LRRK2/NF-κB信號對BCG誘導巨噬細胞RAW264.7炎癥應(yīng)答的調(diào)控

王啟源，徐紅艷，姬文蘭

(陜西省結(jié)核病防治院內(nèi)四科，陜西 西安 710100)

結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)是引起結(jié)核病(tuberculosis)的一種傳染性病原菌[1]。肺泡巨噬細胞是結(jié)核分枝桿菌感染的主要靶細胞，在結(jié)核分枝桿菌感染的發(fā)病機理中發(fā)揮關(guān)鍵作用。巨噬細胞介導的先天免疫反應(yīng)是宿主防御結(jié)核分枝桿菌的第一道防線[2]。宿主的免疫反應(yīng)對結(jié)核感染的進展至關(guān)重要，了解結(jié)核分枝桿菌與宿主之間的相互作用對于控制結(jié)核是至關(guān)重要的。巨噬細胞產(chǎn)生的大量細胞因子如腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白細胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)參與宿主防御結(jié)核分枝桿菌機制。

富亮氨酸重復序列激酶2(leucine-rich repeat kinase 2，LRRK2)是由PARK8基因編碼的一種蛋白激酶。關(guān)于LRRK2的研究主要集中于慢性腸炎、麻風病和家族性帕金森病等。LRRK2在免疫調(diào)節(jié)中的作用主要依賴于特定的細胞類型及刺激環(huán)境。有研究表明LRRK2在小鼠神經(jīng)炎癥的動物模型中高表達，且能夠調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞的炎癥應(yīng)答[3]。干擾素γ(interferon-γ，IFN-γ)能夠誘導巨噬細胞中LRRK2的產(chǎn)生，此外，LRRK2對于巨噬細胞中細菌生存是非常必要的[4]。LRRK2通過負調(diào)控活化T細胞核因子1(nuclear factor of activated T-cells 1，NFAT1)抑制巨噬細胞中炎癥因子的產(chǎn)生[5]。另有研究發(fā)現(xiàn)LRRK2通過激活核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)通路促進炎癥因子的產(chǎn)生[6]。而且，LRRK2通過促進NF-κB轉(zhuǎn)錄活性調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答進程[4]。

基于以上研究背景，本研究采用卡介苗(bacillus Calmette-Guérin，BCG)菌株感染小鼠肺泡巨噬細胞RAW264.7為細胞模型，建立了穩(wěn)定的結(jié)核分枝桿菌感染巨噬細胞模型，通過探討LRRK2對BCG感染后誘發(fā)巨噬細胞炎性反應(yīng)及細菌生存率的調(diào)節(jié)作用，以期闡明LRRK2/NF-κB信號對巨噬細胞抗結(jié)核分枝桿菌感染的免疫調(diào)控機制，從而為進一步研究結(jié)核分枝桿菌在機體內(nèi)的免疫機制提供一定的理論依據(jù)。

材　料　和　方　法

1　材料和試劑

小鼠巨噬細胞株RAW264.7(中科院上海細胞所)；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(HyClone)；TRIzol試劑盒(Invitrogen)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega)；SYBR Premix Ex TaqⅡ(TaKaRa)；BCA蛋白定量試劑盒(Thermo Fisher Scientific)；抗LRRK2、p-p65和GAPDH蛋白抗體(Cell Signaling Technology)；ECL顯影試劑盒(Millipore)；IL-1β、IL-6和IFN-γ酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(R&D)；NF-κB抑制劑PDTC(Sigma)。

2　方法

2.1細胞培養(yǎng)將RAW264.7細胞置于含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，37 ℃、飽和濕度、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每1～2 d傳代1次。

2.2BCG感染巨噬細胞模型的建立RAW264.7細胞復蘇后傳2～3代，待細胞穩(wěn)定后細胞長至70%～80%，按照感染復數(shù)(multiplicity of infection，MOI；即細菌數(shù)∶細胞數(shù))為10∶1加入BCG菌懸液，輕輕搖勻，置于細胞培養(yǎng)箱中37 ℃、5% CO2孵育。感染4 h后更換新鮮培養(yǎng)基，24 h后收集細胞。

2.3qPCR檢測mRNA的表達水平細胞總RNA提取按照TRIzol試劑盒說明書操作，將細胞總RAN逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA。應(yīng)用SYBR Green熒光染料試劑盒進行qPCR。采用Quantity One凝膠成像分析系統(tǒng)測定各相應(yīng)條帶的灰度值，選取GAPDH作為內(nèi)參照。通過Ct值進行數(shù)據(jù)分析，目的基因的相對表達量以2-ΔΔCt表示。引物序列見表1。

