蛇床子素通過抑制SIRT1的表達增強阿霉素對p53野生型前列腺癌細胞的凋亡誘導活性*

陳小弟，趙賢寶,　駱高健

(義烏市中心醫(yī)院 1中醫(yī)科，2腫瘤科，浙江 金華 322000)

前列腺癌在男性腫瘤中的全球發(fā)病率為第2位，嚴重威脅人類健康[1-2]。目前，雖然手術(shù)治療是臨床上最有效的治療前列腺癌的方法，但是化療在術(shù)后輔助治療及中、晚期前列腺癌患者的治療中仍有不可替代的地位[3-4]。然而，一些腫瘤細胞對化療敏感性的降低是目前面臨的重大問題，因此探尋一些輔助治療手段提高腫瘤細胞對化療藥物的敏感性對提高腫瘤患者生存率具有十分重要的意義。

在治療前列腺癌的化療藥物中，阿霉素(doxorubicin，DOX)在臨床中使用廣泛。阿霉素又稱為多柔比星，是一種抗腫瘤抗生素，能作為一種細胞DNA損傷藥物抑制腫瘤細胞DNA的合成和修復，從而誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡性死亡[5-6]。然而，一些前列腺癌細胞對阿霉素誘導的凋亡存在抵抗性[7]，因此采取一些新的輔助治療手段減弱前列腺癌細胞對阿霉素誘導凋亡的抵抗性顯得十分重要。

蛇床子素是從中藥蛇床子中提取的活性物質(zhì)，具有較強的藥理活性，近年來的研究還發(fā)現(xiàn)蛇床子素還有一定的抗腫瘤活性[8-9]，然而其是否能增強阿霉素對前列腺癌的抗腫瘤活性至今仍很少見報道。沉默信息調(diào)節(jié)因子 1(silent information regulator 1，SIRT1)是細胞中的一種組蛋白去乙?；?。在腫瘤細胞中，SIRT1能通過對一些重要的轉(zhuǎn)錄因子，如p53、p73和Ku70等進行去乙?；Щ睿瑥亩鼓[瘤細胞逃避DNA損傷藥物如阿霉素誘導的凋亡信號[10-13]。因此，SIRT1是干預化療藥物抗腫瘤活性的一個潛在靶點。本研究的目的在于探討蛇床子素對阿霉素治療前列腺癌的輔助作用并研究其機制是否和SIRT1的抑制有關(guān)。

材　料　和　方　法

1　細胞培養(yǎng)

人前列腺癌細胞系LNCaP和PC3購于ATCC，培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并通入5% CO2。

2　實驗試劑

阿霉素、蛇床子素、MTT和凋亡檢測試劑盒購于Sigma-Aldrich；RPMI-1640培養(yǎng)基購于Gibco；抗SIRT1、p53、乙酰化p53、Puma、caspase-9、caspase-3、細胞色素C和GAPDH抗體購于Cell Signaling；p53小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)購于Santa Cruz；ECL試劑盒購于Pierce；pcDNA3.1和Lipofectamine 2000購于Invitrogen；線粒體分離試劑盒購于江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司。

3　方法

3.1瞬時轉(zhuǎn)染SIRT1的過表達采用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的方法，將人SIRT1基因的開放閱讀框架序列經(jīng)PCR擴增后以分子克隆的方法與pcDNA3.1連接后構(gòu)建成SIRT1重組過表達質(zhì)粒；p53的基因沉默采用siRNA瞬時轉(zhuǎn)染的方法來實現(xiàn)；轉(zhuǎn)染無關(guān)寡聚核苷酸的細胞作為對照。瞬時轉(zhuǎn)染簡要步驟如下：分別將2 mg/L SIRT1質(zhì)粒、50 nmol/Lp53 siRNA和無關(guān)寡聚核苷酸用Lipofectamine 2000進行包裹后將其加入到無血清培養(yǎng)基進行混合；將貼壁的細胞置于該無血清培養(yǎng)基孵育6 h，之后棄去無血清培養(yǎng)基并加入新鮮的含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。

