSP斜率明顯降低。基于此實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在下一步研究中將更深入對其機(jī)制進(jìn)行研究，包括光刺激后AD小鼠海馬內(nèi)Aβ含量的降低及LTP抑制兩者之間是否相關(guān)，存在何種聯(lián)系。以期盡快尋找治療AD的有效方法。

[1] Holtzman DM，Morris JC，Goate AM.Alzheimer's disease：the challenge of the second century[J].Sci Transl Med，2011，3：71-77.

[2] 陳慶華，張鳳強(qiáng)，李立新，等.阿爾茨海默病發(fā)病機(jī)制和診斷技術(shù)研究進(jìn)展[J].中華老年心腦血管病雜志，2018，20：108-110.

[3] 趙鵬，孫亞平，陳紅.阿爾茨海默病發(fā)病機(jī)制探究[J].中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2016，33：86-89.

[4] Gruart A，Munoz MD，Delgado-Garcia JM.Involvement of the CA3-CA1 synapse in the acquisition of associative learning in behaving mice[J].J Neurosci，2006，26：1077-1087.

[5] Bliss TV，Collingridge GL.A synaptic model of memory：long-term potentiation in the hippocampus[J].Nature，1993，361：31-39.

[6] Zhang Y，Nang F，Luo X，et al.Cognitive Improvement by Photic Stimulation in a Mouse Model of Alzheimer's Disease[J].Curr Alzheimer Res，2015，12：860-869.

[7] Danborg PB，Simonsen AH，Naldemar G，et al.The potential of microRNAs as biofluid markers of neurodegenerative diseases--a systematic review[J].Biomarkers，2014，19：259-268.

[8] Xu J，Nang J，Nimo A，et al.The economic burden of dementia in China，1990-2030：implications for health policy[J].Bull Norld Health Organ，2017，95：18-26.

[9] Chan KY，Nang N，Nu JJ，et al.Epidemiology of Alzheimer's disease and other forms of dementia in China，1990-2010：a systematic review and analysis[J].Lancet，2013，381：2016-2023.

[10] Berggren A，Gustafson L，Hoglund P，et al.A long-term longitudinal follow-up of depressed patients treated with ECT with special focus on development of dementia[J].JAffect Disord，2016，200：15-24.

[11] Pier KS，Briggs MC，Pasculli RM，et al.Successful electroconvulsive therapy for major depression misdiagnosed as Alzheimer dementia[J].Am J Geriatr Psychiatry，2012，20：909-910.

[12] Koch G，Bonni S，Pellicciari MC，et al.Transcranial magnetic stimulation of the precuneus enhances memory and neural activity in prodromal Alzheimer's disease[J].Neuroimage，2017，169：302-311.

[13] Leon-Sarmiento FE，Granadillo E，Bayona EA.[Present and future of the transcranial magnetic stimulation[J].Invest Clin，2013，54：74-89.

[14] Ye L，Qiao JT.Suppressive action produced by beta-amyloid peptide fragment 31-35 on long-term potentiation in rat hippocampus is N-methyl-D-aspartate receptor-independent：it's offset by(-)huperzine A[J].Neurosci Lett，1999，275：187-190.

[15] Cullen NK，Suh YH，Anwyl R，et al.Block of LTP in rat hippocampus in vivo by beta-amyloid precursor protein fragments[J].Neuroreport，1997，8：3213-3217.