胰腺癌高表達(dá)抗原MUC4 CTL表位肽的體內(nèi)免疫原性*

范柳笛，張　巖，時(shí)冉冉

(漯河醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校醫(yī)學(xué)生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 漯河 462002)

腫瘤疫苗可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)有力的細(xì)胞免疫應(yīng)答。T細(xì)胞介導(dǎo)的抗原特異性免疫識(shí)別是由人類(lèi)白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)Ⅰ類(lèi)分子和Ⅱ類(lèi)分子提呈的腫瘤相關(guān)抗原衍生肽激發(fā)的，自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell，NK)介導(dǎo)的非抗原特異性免疫是由缺乏識(shí)別信號(hào)的自身HLAⅠ類(lèi)分子激發(fā)的。盡管目前腫瘤疫苗的應(yīng)用還存在一定的問(wèn)題，但是臨床試驗(yàn)結(jié)果表明接種了疫苗的腫瘤患者長(zhǎng)期存活率和生活質(zhì)量均得到改善[1]。

黏蛋白4(mucin 4，MUC4)在胰腺癌的發(fā)生發(fā)展中有重要的作用，并有望成為胰腺癌潛在特異性腫瘤分子標(biāo)記物[2-4]?；谟嘘P(guān)MUC4的HLA-A2限制性表位肽的前期研究發(fā)現(xiàn)，P1944、P1944-1Y2L、P2004和P2004-1Y9V 4條表位肽可在體外實(shí)驗(yàn)中誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫應(yīng)答[5]，但在體內(nèi)是否具有免疫原性還有待進(jìn)一步研究。通用性Th表位是由13個(gè)氨基酸構(gòu)成的，可以和主要組織相容性(抗原)復(fù)合物(major histocompability complex，MHC)Ⅱ類(lèi)分子結(jié)合而刺激CD4+Th細(xì)胞增殖分化[6]。為了鑒定表位肽在體內(nèi)是否能夠誘導(dǎo)較強(qiáng)的免疫應(yīng)答，以及進(jìn)一步確定表位肽在體內(nèi)抗原提呈的效果，本研究將來(lái)源于MUC4的HLA-A2限制性表位肽與弗氏不完全佐劑(incomplete Freund’s adjuvant，IFA)乳化后聯(lián)合Th表位皮下免疫BALB/c小鼠，檢測(cè)小鼠脾細(xì)胞對(duì)各表位肽特異性的細(xì)胞免疫應(yīng)答情況，評(píng)估候選HLA-A2表位肽的體內(nèi)免疫原性。

材　料　和　方　法

1　材料

T2A2細(xì)胞系和人胰腺癌細(xì)胞CAPAN-2(HLA-A2+，MUC4+)由漯河醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校分子醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室常規(guī)保存，采用37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)條件常規(guī)培養(yǎng)。6～8周齡BALB/c小鼠由南京大學(xué)南京生物醫(yī)藥研究院提供；HLA-A2限制性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic lymphocyte，CTL)表位肽P1944(SMAEVNASV)、P1944-1Y2L(YLAEVNASV)、 P2004(FLNNQLLAA)、P2004-1Y9V(YLNNQLLAV)、對(duì)照肽HBcAg18-27(FLPSDFFPSV)和通用性Th表位由上海生工生物工程有限公司合成；IFA購(gòu)自Sigma-Aldrich；鼠源干擾素γ(interferon-γ，IFN-γ) ELISPOT 試劑盒購(gòu)自達(dá)科為生物技術(shù)有限公司。

2　方法

2.1效應(yīng)CTL的體內(nèi)誘導(dǎo)隨機(jī)選取6～8周齡小鼠，雌雄隨機(jī)分配。實(shí)驗(yàn)共設(shè)置PBS組、Th 表位組、P1944組、P1944-1Y2L組、P2004組和P2004-1Y9V組，共6組，每組5只。每組小鼠體內(nèi)的注射劑量如下：(1)PBS組：PBS∶IFA=1∶1；(2)Th 表位組：PBS∶Th表位∶IFA=1∶1∶2；(3)實(shí)驗(yàn)組：PBS∶候選肽∶IFA=1∶1∶2。第1次免疫注射記為第0天，按照上面各個(gè)組分別進(jìn)行皮下免疫注射，在第5天和第10天時(shí)進(jìn)行第2次和第3次加強(qiáng)免疫；同時(shí)每次免疫注射前，對(duì)小鼠進(jìn)行觀(guān)察，記錄體重。

