TGF-β/Smads通路參與EndoMT在HHPH中的作用及益氣溫陽活血化痰方的干預效應*

張聰聰，張晶晶▲，武垣伶，戴雍月，錢小英，王萬鐵△

(1溫州醫(yī)科大學病理生理學教研室，浙江 溫州 325035； 2溫州市人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，浙江 溫州 325000)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是造成我國慢性肺源性心臟病(肺心病)的主要原因[1]。肺心病具有預后不佳和進展較快的特點，嚴重影響我國城鄉(xiāng)居民的健康[2-3]。肺動脈高壓(pulmonary artery hypertension，PAH)是肺心病的特征性改變，直接影響肺心病的預后[4]，并且其發(fā)生同時往往伴隨著肺泡和血液中二氧化碳分壓升高[5]。

低氧高二氧化碳性肺動脈高壓(hypoxia-hypercapnia pulmonary hypertension，HHPH)是一個多因子參與的病理過程，肺血管收縮反應(pulmonary vasoconstriction，PV)和肺血管重構(pulmonary vascular remodeling，PVSR)是2個主要的發(fā)病環(huán)節(jié)[6]。近年來的研究表明，血管內(nèi)皮細胞通過內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(endothelial-mesenchymal transition，EndoMT)可能參與PVSR過程[7]。其中，轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)家族和其下游的Smads信號通路與EndoMT的發(fā)生有著密切的關系[8]。

益氣溫陽活血化痰方(Yiqi-Wenyang-Huoxue-Huatan formula，YWHHF)，全方組成：黃芪、人參、附片、川芎、丹參、法夏、薤白和白芥子等。研究表明，黃芪和丹參等對心、肺及腦相關疾病具有一定的治療作用[9-10]，但其是否能緩解低氧高二氧化碳引起的肺動脈高壓，目前尚未有報道。本實驗旨在探究益氣溫陽活血化痰方在低氧高二氧化碳情況下與肺動脈內(nèi)皮細胞-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化中的作用及與TGF-β/Smads信號通路的關系，從而探討益氣溫陽活血化痰方可能的作用機制，為臨床防治肺動脈高壓癥提供理論指導。

材　料　和　方　法

1　動物

健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠50只，清潔級，體重為(200±20) g，由溫州醫(yī)科大學動物實驗中心提供，動物許可證號為SCXK(浙)2015-0009。

2　主要試劑

益氣溫陽活血化痰方(北京中醫(yī)藥大學組方)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo)；兔抗大鼠α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)和TGF-β1抗體及小鼠抗大鼠CD31抗體(Abcam)；兔抗大鼠Smad2/3和p-Smad2/3抗體(Cell Signaling Technology)；辣根酶標記山羊抗兔 II 抗和辣根酶標記山羊抗小鼠 II 抗(博蘊生物科技有限公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強型)(碧云天)；PVDF膜(Millipore)；瓊脂糖凝膠(Bio-Rad)；所有引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

3　主要方法

3.1中藥制備將藥材磨成粉狀，于冷水中浸泡1 h,多功能提取罐煎煮2次,每次90 min，合并2次濾液，置于4 ℃冷藏。分裝濾液于EP管中，真空冷凍干燥處理，并于陰涼處保存。按體表面積折算率換算成大鼠等效劑量，按濃度分為高劑量(200 g/L)組、中劑量(100 g/L)組和低劑量(50 g/L)組，灌胃前用生理鹽水溶解，并將溶液置于37 ℃水浴鍋20 min，避免大鼠出現(xiàn)腹瀉等現(xiàn)象[11]。

3.2實驗分組將50只清潔級SD大鼠隨機分為5組(n=10)：常氧對照(normal control，N)組、低氧高二氧化碳(hypoxia-hypercapnia，HH)組、YWHHF高劑量(high-dose YWHHF，YH)組、YWHHF中劑量(middle-dose YWHHF，YM)組和YWHHF低劑量(low-dose YWHHF，YL)組。

3.3HHPH動物模型的制備N組置于常氧環(huán)境，自由呼吸空氣，飼養(yǎng)4周；其余4組置于低氧高二氧化碳(10% O2和5% CO2)氧艙中飼養(yǎng)，HH組進倉前用等體積的生理鹽水灌胃，各中藥組用等體積的YWHHF灌胃，YH組劑量為0.6 g/kg，YM組劑量為0.3 g/kg，YL組劑量為0.15 g/kg，倉內(nèi)多余CO2用氫氧化鈉吸收8 h/d，每周6 d，飼養(yǎng)4周。

