新生期卡介苗和乙肝疫苗聯(lián)合接種對哮喘小鼠IFN-γ、IL-4和IL-17A表達的影響*

沈雪艷，陳三妹，陳小萍，邢海燕，趙偉英，陳志華

(1紹興文理學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江 紹興 312000； 2浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院呼吸和危重醫(yī)學(xué)科，浙江 杭州310009)

支氣管哮喘(簡稱哮喘，asthma)是兒童時期最常見的呼吸道慢性炎癥性疾病之一，全球約有3億人口罹患哮喘，根據(jù)不同國家的不同診斷標(biāo)準，患病率高達1%～18%，包括哮喘的兒童、成人以及喘息患兒[1]。支氣管哮喘是以氣道高反應(yīng)性為主要特征的慢性變應(yīng)性炎癥性疾病，有嗜酸性粒細胞(eosinophils，EOS)、肥大細胞、T淋巴細胞、嗜堿性粒細胞和中性粒細胞等多種細胞參與炎癥反應(yīng)?？ń槊?bacillus Calmette-Guérin，BCG)是結(jié)核分枝桿菌減毒活疫苗，一種Th1型免疫反應(yīng)刺激劑，具有治療哮喘及其它過敏性疾病的潛在能力[2]。乙肝疫苗(hepatitis B vaccine，HepB)[3]接種是控制乙肝流行的有效措施。HepB常規(guī)接種中約5%～10%的人抗HepB陰性，屬于無/低免疫應(yīng)答人群。有研究發(fā)現(xiàn)HepB與BCG聯(lián)用，BCG作為免疫佐劑能促進HepB無/低應(yīng)答人群產(chǎn)生乙肝的保護性抗體[4-5]。我國自1992年啟動乙型肝炎免疫項目，2002年將HepB納入兒童常規(guī)免疫[6]，新生兒出生24～48 h內(nèi)常規(guī)接種BCG和HepB兩種疫苗。本研究通過觀察新生期BCG和HepB聯(lián)合接種對哮喘小鼠干擾素γ(interferon-γ，IFN-γ)、白細胞介素(interleukin，IL)-4、IL-17A表達的影響，探討B(tài)CG和HepB聯(lián)合干預(yù)對氣道炎癥的影響及可能的作用機制。

材　料　和　方　法

1　實驗動物及材料

清潔級BALB/c小鼠(中國科學(xué)院上海動物中心，動物證書編號：X11C3152)，6～8周，體重18～22 g，2∶1比例雌雄交配，生產(chǎn)的幼鼠養(yǎng)至5周，選取48只供實驗用，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)部動物房飼養(yǎng)。卵清蛋白(ovalbumin，OVA； Sigma)；佐劑液態(tài)鋁(PIERCE)；皮內(nèi)注射用卡介苗(上海生物制品研究所)；重組乙型肝炎疫苗(釀酒酵母劑型帶佐劑，深圳康泰生物制品股份有限公司)；IFN-γ、IL-4和IL-17A的ELISA試劑盒(R&D Systems)。超聲波霧化器WH-2000型(廣東粵華醫(yī)療器械廠)；ELISA檢測酶標(biāo)儀(Sigma)。

2　方法

2.1動物分組和模型制備將48只清潔級BALB/c小鼠按數(shù)字隨機表法分為BCG和HepB聯(lián)合接種造模(B/H/O)組、BCG接種造模(B/O)組、HepB接種造模(H/O)組、BCG和HepB聯(lián)合接種(B/H)組、BCG組、HepB組、OVA模型組和生理鹽水(normal saline，NS)對照組，共8組，每組6只。接種步驟為：B/H/O組和B/H組分別在第0、7和14天皮下注射BCG，每只1×105CFU，共3次，同時第0和28天下肢腿部肌肉注射HepB，每只1.5 μg，共2次；B/O組和BCG組分別在第0、7和14天皮下注射BCG，每只1×105CFU，共3次；H/O組和HepB組分別在第0和28天下肢腿部肌肉注射HepB，每只1.5 μg，共2次；OVA模型組和NS 對照組分別皮下注射0.05 mL NS。哮喘造模步驟為：第5周開始建立模型，B/H/O組、B/O組、H/O組和OVA模型組腹腔注射0.04% OVA (0.2 mL) 2次致敏，1.5% OVA霧化3 d激發(fā)，對照組用生理鹽水致敏激發(fā)[2]。