2.2制備效應(yīng)細(xì)胞將免疫后的小鼠于第11天脫頸處死，置于75%乙醇中，浸泡10 min消毒后，無(wú)菌條件下開(kāi)腹腔取出脾臟，祛除脂肪和結(jié)締組織放于200目不銹鋼網(wǎng)篩中；培養(yǎng)皿中加入少量pH 7.2的PBS，并將200目鋼網(wǎng)置于其上，用20 mL醫(yī)用注射器內(nèi)芯研磨，盡量研磨干凈。PBS沖洗，移去篩網(wǎng)，培養(yǎng)皿中得脾細(xì)胞懸液(約10 mL)，轉(zhuǎn)移至無(wú)菌離心管中；1 000 r/min水平離心10min，棄上清，收集細(xì)胞；每管加入5 mL紅細(xì)胞裂解液，輕輕吹打重懸細(xì)胞，4 ℃孵育15 min，裂解紅細(xì)胞；1 000 r/min水平離心10min，棄上清，收集細(xì)胞。PBS洗滌2次；將脾細(xì)胞重懸于10 mL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中。計(jì)數(shù)后將脾細(xì)胞懸液置于6孔板中培養(yǎng)，每孔5 mL；次日每孔加入250 U重組鼠源白細(xì)胞介素2(interleukin-2，IL-2)(Prospec)、β2-M(Merck)以及與相對(duì)應(yīng)的多肽，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)5 d，收獲后作為效應(yīng)細(xì)胞。

2.3ELISA法檢測(cè)小鼠血清中IFN-γ的濃度在小鼠脫頸處死之前，用眼球取血的方法取各組免疫小鼠靜脈血，室溫靜置2～4 h后，3 000 r/min離心10 min，取上層血清，標(biāo)記后-80 ℃保存。將酶標(biāo)板室溫平衡0.5 h以上，每孔加入待測(cè)樣品50 μL，每孔再加入50 μL HRP-conjugated，輕輕晃動(dòng)混勻，37 ℃、5% CO2共孵育1 h，棄去液體，甩干，加滿(mǎn)洗滌液，振蕩30 min，棄去液體，用吸水紙重復(fù)拍干；每孔加入顯色劑共100 μL，振蕩混勻，37 ℃避光顯色15 min，加入終止液 50 μL，在波長(zhǎng)450 nm處測(cè)量各孔的吸光度(A)值[6]。

2.4ELISPOT法檢測(cè)IFN-γ的分泌水平取出ELISPOT板條，加200 μL無(wú)血清的IMDM培養(yǎng)基進(jìn)行封閉，靜置10 min；以誘導(dǎo)的CTL作為效應(yīng)細(xì)胞，荷肽的T2A2作為刺激細(xì)胞，細(xì)胞濃度均調(diào)整為2×109/L；設(shè)立對(duì)照孔和實(shí)驗(yàn)孔；37 ℃、5% CO2孵育18 h；傾盡孔中培養(yǎng)基，每孔加入200 μL無(wú)菌去離子水，4℃ 裂解細(xì)胞10 min；傾盡孔內(nèi)液體，加入200 μL 1×Washing Buffer進(jìn)行洗滌，洗滌6次，每次停留60 s；加入 100 μL生物素標(biāo)記的抗體，37 ℃ 孵育1 h；傾盡孔內(nèi)液體，加入200 μL 1×Washing Buffer進(jìn)行洗滌，洗滌方法同上，在吸水紙上拍干；加入100 μL酶聯(lián)親和素，37 ℃ 孵育1 h；每孔加入200 μL 1×Washing Buffer進(jìn)行洗滌，洗滌方法同上；加入100 μL現(xiàn)配的AEC顯色液，25℃避光靜置30 min；結(jié)束后置于通風(fēng)處，室溫靜置干燥；結(jié)果用 ELISPOT 圖像分析儀對(duì)96 孔板中每孔的斑點(diǎn)數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)[7]。