表1　qPCR引物序列Table 1.The primer sequences for qPCR

2.4Western blot檢測蛋白表達收集各組細胞，加入細胞裂解液作用1 min，13 000 r/min離心15 min，吸取上清即細胞總蛋白，置于-80 ℃凍存?zhèn)溆?。用BCA試劑盒檢測蛋白濃度后，蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離后電轉(zhuǎn)至PVDF膜。經(jīng)5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后，加入相應(yīng) I 抗4℃孵育過夜。TBST洗膜3次，加入HRP標記的相應(yīng) II 抗，室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，ECL化學發(fā)光，顯影，定影，拍照；Western blot檢測條帶用凝膠成像儀分析系統(tǒng)Quantity One軟件掃描灰度值。計算目的蛋白與GAPDH灰度值的比值，進行統(tǒng)計學分析。

2.5菌落形成單位(colony-forming unit,CFU)計數(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌生存率巨噬細胞感染結(jié)核菌4 h后，用不含血清的DMEM培養(yǎng)液洗滌2次以除去細胞間未被巨噬細胞吞噬的細菌。向細胞培養(yǎng)板中再加入完全DMEM培養(yǎng)液1 mL繼續(xù)培養(yǎng)。分別于細菌感染后的24 h和48 h去除12孔細胞板中的培養(yǎng)液，每孔加入500 μL 0.5% Triton X-100裂解細胞。倒置顯微鏡下觀察巨噬細胞的裂解情況，待巨噬細胞全部裂解后每孔加入500 μL完全培養(yǎng)液終止裂解。振蕩混勻5 min，接種于7H11培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3周后進行菌落計數(shù)。

2.6ELISA檢測培養(yǎng)上清細胞因子的水平分別收集感染24 h后的培養(yǎng)上清，采用ELISA法測定促炎細胞因子IL-1β、IL-6和IFN-γ的水平，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

3　統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0軟件包進行分析，應(yīng)用GraphPad Prism 5軟件作圖。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。兩組間比較采用t檢驗，多組數(shù)據(jù)采用單因素方差分析。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)　　果

1　BCG誘導的巨噬細胞中LRRK2的表達水平

為闡明LRRK2在BCG感染的巨噬細胞中的作用，首先采用qPCR及Western blot檢測BCG感染的RAW264.7細胞中LRRK2的表達水平，結(jié)果顯示，RAW264.7細胞經(jīng)BCG感染后，LRRK2的mRNA及蛋白表達均顯著升高(P<0.05)，感染6 h后LRRK2的表達出現(xiàn)上調(diào)，至24 h時到達頂峰，48 h有所下降，由此表明，BCG刺激可以誘導的巨噬細胞內(nèi)LRRK2的表達水平，見圖1。

Figure 1.The expression of LRRK2 at mRNA and protein levels in RAW264.7 cells infected with BCG.A:qPCR was used to detect the mRNA expression of LRRK2; B:Western blot was performed to determine the protein expression of LRRK2.Mean±SD.n=5.*P<0.05vs0 h group.
圖1BCG對RAW264.7細胞中LRRK2的表達的影響

2　LRRK2對BCG感染的結(jié)核分枝桿菌存活率的影響

將小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA，si)-陰性對照(negative control，NC)和si-LRRK2分別轉(zhuǎn)染巨噬細胞后，用BCG感染，qPCR和Western blot結(jié)果表明沉默LRRK2后細胞中LRRK2的表達水平顯著下調(diào)(P<0.05)，見圖2A、B。CFU計數(shù)結(jié)果顯示，RAW264.7細胞經(jīng)BCG處理后胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌存活率明顯升高，而si-LRRK2組的細菌生存率顯著降低(P<0.05)，說明LRRK2沉默能夠抑制BCG誘導的結(jié)核分枝桿菌的存活率，見圖2C。