2.2標(biāo)本的采集和處理各組小鼠于末次OVA激發(fā)24 h后，摘眼球取血，收集血液于肝素鈉抗凝的EP管內(nèi)，4 ℃、2 000 r/min離心5 min，收集血清，-20 ℃保存?zhèn)溆?。小鼠仰臥麻醉固定，暴露氣管，插入改良的18G氣管插管針。結(jié)扎右肺門根部，左肺行支氣管肺泡灌洗，0.3 mL的PBS灌洗4次，回收灌洗液，回收率在80%以上，將回收的支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)離心(20 ℃，2 000 r/min，10 min)，收集上清液，-20 ℃保存待檢測因子，離心沉淀的細胞團用PBS緩沖液重懸至0.5 mL，取0.2 mL涂片，進行瑞特-吉姆薩(Wright-Giemsa)染色，計算細胞總數(shù)和EOS數(shù)。取右肺組織，-80 ℃保存，肺組織勻漿待測因子。取左肺組織氣管插管灌注4%多聚甲醛，使左肺膨脹(內(nèi)固定)，后浸入4%多聚甲醛(外固定)，固定24 h后，取肺葉約2 mm，常規(guī)乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，蠟塊切片用于HE染色。

2.3ELISA法檢測細胞因子ELISA法檢測參照試劑盒說明書進行，通過標(biāo)準品吸光度(A)繪制標(biāo)準曲線，然后計算各樣本的值。檢測血清中IFN-γ和IL-4的含量，計算IFN-γ/IL-4比值。肺組織勻漿，將右肺組織從-80 ℃取出，迅速稱重取100 mg濕肺組織加1 mL PBS液，剪碎肺組織，放入電動勻漿器里勻漿，2 000 r/min，20～30 s，間隔數(shù)秒，重復(fù)3次，測肺組織勻漿中IL-17A的含量。

3　統(tǒng)計學(xué)處理

采用GraphPad Prism 5.01統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準誤(mean±SEM)表示，多個樣本均數(shù)間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)　　果

1　肺組織的病理變化觀察

HE染色結(jié)果顯示，NS組、BCG組、HepB組和B/H組的氣道上皮完整，纖毛排列整齊，杯狀細胞少見，基底膜及平滑肌較薄，肺小血管內(nèi)皮光滑，血管和氣道周圍見極少量炎癥細胞，未見嗜酸性粒細胞。OVA模型組氣道上皮細胞極度增生肥大，上皮不完整，纖毛排列紊亂，上皮下基底層增厚，平滑肌肥大增生，氣道和血管周圍及肺泡間隔內(nèi)見大量的嗜酸性粒細胞和炎癥細胞浸潤。B/O組的氣道上皮細胞增生肥大，上皮不完整，纖毛排列紊亂，上皮下基底層增厚，平滑肌肥大增生，氣道和血管周圍、肺泡間隔內(nèi)見較少量的嗜酸性粒細胞和炎癥細胞浸潤。B/H/O組和H/O組的氣道上皮細胞極度增生肥大，上皮不完整，纖毛排列紊亂，上皮下基底層增厚，平滑肌肥大增生，氣道和血管周圍、肺泡間隔內(nèi)見極多量的嗜酸性粒細胞和其它炎癥細胞浸潤，見圖1。

2　BALF中的細胞總數(shù)和EOS計數(shù)

與OVA模型組比較，B/H/O組、B/O組和H/O組BALF的細胞總數(shù)和EOS計數(shù)均下降(P<0.05)；EOS計數(shù)在B/H/O組高于B/H組(P<0.05)，B/O組高于BCG組(P<0.05)，H/O組高于HepB組(P<0.05)，見圖2、3。