2.5細(xì)胞毒活性檢測(cè)調(diào)整CTL濃度為5×109/L；調(diào)整靶細(xì)胞CAPAN-2濃度為1×108/L；按50∶1、25∶1和12.5∶1的不同效靶比鋪于96孔板中，同時(shí)設(shè)立效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放組、靶細(xì)胞自發(fā)釋放組、靶細(xì)胞最大釋放組、體積校正組和背景對(duì)照組，每孔終體積為100 μL。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)4 h。于孵育結(jié)束前45 min，在靶細(xì)胞最大釋放組及體積校正組中加入10 μL裂解液。1 000 r/min離心4 min，轉(zhuǎn)移50 μL上清至另一干凈96孔板中，每孔加入50 μL底物混合液，室溫避光孵育30 min；每孔再加入50 μL終止液。用酶標(biāo)儀檢測(cè)其在490 nm波長(zhǎng)處的吸光度值。殺傷率(%)=(實(shí)驗(yàn)孔A值-效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放A值-CTL自發(fā)釋放A值)/(靶細(xì)胞A值-效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放A值)×100%[8]。

2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)胞內(nèi)因子免疫小鼠后，將5×109/L脾細(xì)胞重懸于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，加入10 mg/L 的單表位多肽，培養(yǎng)7 d。培養(yǎng)結(jié)束后，收獲細(xì)胞，PBS洗滌3次，加入終濃度為10 mg/L的布雷菲德菌素A(Brefeldin A，BFA，購(gòu)自Biolegend)，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h。培養(yǎng)結(jié)束后，PBS洗滌細(xì)胞，加4%多聚甲醛于4 ℃固定細(xì)胞20 min，PBS洗滌細(xì)胞，0.1%皂素(破膜劑)室溫處理細(xì)胞10 min，PBS洗滌細(xì)胞。加入FITC標(biāo)記的小鼠CD8抗體(1∶200稀釋)，PE標(biāo)記抗小鼠IFN-γ流式單克隆抗體(均購(gòu)自BD)，4 ℃避光孵育30 min，PBS洗2遍，離心棄上清，PBS重懸細(xì)胞，流式儀檢測(cè)。

3　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用單因素方差分析檢驗(yàn)多組均數(shù)之間的差異，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。統(tǒng)計(jì)圖由GraphPad Prism 5.0軟件繪制。

結(jié)　　果

1　ELISA法檢測(cè)候選肽免疫小鼠后IFN-γ的分泌水平

將接受尾根部皮下注射免疫刺激小鼠脾淋巴細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，以相應(yīng)的候選肽作為刺激物，對(duì)各組分離的淋巴細(xì)胞進(jìn)行刺激，小鼠眼球取血獲得的血清，用ELISA法檢測(cè)血清中IFN-γ的分泌量，結(jié)果示，P1944 、P1944-1Y2L、P2004和P2004-1Y9V在小鼠體內(nèi)均可顯著增強(qiáng)IFN-γ的分泌量，且P1944-1Y2L和P2004-1Y9V在小鼠體內(nèi)分泌IFN-γ的水平略高于原肽(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

Figure 1.IFN-γ release by CTLs generated from immunized BALB/c mice.Mean±SD.n=5.*P<0.05vsPBS group;#P<0.05vsP1944 group；△P<0.05vsP2004 group.
圖1ELISA法檢測(cè)候選肽在小鼠體內(nèi)特異性CTL分泌IFN-γ的能力

2　ELISPOT法檢測(cè)候選肽免疫小鼠后IFN-γ的分泌水平

HLA-A2限制性表位肽分別免疫小鼠的結(jié)果表明，與原肽組比較，P1944-1Y2L和 P2004-1Y9V免疫產(chǎn)生特異性分泌IFN-γ的細(xì)胞頻數(shù)較高(P<0.05)，誘導(dǎo)的細(xì)胞應(yīng)答較強(qiáng)，體內(nèi)免疫原性較強(qiáng)，P1944和P2004也可誘導(dǎo)特異性的細(xì)胞免疫應(yīng)答，但是分泌IFN-γ的細(xì)胞頻數(shù)較低，見(jiàn)圖2。