3.4大鼠平均肺動脈壓(mean pulmonary artery pressure，mPAP)和平均頸動脈壓(mean carotid artery pressure，mCAP)的檢測用10%的水合氯醛以350 mL/kg麻醉大鼠，消毒后分離皮下組織和肌肉，暴露頸外靜脈，并在其上剪一個2～3 mm的“V”形切口，將PE導管慢慢往里推送，直至出現(xiàn)波幅較心室波小且波形較規(guī)則的肺動脈壓力波形，記錄肺動脈壓并保存; 剪開大鼠左側(cè)頸部的皮毛，暴露頸總動脈，用小型動脈夾分別夾住動脈的近心端和離心端，剪2～3 mm的“V”形切口，將PE導管插入頸總動脈，記錄頸動脈壓并保存。

3.5右心室肥大指數(shù)(right ventricular hypertrophy index，RVHI)的測量測完壓力后用生理鹽水灌洗，直至肺葉呈白色，剪下心臟及肺葉至PBS中漂洗，沿房室溝剪去心房，分離右心室(right ventricle，RV)及左心室(left ventricle，LV)加心室間隔(interventri-cular septum，IVS)(LV+S)，用濾紙吸干，電子天平稱重，計算RV/(LV+S)的質(zhì)量比，即右心室肥大指數(shù)，以此作為判斷右心室肥厚程度。

3.6肺組織的HE染色觀察留取右中肺葉用4%的多聚甲醛浸泡48 h至1周，脫水后常規(guī)石蠟切片，HE染色，觀察。

3.7肺組織的免疫熒光觀察取各組大鼠肺葉，用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，60 ℃恒溫烤箱中烤片2 h，經(jīng)過脫蠟、水化、封閉，滴加兔抗大鼠α-SMA和小鼠抗大鼠CD31的抗體(稀釋比均為1∶100)，4 ℃過夜。第2天PBS沖洗3次，每次5 min，滴加 II 抗，37 ℃孵育30 min，50%防淬滅緩沖甘油封片，用正置熒光顯微鏡觀察并拍片。

3.8RT-PCR檢測α-SMA、CD31、TGF-β1和Smad2/3的mRNA表達水平取大鼠肺組織 100 mg，加液氮在研缽里研磨，以Trizol法提取總RNA，測定RNA濃度，按照RT-PCR試劑盒說明書進行cDNA合成及擴增，PCR擴增反應條件如下：(1)β-actin:95 ℃(預變性)6 min； 95 ℃(變性)1 min、54 ℃(退火)1 min、72 ℃(延伸)1 min，32個循環(huán); 72 ℃(終止延伸)10 min。(2)α-SMA：94 ℃(預變性)3 min； 94 ℃(變性)30 s、53.9 ℃(退火)30 s、72 ℃(延伸)1 min，32個循環(huán); 72 ℃(終止延伸)5 min。(3)CD31：94 ℃(預變性)3 min； 94 ℃(變性)30 s、 51.2 ℃(退火)30 s、72 ℃(延伸)1 min，32個循環(huán)；72 ℃(終止延伸)5 min。(4)TGF-β1：94 ℃(預變性)3 min、94 ℃(變性)30 s、51.1 ℃(退火)30 s、72 ℃(延伸)1 min，32個循環(huán)； 72 ℃(終止延伸)5 min。(5)Smad2/3：94 ℃(預變性)3 min； 94 ℃(變性)30 s、53.7 ℃(退火)30 s、72 ℃(延伸)1 min，32個循環(huán); 72 ℃(終止延伸)5 min。引物序列見表1。

