紅景天苷通過抑制氧化應激防治大鼠低氧性肺動脈高壓*

黃菲菲，李耀浙，張　婷，王良興，黃曉穎

(溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，溫州市呼吸循環(huán)重點實驗室，浙江 溫州 325000)

低氧性肺動脈高壓(hypoxic pulmonary arterial hypertension，HPH)是一種以血管阻力持續(xù)性升高和血管重塑為特征的進展性疾病。盡管HPH的確切機制仍不清楚，但已有研究表明，氧化應激與HPH的發(fā)生發(fā)展有著直接或間接的聯(lián)系[1-2]。氧化應激是指機體由于缺乏抗氧化物質，如超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和過氧化氫酶(catalase，CAT)等，和(或)活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生過多，從而使抗氧化防御系統(tǒng)不足以清除ROS的一種狀態(tài)。低氧暴露誘導生成的ROS攻擊細胞膜上的脂質，催化花生四烯酸生成丙二醛(malondialdehyde，MDA)和8-異構前列腺素F2α(8-iso-prostaglandin F2α，8-iso-PGF2α)。MDA 和8-iso-PGF2α被認為是檢測氧化應激狀態(tài)和自由基介導的脂質過氧化的可靠的指標。正常機體內(nèi)存在功能正常的SOD和CAT等酶類抗氧化系統(tǒng)，以及非酶類抗氧化系統(tǒng)維持機體內(nèi)ROS的平衡，其中，SOD是清除體內(nèi)ROS的關鍵酶，SOD1(Cu-ZnSOD)則是其主要類型，在細胞內(nèi)主要表達于細胞質中。本研究通過檢測HPH動物模型肺組織勻漿中NADPH氧化酶4(NADPH oxidase 4，NOX4)和SOD1蛋白相對表達量及MDA和8-iso-PGF2α含量，以及血清中SOD活性、MDA、8-iso-PGF2α含量來檢測低氧性肺動脈高壓大鼠肺部及整體的氧化應激水平。

紅景天又名高山紅景天，紅景天苷(salidroside，Sal)是其根部提取物中的一種單體成分，具有抗氧化的功效。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，紅景天苷能有效改善低氧誘導的大鼠肺動脈高壓[3]。然而，氧化應激是否參與了紅景天苷對大鼠HPH的調節(jié)機制目前尚不清楚。本研究利用低氧氧艙復制HPH大鼠模型，通過觀察不同濃度紅景天苷對HPH大鼠血流動力學、肺血管顯微結構以及血清和肺組織氧化應激相關指標的影響，探討紅景天苷是否能通過抑制氧化應激改善大鼠低氧性肺動脈高壓。

材　料　和　方　法

1　材料

紅景天苷購自上海源葉生物科技有限公司，批號為C11M7Q14603，純度≥98%，每瓶100 mg；MDA和SOD試劑盒購自南京建成生物工程研究所；8-iso-PGF2αELISA試劑盒購自上海博蘊生物有限公司；兔抗NOX4和SOD1多克隆抗體購自Abcam；兔抗GAPDH抗體購自Cell Signaling Technology；其余試劑均為市售分析純試劑。

2　方法

2.1動物模型分組與低氧模型復制32只健康雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠由溫州醫(yī)科大學實驗動物中心提供(動物合格證編號為SYXK(浙)2015-0009，購于上海斯萊克實驗動物有限公司)，體重180～220 g，按照隨機法分為4組，每組8只：常氧(normoxia，N)組作為對照組，飼養(yǎng)于常溫常壓下；低氧4周(hypoxia for 4 weeks，H4)組、紅景天苷低劑量(hypoxia for 4 weeks and treatment with Sal at 16 mg/kg，H4S16)組和紅景天苷高劑量(hypoxia for 4 weeks and treatment with Sal at 32 mg/kg，H4S32)組均置于常壓低氧氧艙內(nèi)，維持O2濃度(10±1)%，CO2濃度<5%，用適量無水氯化鈣控制艙內(nèi)水蒸氣，每天8 h，每周6 d，持續(xù)4 周。其余時間與N組處于同一室內(nèi)環(huán)境中(室溫20～24 ℃、相對濕度 50%～55%)。每天入艙前半個小時H4S16和H4S32組分別通過腹腔注射紅景天苷16 mg/kg和32 mg/kg，N和H4組腹腔注射等體積生理鹽水。