3　LRRK2對BCG誘導的巨噬細胞炎癥應(yīng)答的影響

ELISA檢測LRRK2對BCG誘導的巨噬細胞中炎癥因子分泌的影響，結(jié)果顯示，BCG刺激誘導RAW264.7細胞后，IL-1β、IL-6和IFN-γ的水平顯著上調(diào)，而LRRK2下調(diào)明顯降低BCG誘導的上述促炎細胞因子的水平(P<0.05)，見圖3A～C。進一步采用qPCR驗證，結(jié)果與ELISA一致，沉默LRRK2降低BCG刺激分泌的細胞因子的mRNA表達水平(P<0.05)，見圖3D～F。以上結(jié)果表明LRRK2沉默能夠抑制BCG誘導的巨噬細胞炎癥應(yīng)答進程。

4　LRRK2通過正調(diào)控NF-κB信號通路調(diào)節(jié)炎癥應(yīng)答進程

為了探討LRRK2對BCG誘導的炎癥應(yīng)答的調(diào)控機制，檢測了LRRK2對NF-κB通路的影響，qPCR和Western blot結(jié)果所示，BCG感染明顯激活NF-κB通路，而下調(diào)LRRK2通過顯著降低p-p65的蛋白水平抑制NF-κB信號通路(P<0.05)。同時，采用NF-κB通路的抑制劑PDTC探討NF-κB信號是否參與LRRK2調(diào)控炎癥應(yīng)答，結(jié)果顯示PDTC顯著抑制BCG刺激誘導的炎癥因子IL-1β和IL-6的mRNA表達(P<0.05)，類似于LRRK2沉默的作用效果。由此說明下調(diào)LRRK2可能通過抑制NF-κB信號通路抑制BCG感染的炎癥應(yīng)答進程，見圖4。

Figure 2.The effect of LRRK2 on the viability ofMycobacteriumtuberculosisin the RAW264.7 cells.A and B:qPCR and Western blot were used to evaluate the efficiency ofLRRK2 knockdown in the RAW264.7 cells； C:mycobacterial viability was measured by CFU assay.Mean±SD.n=5.*P<0.05vssi-NC group.
圖2LRRK2對BCG感染的RAW264.7中細菌生存率的影響

Figure 3.The effect of LRRK2 on the releases of inflammatory factors induced by BCG infection in the RAW264.7 cells.A,B and C:the release levels of IL-1β,IL-6 and IFN-γ from the RAW264.7 cells were examined by ELISA； D,E and F:the mRNA expression of IL-1β,IL-6 and IFN-γ was detected by qPCR.Mean±SD.n=5.*P<0.05vsuntreated group;#P<0.05vssi-NC group.
圖3LRRK2對BCG誘導的RAW264.7細胞中炎癥因子分泌水平的影響

討　　論

結(jié)核分枝桿菌是典型的胞內(nèi)致病菌，肺泡巨噬細胞是結(jié)核分枝桿菌感染的主要靶細胞和宿主細胞，能夠為結(jié)核分枝桿菌在宿主體內(nèi)感染提供關(guān)鍵的胞內(nèi)生存環(huán)境。結(jié)核分枝桿菌通過巨噬細胞表面的受體介導作用進入細胞內(nèi)，引起細胞免疫應(yīng)答反應(yīng)[7]。

研究報道LRRK2能夠調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答[4,8-9]。為檢測結(jié)核分枝桿菌感染是否會導致LRRK2表達水平發(fā)生變化，建立了結(jié)核分枝桿菌BCG感染巨噬細胞RAW264.7的體外模型，觀察了結(jié)核分枝桿菌感染細胞6、12、24及48 h時LRRK2的變化情況。qPCR和Western blot實驗均顯示，BCG感染RAW264.7細胞中LRRK2的表達水平明顯上調(diào)，并且與感染時間有關(guān)。該結(jié)果表明LRRK2在巨噬細胞抗結(jié)核分枝桿菌感染中具有重要作用。此外，本研究發(fā)現(xiàn)沉默LRRK2抑制BCG感染RAW264.7細胞的結(jié)核分枝桿菌存活率。

Figure 4.NF-κB signaling was involved in the process of LRRK2-medicated inflammatory responses.A:Western blot was performed to determine the protein levels of p-p65 and p65; B:the mRNA expression of IL-1β and IL-6 was examined by qPCR.Mean±SD.n=5.*P<0.05vsuntreated group;#P<0.05vssi-NC group；&P<0.05vscontrol group.
圖4NF-κB信號通路參與LRRK2調(diào)節(jié)BCG誘導的炎癥應(yīng)答過程