3.2細胞活力的檢測轉(zhuǎn)染后的LNCaP或PC3細胞按每孔5×103個接種在96孔板上孵育過夜，分為對照組、蛇床子素組、阿霉素組、阿霉素+蛇床子素組，阿霉素+蛇床子素+SIRT1質(zhì)粒組和阿霉素+蛇床子素+p53 siRNA組。對照組為無關(guān)寡聚核苷酸轉(zhuǎn)染的細胞不加藥物培養(yǎng)48 h; 蛇床子素組為無關(guān)寡聚核苷酸轉(zhuǎn)染的細胞加入蛇床子素培養(yǎng)48 h; 阿霉素組為無關(guān)寡聚核苷酸轉(zhuǎn)染的細胞加入阿霉素培養(yǎng)48 h; 阿霉素+蛇床子素組為無關(guān)寡聚核苷酸轉(zhuǎn)染的細胞加入阿霉素聯(lián)合蛇床子素培養(yǎng)48 h; 阿霉素+蛇床子素+SIRT1質(zhì)粒組為SIRT1過表達質(zhì)粒(2 mg/L)轉(zhuǎn)染的細胞加入阿霉素聯(lián)合蛇床子素培養(yǎng)48 h; 阿霉素+蛇床子素+p53 siRNA組為p53 siRNA(50 nmol/mL)轉(zhuǎn)染的細胞加入阿霉素聯(lián)合蛇床子素培養(yǎng)48 h；上述各組中無關(guān)寡聚核苷酸濃度為50 nmol/L,蛇床子素濃度為50 μmol/L，DOX濃度為0.5 μmol/L。藥物處理完畢后在培養(yǎng)孔中加入20 μL濃度為5 g/L 的MTT再培養(yǎng)4 h，小心吸去上清液，往孔中加入150 μL二甲基亞砜，充分震蕩后在570 nm波長下用酶標儀檢測吸光度(A)值。細胞活力結(jié)果用藥物處理組與對照組的A值比值表示。

3.3Western blot實驗轉(zhuǎn)染后的LNCaP細胞按每孔2×106個接種在6孔板上孵育過夜，按3.2所述進行分組培養(yǎng)。為了測定LNCaP細胞線粒體中細胞色素C的釋放，先用線粒體分離試劑盒按說明書步驟將線粒體分離出來，然后再收集細胞質(zhì)檢測其中的細胞色素C的蛋白水平。其它蛋白質(zhì)直接用蛋白提取液提取LNCaP細胞中的總蛋白質(zhì)進行檢測。將蛋白質(zhì)用10% SDS-PAGE進行分離，分離完畢后通過電轉(zhuǎn)方法將蛋白質(zhì)從分離膠上轉(zhuǎn)到PVDF膜上，用抗SIRT1、p53、乙?；痯53、Puma、caspase-9、caspase-3、細胞色素C和GAPDH抗體孵育過夜，之后再用帶辣根過氧化物酶的 II 抗孵育2 h，最終蛋白條帶用ECL試劑盒顯色發(fā)光。

3.4流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡轉(zhuǎn)染后的LNCaP細胞按每孔2×106個接種在6孔板上孵育過夜，按3.2所述進行分組培養(yǎng)。按照凋亡試劑盒說明書步驟將碘化丙啶和Annexin-V加入細胞中孵育20 min，采用流式細胞術(shù)檢測腫瘤細胞的凋亡，凋亡率用Annexin-V陽性細胞數(shù)占總細胞數(shù)的百分比表示。

4　統(tǒng)計學處理

所有實驗重復3次，實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，并用SPSS 15.0統(tǒng)計分析軟件進行處理。多組間均數(shù)的兩兩比較采用單因素方差分析統(tǒng)計檢驗方法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學顯著性。