2.2平均肺動脈壓(mean pulmonary arterial pressure，mPAP)和右心肥厚指數(shù)[weight ratio of right ventricle/(left ventricle+septum)，RV/(LV+S)]的測定根據(jù)鄒麗珍等[4]的方法，對大鼠進行mPAP的測量。造模完成后，稱量并記錄大鼠重量，用20%烏拉坦按照8 mL/kg的劑量對大鼠進行麻醉，麻醉完成后，將大鼠四肢固定于大鼠專用手術板上，分離大鼠右側頸外靜脈，自制聚乙烯(polyethylene，PE)導管通過壓力傳感器與PowerLab生理記錄儀相連接，將PE管經(jīng)頸外靜脈緩慢插入大鼠右心室進入肺動脈，得到穩(wěn)定的波形，記錄為mPAP，退出導管并結扎血管。分離另一側頸總動脈，采血置于4 ℃保存。迅速開胸，剪下心臟及肺組織，用磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline，PBS)洗去組織表面血液，剪除心房，用組織剪沿著室間隔將心臟分離成右心室(right ventricle，RV)及左心室和室間隔(left ventricle+septum，LV+S)，稱量并記錄，計算RV/(LV+S)比值。

2.3光鏡標本制作及觀察上述分離的肺組織經(jīng)PBS洗去表面血液后，取右肺上葉組織，用4%多聚甲醛充分固定，并進行脫水透明、石蠟包埋以及切片(厚度約4 μm)，行HE染色。用顯微鏡觀察肺細小動脈(直徑 50～200 μm)的形態(tài)變化并拍照，用圖像分析軟件計算分析血管壁面積/血管總面積(vessel wall area/vessel total area，WA/TA)。

2.4血清和肺組織勻漿氧化應激相關指標的測量上述采取的血液通過離心機8 000 r/min離心5 min，分離得到大鼠血清，同時制備肺組織勻漿。采用羥胺法檢測血清中SOD活性，硫代巴比妥酸比色法檢測血清和肺組織勻漿中MDA含量，采用ELISA法檢測血清和肺組織勻漿中8-iso-PGF2α含量，所有試劑盒均嚴格按照說明書進行操作。

2.5Western blot檢測肺組織勻漿NOX4和SOD1蛋白的相對表達量稱取相應肺組織提取總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度。取80 μg蛋白經(jīng)SDS-PAGE、轉膜后，蛋白轉移至PVDF膜中，用5%脫脂奶粉封閉1 h，用兔抗大鼠NOX4和SOD1多克隆抗體(稀釋為1∶1 000)，4 °C孵育過夜。第2天取出PVDF膜，PBS洗滌后 II 抗室溫孵育1 h，洗膜后化學發(fā)光顯影，用Image Lab凝膠圖像分析軟件分析灰度值。

3　統(tǒng)計學處理

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件分析結果。所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，并進行正態(tài)性檢驗。多組均數(shù)比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間均數(shù)比較采用SNK-q檢驗。相關性分析采用Pearson分析法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結　　果

1　各組大鼠mPAP和RV/(LV+S)的比較

低氧組mPAP顯著高于常氧組(P<0.05)，紅景天苷低、高劑量組mPAP均顯著低于低氧組(P<0.05)，紅景天苷高劑量組mPAP低于紅景天苷低劑量組(P<0.05)，見圖1。低氧組大鼠RV/(LV+S)顯著高于常氧組(P<0.05)，紅景天苷低、高劑量組RV/(LV+S)均顯著低于低氧組(P<0.05)，紅景天苷高劑量組RV/(LV+S)低于紅景天苷低劑量組(P<0.05)，見圖2。

Figure 1.The effects of salidroside on the mPAP of the rats.The mPAP waves were recorded by PowerLab.Mean±SD.n=8.*P<0.05vsN group;#P<0.05vsH4group;△P<0.05vsH4S16 group.
圖1各組大鼠肺動脈壓波形圖及數(shù)值變化

2　各組大鼠肺細小動脈顯微結構的變化

低氧組肺細小動脈出現(xiàn)顯著重構現(xiàn)象，光鏡下可見低氧組大鼠肺細小動脈管壁明顯增厚；紅景天苷低、高劑量組肺細小動脈管壁增厚程度顯著輕于低氧組；紅景天苷高劑量組肺細小動脈管壁增厚程度輕于紅景天苷低劑量組。低氧組肺細小動脈WA/TA比值顯著高于常氧組(P<0.05)；紅景天苷低、高劑量組WA/TA比值顯著低于低氧組(P<0.05)；紅景天苷高劑量組WA/TA比值顯著低于紅景天苷低劑量組(P<0.05)，見圖3。