表1　PCR引物序列Table 1.The sequences of the primers for RT-PCR

3.9Western blot測定各組α-SMA、CD31、TGF-β1和p-Smad2/3的蛋白水平取100 mg各組大鼠肺組織，加液氨在研缽里充分研磨，用1 mL RIPA 和 10 μL PMSF裂解肺組織，待裂解充分后，12 000 r/min、4 ℃ 離心10 min，取上清液，用BCA法測定蛋白濃度。電泳結束后截取相應位置的膠進行轉(zhuǎn)膜，室溫下用5%脫脂牛奶封閉1 h，用 I 抗稀釋液稀釋 I 抗(α-SMA、CD31、TGF-β1、Smad2/3和p-Smad2/3抗體均為1∶1 000)，4 ℃孵育過夜。TBST洗膜后，用HRP標記的 II (CD31為山羊抗鼠IgG，1∶10 000； α-SMA、TGF-β1、Smad2/3、p-Smad2/3和GAPDH為山羊抗兔IgG，1∶10 000)抗室溫孵育1 h，洗膜后滴加化學發(fā)光檢測試劑，置于曝光儀曝光，用Quantity One軟件分析條帶灰度值，用目的蛋白與GAPDH蛋白灰度值之比表示目的蛋白的表達水平，用p-Smad2/3與Smad2/3的比值反映p-Smad2/3蛋白的磷酸化水平。

4　統(tǒng)計學處理

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析,計量資料進行正態(tài)性檢驗,數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。多組樣本均數(shù)比較進行方差齊性檢驗,組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA),方差齊性者兩兩比較采用SNK-q法,方差不齊者進行Dunnett T3 檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結　　果

1　各組大鼠平均肺動脈壓、平均頸動脈壓及右心室肥大指數(shù)的比較

與N組相比，其余4組的mPAP均有不同程度升高(P<0.05或P<0.01)，RV/(LV+S)均顯著增大(P<0.01)；與HH組相比，YH、YM和YL組的mPAP均有不同程度降低(P<0.01)，RV/(LV+S)也有相應降低趨勢(P<0.01或P<0.05)；與YL組比，YH組和YM組的mPAP均降低(P<0.01)，并以YM組下降最顯著。各組勁動脈平均壓力值無統(tǒng)計學意義，見表2。

表2各組大鼠mPAP、mCAP及RV/(LV+S)的變化
Table 2.The changes of mPAP,mCAP and RV/(LV+S) in the rats with different treatments (Mean±SD.n=10)

GroupmPAP(mmHg)mCAP(mmHg)RV/(LV+S)(%)N13．21±1．30　　102．64±4．0122．20±1．01HH28．27±2．01??121．64±3．9635．02±2．88??YH22．81±2．34??△△##119．34±4．4527．41±1．46??△△YM22．69±2．89??△△##124．52±3．8727．56±1．97??△△YL25．76±3．01?△△109．47±4．3331．84±1．68??△

*P<0.05，**P<0.01vsN group;△P<0.05,△△P<0.01vsHH group;##P<0.01vsYL group.

2　各組大鼠肺組織形態(tài)學光鏡觀察結果

與N組相比，HH組及各中藥組肺動脈平滑肌均有不同程度增殖，中膜層有不同程度增厚，血管管壁面積(wall area，WA)/總面積(total area，TA)均升高(P<0.01或P<0.05)，血管管腔面積(lumen area，LA)/TA均降低(P<0.01或P<0.05)；與HH組比，各中藥組肺動脈平滑肌的增殖有不同程度的降低,中膜厚度有不同程度下降，管腔面積增加明顯，WA/TA均降低(P<0.01或P<0.05)，LA/TA均升高(P<0.01或P<0.05)，見圖1、表3。

Figure 1.HE staining of pulmonary arteries in each group (×40).The red rectangle area is the characteristic change area of the pulmonary artery.
圖1各組大鼠肺動脈HE染色結果

表3各組大鼠WA/TA和LA/TA值的比較
Table 3.The changes of WA/TA and LA/TA values of the rats with different treatments (%.Mean±SD.n=10)

GroupWA/TALA/TAN29．12±5．0667．02±6．22HH62．33±2．88??37．86±2．01??YH49．36±2．96??△△#53．61±2．98???△△##YM50．44±3．02??△△#51．73±3．01?△△##YL59．97±4．86?△44．56±5．68?△

*P<0.05，**P<0.01vsN group;△P<0.05△△P<0.01vsHH group;#P<0.05,##P<0.01vsYL group.