3　血清中細胞因子水平的檢測

分別與B/H/O組、H/O組、OVA組和NS 對照組比較，B/H組和HepB組的IFN-γ水平均顯著升高(P<0.05)，見圖4。B/H/O組的IL-4水平顯著下降，低于NS組和B/O組(P<0.05)，見圖5。HepB組的IFN-γ/IL-4比值高于H/O組、OVA組和NS 組(P<0.05)；B/H組的IFN-γ/IL-4比值高于B/H/O組、B/O組、OVA組和NS 組(P<0.05)，見圖6。

4　肺組織勻漿中的IL-17A水平的檢測

與OVA模型組比較，B/H/O組和B/O組肺組織勻漿中IL-17水平均明顯下降，H/O組無明顯差異；與B/O組比較，B/H/O組IL-17水平進一步降低(P<0.05)，見圖7。

討　　論

BCG是結(jié)核分枝桿菌的減毒活疫苗，具有治療哮喘及其它過敏性疾病的潛在能力[2]。哮喘是由Th2細胞和IgE介導(dǎo)的Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)性慢性氣道疾病，其病理特點是嗜酸性粒細胞浸潤的氣道炎癥[1]。BCG可誘導(dǎo)Th1型細胞免疫反應(yīng)，促進IFN-γ和IL-12等細胞因子產(chǎn)生，促進巨噬細胞聚集活化，對致敏后已建立的Th2型細胞記憶反應(yīng)也有抑制作用，可糾正哮喘中Th1/Th2的失衡。Shen等[2]研究證明，小鼠生命早期接種BCG可抑制OVA誘導(dǎo)的氣道EOS炎癥和氣道高反應(yīng)性。本研究顯示，B/O組單獨接種BCG使氣道EOS浸潤減少，利于緩解氣道炎癥反應(yīng)，與前期實驗結(jié)論一致。在HepB-BCG聯(lián)合疫苗中，BCG具有抗原和佐劑的雙重功能，即其既是卡介苗抗原組分，同時又是乙肝病毒表面抗原的免疫佐劑。Koike等[4]比較了BCG的細胞壁組分或其衍生物的佐劑效應(yīng)，發(fā)現(xiàn) BCG-CWS、TDM和MDP-lys這3種源于細菌衍生的佐劑能有效地增強HepB誘導(dǎo)的體液免疫和細胞免疫。姚紅霞[5]臨床研究90名HepB初種失敗健康人群，對照組按HepB標(biāo)準接種程序進行復(fù)種，觀察組在3次接種HepB前各接種BCG 1次，接種后復(fù)查乙肝表面抗體，結(jié)果對照組復(fù)種成功率為42.2%，觀察組復(fù)種成功率為93.3%，組間差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性。以上研究提示，HepB與BCG聯(lián)用，BCG作為免疫佐劑能促進HepB無/低應(yīng)答人群產(chǎn)生乙肝的保護性抗體[4-5]。

重組乙肝疫苗是一種免疫反應(yīng)刺激原，它產(chǎn)生的單價成分不但能預(yù)防乙型肝炎，還能抵抗其它疾病，如白喉、小兒麻痹癥、破傷風(fēng)、百日咳和流感嗜血桿菌B感染等[3]。Moorman等[7]發(fā)現(xiàn)在HepB接種中CD4+T細胞反應(yīng)是削弱的，跟PD-1信號途徑有關(guān)。HepB-BCG聯(lián)合疫苗誘導(dǎo)的細胞免疫主要表現(xiàn)是激活CD4+和CD8+細胞[4-5]。本研究發(fā)現(xiàn)，HepB/BCG聯(lián)合或單獨HepB接種時，血清Th2因子IL-4水平降低，IFN-γ/IL-4比值增高，影響Th1/Th2的比值，IL-4水平降低和Th1/Th2比值升高，減輕了氣道的炎癥反應(yīng)，說明HepB/BCG聯(lián)合接種減輕了氣道的炎癥反應(yīng)。Deng等[8]研究發(fā)現(xiàn)，在野生型小鼠中，抗IFN-γ中和抗體阻斷IFN-γ，提升BCG對抗哮喘的作用,外源性重組IFN-γ氣道給藥則加重氣道的炎癥反應(yīng)。外源性IFN-γ對氣道炎癥的損害，依賴于Th1/Th2比例，過多劑量IFN-γ可導(dǎo)致氣道炎癥反應(yīng)加重。