Figure 2.RV/(LV+S) was calculated in each group.Mean±SD.n=8.*P<0.05vsN group;#P<0.05vsH4group;△P<0.05vsH4S16 group.
圖2各組大鼠右心室肥厚指數(shù)的比較

3　各組大鼠氧化系統(tǒng)相關指標的變化

低氧組肺組織勻漿NOX4相對表達量顯著高于常氧組(P<0.05)，血清和肺組織勻漿MDA和8-Iso-PGF2α含量顯著高于常氧組(P<0.05)；紅景天苷低、高劑量組肺組織勻漿NOX4相對表達量顯著低于低氧組(P<0.05)，血清和肺組織勻漿MDA和8-iso-PGF2α含量顯著低于低氧組(P<0.05)；紅景天苷高劑量組肺組織勻漿NOX4相對表達量低于紅景天苷低劑量組(P<0.05)，血清和肺組織MDA和8-iso-PGF2α含量低于紅景天苷低劑量組(P<0.05)，見圖4、5。

Figure 3.The effects of salidroside on the pulmonary arterial remodeling (HE staining,×400).Mean±SD.n=8.*P<0.05vsN group;#P<0.05vsH4group;△P<0.05vsH4S16 group.
圖3各組大鼠肺血管形態(tài)變化

4　各組大鼠抗氧化系統(tǒng)相關指標的變化

低氧組肺組織勻漿SOD1相對表達量顯著低于常氧組(P<0.05)，血清SOD活性顯著低于常氧組(P<0.05)；紅景天苷低、高劑量組肺組織勻漿SOD1相對表達量顯著高于低氧組(P<0.05)，血清SOD活性顯著高于低氧組(P<0.05)；紅景天苷高劑量組肺組織勻漿SOD1相對表達量高于紅景天苷低劑量組(P<0.05)，血清SOD活性高于紅景天苷低劑量組(P<0.05)，見圖6。

Figure 4.The effects of salidroside on the expression of NOX4 in the rats with different treatments determined by Wes-tern blot.Mean±SD.n=8.*P<0.05vsN group;#P<0.05vsH4group;△P<0.05vsH4S16 group.
圖4各組大鼠NOX4蛋白Westernblot檢測結果

5　相關性分析

5.1氧化系統(tǒng)指標的相關性分析肺組織勻漿NOX4相對表達量與mPAP呈線性正相關(r=0.738，P<0.01)，肺組織勻漿NOX4相對表達量與肺組織勻漿MDA和8-iso-PGF2α含量呈線性正相關(r=0.729，r=0.709，均P<0.01)，見圖7。

5.2抗氧化系統(tǒng)指標的相關性分析肺組織勻漿SOD1相對表達量與mPAP呈線性負相關(r=-0.708，P<0.01)，肺組織勻漿SOD1相對表達量與肺組織勻漿MDA和8-iso-PGF2α含量呈線性負相關(r=-0.740,r=-0.728，均P<0.01)，見圖8。

討　　論

由于ROS的產(chǎn)生和消除之間的不平衡導致的氧化應激損傷是引起人類慢性疾病的重要原因，包括心血管疾病、糖尿病、衰老和腫瘤等。因此，對于氧化應激的研究，不僅要在細胞水平，更要在整個生物體的背景下。

Figure 5.The effects of salidroside on the contents of MDA and 8-iso-PGF2αin the rats with different treatments.Mean±SD.n=8.*P<0.05vsN group;#P<0.05vsH4group;△P<0.05vsH4S16 group.
圖5各組大鼠肺組織和血清MDA和8-Iso-PGF2α的檢測結果

肺血管阻力升高和血管重塑是肺動脈高壓的主要病理特征，本研究利用低氧氧艙復制慢性低氧肺動脈高壓大鼠模型，結果顯示，低氧組大鼠平均肺動脈壓和右心指數(shù)顯著升高，光鏡下，肺細小動脈壁顯著增厚，表明慢性低氧性肺動脈高壓大鼠模型已經(jīng)成功建立。