Figure 2.IFN-γ release by CTLs generated from immunized BALB/c mice measured by ELISPOT assay.Mean±SD.n=5.*P<0.05vsPBS group;#P<0.05vsP1944 group；△P<0.05vsP2004 group.
圖2ELISPOT法檢測(cè)候選肽在小鼠體內(nèi)特異性CTL分泌IFN-γ的能力

3　候選肽免疫小鼠產(chǎn)生特異性CTL的檢測(cè)

以胰腺癌細(xì)胞CAPAN-2(HLA-A2+，MUC4+)作為靶細(xì)胞，將已免疫小鼠的脾淋巴細(xì)胞進(jìn)行分離，進(jìn)一步研究候選表位肽能否在小鼠體內(nèi)被正常加工和遞呈并且誘導(dǎo)出特異性的CTL。結(jié)果示，P2004和 P2004-1Y9V在效靶比為50∶1時(shí)對(duì)靶細(xì)胞CAPAN-2(HLA-A2+，MUC4+)的殺傷效率分別為26.6%和39.6%，說(shuō)明P2004和 P2004-1Y9V誘導(dǎo)產(chǎn)生的CTL可以對(duì)CAPAN-2顯示出較強(qiáng)的細(xì)胞毒活性；同時(shí)，對(duì)靶細(xì)胞CAPAN-2未顯示出殺傷活性說(shuō)明了P2004和P2004-1Y9V誘導(dǎo)的特異性CTL殺傷靶細(xì)胞具有HLA-A2限制性，見(jiàn)圖3。

Figure 3.Specific lysis of cancer cell lines by the CTLs generated from immunized BALB/c mice.LDH cytotoxicity assay was used to evaluate the lysis of CAPAN-2(HLA-A2+，MUC4+)cells (A) and CAPAN-2 cells (B) on which the surface HLA-A2 molecules were blocked by anti-HLA-A2 mAb.Mean±SD.n=5.*P<0.05vsPBS group；▲P<0.05vsP2004 group.
圖3候選肽特異性CTL的體內(nèi)細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4　胞內(nèi)因子染色法檢測(cè)小鼠體內(nèi)產(chǎn)生特異性的CD8+ T細(xì)胞

胞內(nèi)因子染色法檢測(cè)候選肽體內(nèi)免疫刺激后IFN-γ的分泌水平。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，P2004和P2004-1Y9V候選肽免疫小鼠可誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性的CD8+T細(xì)胞。以空載T2A2和荷肽T2A2作為靶細(xì)胞。結(jié)果顯示，P2004和P2004-1Y9V均能分泌較多的IFN-γ，而P2004-1Y9V多肽疫苗比P2004能分泌更多的IFN-γ(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

5　各實(shí)驗(yàn)組小鼠的體重變化

在小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)期間，各實(shí)驗(yàn)組小鼠的體重與陰性對(duì)照組相比均沒(méi)有顯著差異。說(shuō)明表位疫苗對(duì)小鼠體重沒(méi)有明顯的影響，見(jiàn)圖5。

討　　論

腫瘤免疫治療的最佳方式是以切除的原發(fā)腫瘤對(duì)患者進(jìn)行免疫，這樣在任何部位、任何時(shí)間的復(fù)發(fā)均可被識(shí)別、記憶以及消滅。由于需要免疫效應(yīng)細(xì)胞對(duì)抗原進(jìn)行特異性識(shí)別，所以在這種情況下記憶效應(yīng)比較重要[9]。理論上，B淋巴細(xì)胞與抗體發(fā)生反應(yīng)，而T淋巴細(xì)胞則通過(guò)腫瘤特異性細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答來(lái)發(fā)揮作用[10-12]。腫瘤疫苗最大的優(yōu)勢(shì)是通過(guò)誘發(fā)機(jī)體全身性抗腫瘤的主動(dòng)特異性免疫并形成免疫記憶，監(jiān)測(cè)腫瘤的復(fù)發(fā)，產(chǎn)生有效而持久的抗腫瘤作用，從而有效地治療腫瘤，并預(yù)防復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[13]。腫瘤疫苗必須具有克服免疫耐受的特性才能維持CTL的特異性和親合力。改造肽可以增強(qiáng)HLA結(jié)合能力和TCR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，比同源野生型表位更能有效地打破免疫耐受。表位肽中氨基酸的取代能更有效地誘導(dǎo)特異性CTL[14-15]。研究表明，在一些腫瘤抗原如GP2、NY-ESO-1、gp100、HER-2/neu、p53和Hsp60以及MART-1中替換了MHC錨定殘基處的氨基酸，明顯提高了CTL表位的免疫原性[15-20]。