3　免疫熒光法測定大鼠肺動脈壁CD31和α-SMA的表達

在免疫熒光實驗中，CD31用來證明內(nèi)皮細胞的存在，是其特異性標志物，常表達于血管內(nèi)膜，α-SMA是間充質(zhì)細胞的特異性標志物，常表達于血管中膜。各組大鼠肺動脈壁免疫熒光圖中CD31呈綠色，α-SMA呈紅色，熒光強度代表各自表達量。結果如下：N組可見CD31沿內(nèi)膜分布，強度高，α-SMA在中膜分布，強度一般；HH組CD31脫落明顯，少見，α-SMA在動脈各層彌散分布，強度高；YH組及YM組CD31強度一般，α-SMA強度中等；YL組CD31強度較弱，α-SMA分布較強，見圖2。

Figure 2.Immunofluorescence of pulmonary arteries in each group (×40).The white arrow is defined as a distinct change area.
圖2各組大鼠肺動脈壁免疫熒光圖

4　各組大鼠肺組織α-SMA、CD31、TGF-β1和Smad2/3的mRNA相對表達量的比較

與N組比，低氧高二氧化碳時α-SMA、TGF-β1和Smad2/3的mRNA水平均明顯增高(P<0.01)，CD31的mRNA水平明顯降低(P<0.01)；與HH組比，YM組和YH組α-SMA、TGF-β1和Smad2/3的mRNA水平有不同程度的降低(P<0.05或P<0.01),YL組α-SMA和Smad2/3的mRNA水平有不同程度的降低(P<0.05或P<0.01)，但TGF-β1無明顯改變，YM組、YH組和YL組CD31的mRNA水平均有不同程度升高(P<0.05或P<0.01)，見圖3～6。

Figure 3.The mRNA expression of α-SMA in each group.Mean±SD.n=10.**P<0.01vsN group;△△P<0.01vsHH group.
圖3各組大鼠肺組織α-SMA的mRNA表達水平

Figure 4.The mRNA expression of CD31 in each group.Mean±SD.n=10.**P<0.01vsN group;△P<0.05，△△P<0.01vsHH group;#P<0.05vsYL group.
圖4各組大鼠肺組織CD31的mRNA表達水平

5　各組大鼠肺組織α-SMA、CD31、TGF-β1和p-Smad2/3 蛋白水平的比較

與N組比，低氧高二氧化碳時α-SMA、TGF-β1和p-Smad2/3的蛋白水平均明顯增高，CD31的蛋白水平明顯降低(P<0.05或P<0.01)；與HH組比，YM組和YH組α-SMA、TGF-β1和p-Smad2/3的蛋白水平有不同程度的降低(P<0.05或P<0.01),YL組的p-Smad2/3蛋白水平有不同程度的降低(P<0.05)，但α-SMA和TGF-β1無明顯改變；YM組、YH組和YL組CD31的蛋白水平均有不同程度升高(P<0.05或P<0.01)，見圖7～10。

Figure 5.The mRNA expression of TGF-β1 in each group.Mean±SD.n=10.**P<0.01vsN group;△P<0.05，△△P<0.01vsHH group.
圖5各組大鼠肺組織TGF-β1的mRNA表達水平

Figure 6.The mRNA expression of Smad2/3 in each group.Mean±SD.n=10.**P<0.01vsN group;△P<0.05,△△P<0.01vsHH group;#P<0.05,##P<0.01vsYL group.
圖6各組大鼠肺組織Smad2/3的mRNA表達水平

Figure 7.The protein expression of α-SMA in each group.Mean±SD.n=10.**P<0.01vsN group;△△P<0.01vsHH group;#P<0.05vsYL group.
圖7各組大鼠肺組織α-SMA蛋白的表達水平

Figure 8.The protein expression of CD31 in each group.Mean±SD.n=10.*P<0.05,**P<0.01vsN group;△P<0.05,△△P<0.01vsHH group;#P<0.05vsYL group.
圖8各組大鼠肺組織CD31蛋白的表達水平

Figure 9.The protein expression of TGF-β1 in each group.Mean±SD.n=10.**P<0.01vsN group;△P<0.05,△△P<0.01vsHH group.
圖9各組大鼠肺組織TGF-β1蛋白的表達水平

Figure 10.The protein levels of p-Smad2/3 in each group.Mean±SD.n=10.*P<0.05;**P<0.01vsN group;△P<0.05,△△P<0.01vsHH group;##P<0.01vsYL group.
圖10各組大鼠肺組織p-Smad2/3蛋白水平的比較