結(jié)　　果

1　蛇床子素下調(diào)LNCaP細胞中SIRT1的表達并提高其對阿霉素的敏感性

細胞活力檢測實驗結(jié)果顯示，蛇床子素能顯著提高阿霉素對LNCaP細胞的殺傷活性(P<0.05)，見圖1A。Western blot實驗結(jié)果顯示，蛇床子素能明顯抑制LNCaP細胞中SIRT1蛋白的表達水平(P<0.05)，提示蛇床子素發(fā)揮協(xié)同效應的機制和可能和SIRT1的下調(diào)有關(guān)，見圖1B。轉(zhuǎn)染SIRT1過表達質(zhì)粒后，蛇床子素聯(lián)合阿霉素對LNCaP細胞的殺傷活性明顯降低(P<0.05)，表明蛇床子素可能通過下調(diào)LNCaP細胞中SIRT1的表達來提高其對阿霉素的敏感性，見圖1A。

Figure 1.Osthole sensitized LNCaP cells to DOX by downregulating the expression of SIRT1.A:osthole increased the cytotoxicity of DOX to LNCaP cells,which can be inhibited by SIRT1 plasmid transfection; B:osthole treatment down-regulated the expression of SIRT1 in LNCaP cells.Mean±SD.n=3.&P<0.05vsDOX group；#P<0.05vsDOX+osthole group；*P<0.05vscontrol group.
圖1蛇床子素下調(diào)LNCaP細胞中SIRT1的表達并提高其對阿霉素的敏感性

2　蛇床子素促進阿霉素對LNCaP細胞的殺傷活性依賴于p53的活化

Western blot實驗結(jié)果顯示，蛇床子素能明顯增強阿霉素對LNCaP細胞p53蛋白的誘導，使p53蛋白過表達并發(fā)生明顯的乙?；揎棧欢D(zhuǎn)染SIRT1過表達質(zhì)粒后，蛇床子素聯(lián)合阿霉素誘導的LNCaP細胞p53的表達及乙酰化水平顯著降低(P<0.05)，表明蛇床子素通過下調(diào)SIRT1的表達促進阿霉素對LNCaP細胞p53的活化，見圖2A。當LNCaP細胞轉(zhuǎn)染p53 siRNA后，蛇床子素聯(lián)合阿霉素對LNCaP細胞的殺傷活性顯著降低(P<0.05)，見圖2B。另外，Western blot實驗結(jié)果顯示，蛇床子素雖然同樣能抑制p53缺失型前列腺癌細胞系PC3細胞[14]中的SIRT1表達水平(P<0.05)，但蛇床子素卻不能明顯提高PC3細胞對阿霉素治療的敏感性，見圖2C、D。這些結(jié)果表明蛇床子素是通過SIRT1/p53途徑提高阿霉素對前列腺癌細胞殺傷活性的。

3　蛇床子素增強阿霉素誘導的LNCaP細胞發(fā)生線粒體途徑的凋亡

Western blot實驗結(jié)果顯示，蛇床子素聯(lián)合阿霉素能顯著誘導LNCaP細胞中p53下游蛋白Puma[15]的表達(P<0.05)；同時，蛇床子素聯(lián)合阿霉素還可明顯誘導細胞色素C從線粒體釋放到細胞質(zhì)中(P<0.05)，表明蛇床子素可能對阿霉素誘導的線粒體途徑凋亡有促進作用，見圖3A、B。進一步實驗發(fā)現(xiàn)，蛇床子素聯(lián)合阿霉素能顯著誘導LNCaP細胞中caspase-9及其下游凋亡執(zhí)行蛋白caspase-3的活化(P<0.05)，并最終誘導LNCaP細胞發(fā)生顯著凋亡(P<0.05)，見圖3C、D。另一方面，無論是SIRT1質(zhì)?；騪53 siRNA均能明顯抑制蛇床子素聯(lián)合阿霉素誘導的上述凋亡分子表達及活化，這些結(jié)果證明了蛇床子素能通過SIRT1/p53途徑促進阿霉素誘導前列腺癌細胞發(fā)生線粒體途徑的凋亡。