結(jié)核桿菌感染，特別是在感染早期，炎癥應(yīng)答對于結(jié)核分枝桿菌的清除十分重要。細胞因子的分泌失衡是結(jié)核分枝桿菌引起疾病進展的機制之一。當結(jié)核分枝桿菌感染后可觸發(fā)信號使巨噬細胞活化產(chǎn)生大量的效應(yīng)分子如IL-6、IL-1β和TNF-α等細胞因子[10]。本研究結(jié)果表明下調(diào)LRRK2可抑制BCG刺激誘導的炎性細胞因子IL-1β、IL-6和IFN-γ的表達，從而揭示LRRK2可正性調(diào)控巨噬細胞對結(jié)核分枝桿菌感染所產(chǎn)生的炎癥應(yīng)答。

NF-κB信號在炎癥反應(yīng)及免疫應(yīng)答進程中具有非常重要的作用[11]。進而研究NF-κB通路是否參與LRRK2調(diào)控的炎癥反應(yīng)機制。本研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)LRRK2通過抑制NF-κB信號通路抑制結(jié)核菌感染中的炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)過程，為進一步闡明結(jié)核菌感染的免疫調(diào)控機制以及研發(fā)抗結(jié)核藥物提供了新的靶標。

本研究結(jié)果揭示下調(diào)LRRK2可抑制BCG刺激誘導的炎癥應(yīng)答進程，進而抑制結(jié)核分枝桿菌在巨噬細胞內(nèi)的生存和繁殖，此外，LRRK2對結(jié)核分枝桿菌感染導致炎癥的正調(diào)控作用是通過促進NF-κB信號轉(zhuǎn)導通路表達實現(xiàn)的。綜上所述，LRRK2/NF-κB正反饋調(diào)控環(huán)在機體抗結(jié)核分枝桿菌感染過程中的免疫調(diào)控作用與機理，為進一步研究結(jié)核分枝桿菌感染的致病機理提供了新的思路，并為研制臨床治療結(jié)核病的藥物研究提供了新的靶點。

[參考文獻]

[1]任琳,李軼,王山梅,等.小鼠巨噬細胞內(nèi)表達結(jié)核分枝桿菌CFP10-ESAT6融合蛋白對細胞增殖和凋亡的影響[J].中國病理生理雜志,2013,29(10):1809-1814.

[2]Liu PT,Modlin RL.Human macrophage host defense againstMycobacteriumtuberculosis[J].Curr Opin Immunol,2008,20(4):371-376.

[3]Moehle MS,Webber PJ,Tse T,et al.LRRK2 inhibition attenuates microglial inflammatory responses[J].J Neurosci,2012,32(5):1602-1611.

[4]Gardet A,Benita Y,Li C,et al.LRRK2 is involved in the IFN-γ response and host response to pathogens[J].J Immunol,2010,185(9):5577-5585.

[5]Liu Z,Lee J,Krummey S,et al.The kinase LRRK2 is a regulator of the transcription factor NFAT that modulates the severity of inflammatory bowel disease[J].Nat Immunol,2011,12(11):1063-1070.

[6]Han KA,Yoo L,Sung JY,et al.Leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) stimulates IL-1β-mediated inflammatory signaling through phosphorylation of RCAN1[J].Front Cell Neurosci,2017,11:125.

[7]張宇晴,王新敏,王嬋,等.Mcl-1信號通路阻斷劑對H37Rv感染小鼠巨噬細胞凋亡的影響[J].中國病理生理雜志,2015,31(11):2059-2064.

[8]Wandu WS,Tan C,Ogbeifun O,et al.Leucine-rich repeat kinase 2 (Lrrk2) deficiency diminishes the development of experimental autoimmune uveitis (EAU) and the adaptive immune response[J].PLoS One,2015,10(6):e0128906.

[9]Lee H,James WS,Cowley SA.LRRK2 in peripheral and central nervous system innate immunity:its link to Parkinson’s disease[J].Biochem Soc Trans,2017,45(1):131-139.

[10] Bongiovanni B,Mata-Espinosa D,D’Attilio L,et al.Effect of cortisol and/or DHEA on THP1-derived macrophages infected withMycobacteriumtuberculosis[J].Tuberculosis (Edinb),2015,95(5):562-569.

[11] Zhang Q,Jiang X,He W,et al.MCL plays an anti-inflammatory role in mycobacterium tuberculosis-induced immune response by inhibiting NF-κB and NLRP3 inflammasome activation[J].Mediators Inflamm,2017,2017:2432904.