多項研究表明，過度的氧化應激在肺動脈高壓的發(fā)生發(fā)展中扮演重要的角色[5-6]。NADPH氧化酶能夠將電子從NADPH轉移給氧分子，生成超氧陰離子，是機體中非線粒體ROS的主要來源。7種NADPH氧化酶同源物組成了NOX家族蛋白，包括NOX1～5以及DUOX1和DUOX2。這7種NADPH氧化酶同源物在肺組織不同的細胞中有不同的分布，Hoidal等[7]研究表明，NOX4是人類肺氣道和肺血管平滑肌細胞中的主要亞型。此外，血管內(nèi)皮細胞也表達NOX4[8]。低氧暴露能夠引起肺血管中NOX4的表達上調，進而促進ROS的生成，ROS通過影響血管內(nèi)皮細胞中相關因子的表達導致內(nèi)皮細胞功能障礙，使得血管活性物質分泌異常，引起肺動脈平滑肌增殖[9-10]，導致肺血管重塑，引起肺動脈高壓。

Figure 6.The effects of salidroside on the expression of SOD1 (A) and the serum content of SOD (B) in the rats with different treatments.Mean±SD.n=8.*P<0.05vsN group;#P<0.05vsH4group;△P<0.05vsH4S16 group.
圖6各組大鼠肺組織SOD1蛋白表達量和血清SOD活性的變化

Figure 7.Correlation analysis of the indexes related to oxidative system.A:correlation analysis of NOX4 protein expression with the value of mPAP; B:correlation analysis of NOX4 protein expression with the content of MDA in the lung tissues; C:correlation analysis of NOX4 protein expression with the level of 8-iso-PGF2αin the lung tissues.
圖7氧化系統(tǒng)相關指標的相關性分析

Figure 8.Correlation analysis of the indexes related to antioxidant system.A:correlation analysis of SOD1 protein expression with the value of mPAP; B:correlation analysis of SOD1 protein expression with the content of MDA in the lung tissues; C:correlation analysis of SOD1 protein expression with the level of 8-iso-PGF2αin the lung tissues.
圖8抗氧化系統(tǒng)相關指標的相關性分析

紅景天苷作為多年生草本植物紅景天的中藥單體，具有增強免疫力、保護心血管、抗輻射和抗氧化等多重功效，故又名“黃金根”。整體動物和細胞水平的實驗均表明，紅景天苷能夠有效抑制肺動脈平滑肌增殖、肺血管重塑，改善肺動脈高壓[3,11]。本實驗研究結果顯示，在低氧處理的同時連續(xù)給予紅景天苷(16 mg/kg或32 mg/kg)4周后，低氧性肺動脈高壓大鼠的肺動脈壓力、肺血管重構及右心肥厚均顯著改善，提示紅景天苷對HPH大鼠確實具有減輕低氧誘導的肺血管重塑及肺動脈高壓的作用。

有研究報道，紅景天苷能減少心肌缺血大鼠心肌組織NOX4表達，降低心肌組織MDA值，提高SOD活力值，通過抑制氧化應激改善心肌缺血狀況[12]。因此，我們推測紅景天苷治療大鼠HPH的作用可能也與氧化應激有關。本研究發(fā)現(xiàn)低氧肺動脈高壓大鼠肺組織勻漿NOX4蛋白表達、肺組織勻漿和血清MDA和8-iso-PGF2α含量均顯著升高，肺組織勻漿SOD1蛋白表達和血清SOD活性顯著下降，表明低氧大鼠肺部及整體氧化/抗氧化系統(tǒng)失衡，氧化應激水平增強。而紅景天苷能有效減輕上述改變，提示紅景天苷有效降低了HPH大鼠的肺部和整體的氧化應激水平，并一定程度恢復了HPH大鼠的抗氧化能力。

此外，通過相關性分析還發(fā)現(xiàn)，肺組織勻漿NOX4蛋白表達與mPAP及肺組織勻漿MDA和8-iso-PGF2α含量呈線性正相關，肺組織勻漿SOD1蛋白表達與mPAP及肺組織勻漿MDA和8-iso-PGF2α含量呈線性負相關，且各相關性均良好。以上實驗結果提示，紅景天苷可能通過抑制肺組織NOX4表達并提高肺組織SOD1表達和增強血清SOD活性，這2種途徑減輕低氧肺動脈高壓大鼠氧化/抗氧化水平失衡，降低肺部和整體的氧化應激水平，從而起到保護肺動脈高壓的作用。

總之，紅景天苷可能通過減少低氧誘導的大鼠ROS產(chǎn)生和增強機體對ROS的清除能力，恢復氧化/抗氧化系統(tǒng)平衡，減輕低氧引起的肺組織過氧化應激損傷，緩解肺血管重構，抑制肺動脈高壓。這為臨床防治肺動脈高壓提供了一條新的思路。

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