6　各組大鼠mPAP、WA/TA、LA/TA、α-SMA、CD31、TGF-β1、Smad2/3和p-Smad2/3 mRNA和蛋白表達的相關性分析

各組大鼠mPAP與α-SMA mRNA和蛋白表達呈顯著正相關(r分別為0.7424和0.7206，P<0.01)，mPAP與CD31 mRNA和蛋白表達呈顯著負相關(r分別為-0.6388和-0.7956，P<0.01)；WA/TA與α-SMA mRNA和蛋白表達呈顯著正相關(r分別為0.7909和0.7567，P<0.01)，WA/TA(%)與CD31 mRNA和蛋白表達呈顯著負相關(r分別為-0.8107和-0.8029，P<0.01)；LA/TA與α-SMA mRNA和蛋白表達呈顯著負相關(r分別為-0.7572和-0.8462，P<0.01)，LA/TA與CD31 mRNA和蛋白表達呈顯著正相關(r分別為0.8097和0.8464，P<0.01)；同時，α-SMA 與TGF-β1 mRNA和蛋白表達呈顯著正相關(r分別為0.5614和0.7510，P<0.01)；CD31 與TGF-β1 mRNA和蛋白表達呈顯著負相關(r分別為-0.5481和-0.7141，P<0.01)；TGF-β1與Smad2/3 mRNA和蛋白表達呈顯著正相關(r分別為0.7495和0.7925，P<0.01)。

討　　論

肺動脈高壓是一種以肺動脈壓力進行性升高為特征的危及生命的疾病，其病理變化包括肺血管收縮和重構及平滑肌細胞抗凋亡性等[12]。缺氧在PAH的發(fā)病機制中起關鍵作用，它能引起肺纖維化并導致PAH[13]。由于PAH發(fā)生同時往往伴隨著肺泡和血液中二氧化碳分壓升高，因此，制備吸入混合氣體的肺動脈高壓動物模型更符合肺心病人群發(fā)病的情況[14-15]。研究發(fā)現(xiàn)，EndoMT在胚胎發(fā)育時期心血管系統(tǒng)的發(fā)育過程中發(fā)揮著關鍵的作用，是近年來心肌纖維化和腎纖維化等纖維化疾病的研究熱點[16]。體外實驗表明，在低氧情況下，肺動脈內(nèi)皮細胞通過EndoMT轉(zhuǎn)分化成平滑肌細胞，且應用EndoMT抑制劑如SB431542能有效減緩內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)分化[17]。但EndoMT是否參與低氧高二氧化碳誘導的肺動脈高壓目前尚未報道。

EndoMT是內(nèi)皮細胞向間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化，細胞發(fā)生了形態(tài)、表型及功能的改變，即特異性內(nèi)皮細胞標志物CD31和血管內(nèi)皮鈣黏蛋白(vascular endothelial cadherin，VE-cadherin)等表達減弱或喪失，間充質(zhì)細胞標志物α-SMA和成纖維細胞特異性蛋白1(fibroblast specific protein-1，F(xiàn)SP-1)等增多[18]。EndoMT是一種新認可的細胞的轉(zhuǎn)化類型，PAH的發(fā)病機制中起重要作用可能是一種肌成纖維細胞來源的細胞，因此抑制EndoMT可能是治療PAH的新型靶點[19]。TGF-β/Smads通路與EndoMT的發(fā)生緊密相關，TGF-β配體首先與內(nèi)皮細胞膜上的TGF-βⅡ型受體(TGF-β receptor Ⅱ，TβRⅡ)結合，通過TβRⅡ激酶使TβRI磷酸化，并與其共同形成異二聚體或者四聚體結構，進而磷酸化其下游Smad蛋白家族中的受體激活型 Smad2和Smad3，隨后Smad2/3與通用型Smad4形成復合物，轉(zhuǎn)位到核內(nèi)，激活或者抑制核內(nèi)靶因子轉(zhuǎn)錄[20]，調(diào)控EndoMT發(fā)生。近年來，有研究表明，低氧誘導的肺動脈高壓的發(fā)展與血管重塑有關，并伴隨著肺動脈平滑肌細胞(pulmonary arterial smooth muscle cells，PASMCs)和內(nèi)皮細胞的增殖和遷移[21]，其中TGF-β1是促炎因子，也是能促進血管重塑和血管收縮的生長因子，因而是調(diào)控EndoMT的關鍵細胞因子，目前已被公認是COPD和PAH等炎癥性肺病發(fā)病的重要因子[22-23]。本實驗結果表明，與N組比，HH組和各給藥組肺動脈平均壓和右心室肥大指數(shù)均顯示不同程度升高，表明低氧高二氧化碳誘導的肺動脈大鼠模型成功復制。同時，光鏡下觀察到HH組和各給藥組肺動脈中膜亦有不同程度的增生，血管壁增厚明顯；免疫熒光結果顯示HH組和各給藥組內(nèi)皮細胞減少或脫落明顯，而平滑肌細胞呈增生趨勢，且mPAP、RV/(LV+S)和WA/TA(%)分別與α-SMA呈顯著正相關，LA/TA(%)與α-SMA呈顯著負相關，而mPAP、RV/(LV+S)和WA/TA(%)分別與CD31呈顯著負相關，LA/TA(%)與CD31呈顯著正相關；α-SMA、TGF-β1和p-Smad2/3的mRNA和蛋白表達水平呈上升趨勢，而CD31 mRNA和蛋白表達水平呈下降趨勢，說明低氧高二氧化碳能通過TGF-β1信號通路引起EndoMT，并造成一定程度的肺血管重構，從而產(chǎn)生肺動脈高壓。