Figure 4.The splenocytes from peptide vaccinated mice were pooled and restimulated with peptide for 1 week.The restimulated splenocytes were then stained with IFN-γ and CD8+.The number in the figure represented the percentage of IFN-γ positive cells among CD8+T cells.Mean±SD.n=5.*P<0.05vsPBS group；▲P<0.05vsP2004 group.
圖4胞內(nèi)因子染色法檢測(cè)候選表位肽體內(nèi)誘導(dǎo)CTL分泌IFN-γ的能力

Figure 5.The BALB/c mice were immunized with peptide emulsified on days 0,5 and 10.The changes of the body weight on these days were recorded.Mean±SD.n=5.
圖5各組小鼠體重的變化

我們前期對(duì)腫瘤抗原MUC4的HLA-A2限制性表位肽的體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)了4條有潛力的表位肽：P1944、P1944-1Y2L、P2004和P2004-1Y9V[5]，這些表位肽是否具有臨床疫苗應(yīng)用的潛力，需要對(duì)其體內(nèi)免疫原性進(jìn)行研究評(píng)估。

本研究將使用BALB/c小鼠進(jìn)行表位肽的體內(nèi)免疫原性研究[21-23]。在我們的研究中將HLA-A2限制性表位肽和通用Th表位與弗氏不完全佐劑進(jìn)行乳化，并且連續(xù)皮下給予免疫，結(jié)果證實(shí)體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)的來(lái)源于MUC4的4條HLA-A2限制性表位肽中，P2004和P2004-1Y9V的體內(nèi)免疫原性最強(qiáng)。野生型肽P2004及其類(lèi)似物P2004-1Y9V能夠在體內(nèi)誘導(dǎo)特異性CTL。P2004-1Y9V誘導(dǎo)的特異性CTL可以識(shí)別人腫瘤細(xì)胞上的內(nèi)源肽，表明在這些小鼠中培養(yǎng)的T細(xì)胞能夠識(shí)別與天然HLA-A2分子結(jié)合的肽。經(jīng)改造過(guò)的P2004-1Y9V表位肽比原肽P2004能分泌更多的IFN-γ，P2004和P2004-1Y9V是否具有抗腫瘤的作用，要通過(guò)小鼠荷瘤模型來(lái)驗(yàn)證，這就需要我們?cè)诮酉聛?lái)的研究中構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)MUC4和HLA-A2的腫瘤細(xì)胞株，進(jìn)而研究表位肽P2004-1Y9V的抗腫瘤作用。

以上結(jié)果表明，來(lái)源于MUC4的HLA-A2限制性表位肽P2004-1Y9V具有較強(qiáng)的體內(nèi)免疫原性，能夠在體內(nèi)被抗原提呈細(xì)胞所提呈，經(jīng)提呈的肽/HLA 復(fù)合物可以被存在于 CTL 表面的 TCR 所識(shí)別，進(jìn)而產(chǎn)生針對(duì)MUC4的細(xì)胞免疫途徑，從而產(chǎn)生對(duì)胰腺癌細(xì)胞的殺傷作用。鑒定出的新CTL優(yōu)勢(shì)表位為研制基于MUC4抗原的腫瘤疫苗提供了理論基礎(chǔ)[24-25]，并為胰腺癌的多表位疫苗設(shè)計(jì)和免疫治療提供新的候選表位。

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