Figure 2.Osthole promoted DOX-induced cell death in LNCaP cells through the SIRT1/p53 pathway.A:Osthole promoted DOX-induced expression and acetylation of p53 in LNCaP cells; B:knockdown ofp53 inhibited cell death of LNCaP induced by osthole and DOX co-treatment; C:osthole suppressed the expression of SIRT1 in PC3 cell line; D:osthole failed to enhance the cytotoxicity of DOX against PC3 cells.Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group；&P<0.05vsDOX group；#P<0.05vsDOX+osthole group.
圖2蛇床子素通過SIRT1/p53途徑促進阿霉素對LNCaP細胞的殺傷活性

討　　論

腫瘤(包括前列腺癌)對化療藥物的抵抗是臨床上限制化療療效的重要因素[16-17]。有文獻報道，聯(lián)合一些中藥活性成分進行輔助治療是提高化療藥物抗腫瘤活性的有效策略[18]。近年來有研究報道了蛇床子素能明顯增強腎上腺髓質(zhì)嗜鉻瘤和肺癌細胞對化療的敏感性[19-20]，提示蛇床子素可能是一種很好的化療增敏劑。然而，蛇床子素是否對前列腺癌的化療有輔助治療作用，至今還未充分報道。本研究發(fā)現(xiàn)蛇床子素能明顯提高p53野生型前列腺癌細胞對阿霉素的敏感性。

SIRT1是一種組蛋白去乙酰化酶。文獻報道SIRT1在乳腺癌、肝癌和前列腺癌等多種腫瘤中發(fā)生過表達，從而促進腫瘤的發(fā)生、生長、轉(zhuǎn)移并誘導化療藥物抵抗的發(fā)生[21-23]。因此，SIRT1目前已成為腫瘤治療和化療藥物增效的重要靶點。本研究發(fā)現(xiàn)SIRT1在前列腺癌中是蛇床子素的靶點，蛇床子素能通過抑制前列腺癌細胞中SIRT1的表達來增強阿霉素治療對LNCaP細胞的殺傷活性。

在SIRT1的下游底物中，p53蛋白是重要的凋亡調(diào)控因子。正常情況下腫瘤細胞中的p53維持在較低水平。然而p53在DNA發(fā)生損傷(如用阿霉素進行治療)時會發(fā)生乙?；揎?，而乙?；膒53能穩(wěn)定存在并具有轉(zhuǎn)錄活性，能誘導下游Puma等促凋亡蛋白的表達而使細胞發(fā)生凋亡[24-26]。然而，腫瘤細胞中SIRT1的過表達能通過去乙?；饔檬筽53蛋白無法在阿霉素的誘導下發(fā)生乙?；せ?，從而保護腫瘤細胞逃避藥物誘導的凋亡信號。本研究發(fā)現(xiàn)蛇床子素能通過下調(diào)p53野生型前列腺癌細胞中SIRT1的表達水平，使p53恢復對阿霉素誘導的DNA損傷的敏感性而發(fā)生乙?；揎棧叽沧铀卣T導的p53乙?；终T導下游促凋亡蛋白Puma的表達，從而使p53野生型前列腺癌細胞在阿霉素的治療下發(fā)生線粒體途徑的凋亡。本研究中，p53缺失型前列腺癌細胞對蛇床子素和阿霉素聯(lián)合治療不敏感也佐證了這一結(jié)論。

Figure 3.Osthole promoted DOX-induced mitochondrial apoptosis in the LNCaP cells.A:combination with osthole and DOX significantly induced the expression of Puma in the LNCaP cells; B:osthole promoted DOX-induced release of cytochrome C from mitochondria into cytoplasm in the LNCaP cells; C:osthole promoted DOX-induced cleavage of caspase-9 and caspase-3 in the LNCaP cells; D:combination with osthole and DOX significantly induced apoptosis of LNCaP cells,which was suppressed by either SIRT1 plasmid or p53 siRNA.Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;&P<0.05vsDOX group;#P<0.05vsDOX+osthole group.
圖3蛇床子素增強阿霉素誘導的LNCaP細胞發(fā)生線粒體途徑的凋亡

綜上所述，本研究證明了蛇床子素能通過抑制STRT1表達顯著提高阿霉素對p53野生型前列腺癌細胞的殺傷活性。

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