現(xiàn)代西醫(yī)治療雖然明顯改善了PAH患者的生理功能，但其死亡率仍高達50%。國內(nèi)許多學者根據(jù)低氧性肺動脈高壓癥的基本病機，采用益氣溫陽活血化痰方治療肺動脈高壓癥，能夠明顯改善患者缺氧狀況、臨床癥狀并提高生活質(zhì)量[24]，其療效可能與調(diào)節(jié)血管活性物質(zhì)的水平有關。YWHHF全方組成主要有：黃芪 30 g、人參20 g、附片9 g、川芎10 g、丹參10 g、法夏9 g、薤白12 g和白芥子15 g。方中黃芪能補一身之氣，兼有升陽，固表止汗，排膿生肌，利水消腫的作用，能有效抑制肺纖維化和腺癌細胞生長，去除氧自由基[25]；人參含有多種皂甙，揮發(fā)油和多糖類等成分，具有補益強壯和強心等作用，為補肺之要藥[26]；附片和薤白是大溫熱之藥，有回陽救逆、溫腎助陽、祛寒止痛的功效，用于腎陽 不足、畏寒肢冷和風寒濕痹等癥；川芎和丹參，為血中之氣藥，具有辛散、解郁、通達和止痛等功能；法夏和白芥子溫肺化痰，通絡止痛，諸藥配合具有益氣溫肺、活血化痰和開胸通達之效[27-28]。但其是否對低氧高二氧化碳引起的肺動脈高壓有干預作用及其具體機制目前尚不明確。

本實驗結果顯示，與HH組比，YH、YM和YL組的肺動脈平均壓和右心室肥大指數(shù)呈降低趨勢；HE染色和免疫熒光結果顯示肺血管壁增厚減少，損傷減輕。同時，應用YWHHF后，原本在低氧高二氧化碳情況下增高的α-SMA、TGF-β1和p-Smad2/3的mRNA和蛋白表達水平呈下降趨勢，而原本降低的CD31 mRNA和蛋白表達呈上升趨勢，其中α-SMA、TGF-β1和p-Smad2/3的含量變化呈顯著正相關，而CD31與TGF-β1的含量變化呈顯著負相關，說明YWHHF能有效抑制EndoMT，一定程度上逆轉(zhuǎn)低氧高二氧化碳誘導的肺血管重構，從而減低肺動脈壓力，其機制可能與通過抑制TGF-β1及下游信號通路Smad2/3有關。綜合藥效、經(jīng)濟等各方面考慮，中劑量的YWHHF更具有推廣意義。

綜上所述，低氧高二氧化碳誘導的肺動脈高壓大鼠模型中，EndoMT可能通過TGF-β/Smads通路的過度活化而發(fā)生；益氣溫陽活血化痰方可通過抑制TGF-β/Smads通路在一定程度上緩解肺動脈高壓。

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