Figure 1.Pathological changes of the lung tissues (HE staining,×400).
圖1肺組織病理變化的觀察

Figure 2.The cell counts in BALF.Mean±SEM.n=6.*P<0.05vsOVA group;△P<0.05vsBCG group;☆P<0.05vsHepB group.
圖2BALF總細胞計數(shù)

Figure 3.EOS counts in BALF.Mean±SEM.n=6.*P<0.05vsOVA group;#P<0.05vsB/H group;△P<0.05vsBCG group;☆P<0.05vsHepB group.
圖3BALF中EOS計數(shù)

Figure 4.The serum level of IFN-γ.Mean±SEM.n=6.*P<0.05vsB/H group；#P<0.05vsHepB group.
圖4血清中IFN-γ水平

Figure 5.The serum level of IL-4.Mean±SEM.n=6.*P<0.05vsB/O/H group；△P<0.05vsB/O group.
圖5血清中的IL-4水平

Figure 6.The serum level of IFN-γ/IL-4.Mean±SEM.n=6.*P<0.05vsOVA group;#P<0.05vsB/O group.
圖6血清中IFN-γ/IL-4的比值

Figure 7.The level of IL-17A in the lung tissue homogenate.Mean±SEM.n=6.*P<0.05vsB/O/H group;△P<0.05vsB/O group.
圖7肺組織勻漿中IL-17A的水平

有學(xué)者提出“非Th2型哮喘”，中性粒細胞參與哮喘的急性發(fā)病及惡化過程，其中IL-17起到重要作用。中重度哮喘患者的IL-17水平升高，IL-17的升高與中性粒細胞炎癥有關(guān)，也與氣道重塑有關(guān)[9-11]。IL-17A水平表達量下降，顯示哮喘小鼠氣道炎癥程度較輕。Deng等[8]研究表明，IL-17基因敲除新生小鼠接種BCG能進一步減少OVA誘導(dǎo)的氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性。本研究發(fā)現(xiàn)，與OVA模型組比較，HepB/BCG聯(lián)合或單獨BCG接種，IL-17A表達量明顯下降，而單獨接種HepB無IL-17A表達量下降現(xiàn)象；與B/O組相比，B/H/O組IL-17A水平明顯降低，說明BCG接種能促進IL-17A的表達量下降，而HepB并不能改變IL-17A的表達量，HepB/BCG聯(lián)合接種可進一步下調(diào)IL-17A表達量。

本研究發(fā)現(xiàn)，B/H/O組的肺血管周圍炎癥細胞大量增多，而氣道周圍較少，整體觀察氣道炎癥反應(yīng)是加重的。然而，BALF中的細胞總數(shù)和EOS計數(shù)在B/H/O組數(shù)量較OVA組減少，說明肺組織的氣道部分炎癥是減輕的，這與病理組織觀察有矛盾。分析認為，在末次OVA激發(fā)24 h的時點處置小鼠，B/O組肺血管周圍炎癥細胞滲出較少，血管和氣道周圍的炎癥已同步達到最高峰，因此BALF細胞總數(shù)和EOS計數(shù)與病理觀察結(jié)果一致。然而，B/H/O組肺血管周圍炎癥細胞大量集聚，血管周圍向氣道周圍滲出時間不夠，尚未達到最高峰，所以B/H/O組的BALF細胞總數(shù)和EOS計數(shù)偏少，而病理觀察肺組織血管周圍炎癥細胞增多明顯，兩者之間有差距。假設(shè)在末次OVA激發(fā)48 h的時點處置小鼠，炎癥細胞滲出有更多的時間，血管周圍與氣道周圍趨于一致，肺組織病理與BALF細胞總數(shù)和EOS計數(shù)之間會達到平衡，這個設(shè)想有待進一步實驗證實。

另外，BCG和HepB同時接種的可行性、接種時點等有待進一步驗證?？紤]到反復(fù)接種某種抗原，可導(dǎo)致機體對于抗原表位擴展化識別，引發(fā)各種自身免疫性疾病，HepB和BCG在新生小鼠聯(lián)合接種的不良反應(yīng)需要謹慎。

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