新型殺菌劑Pyraziflumid的合成及生物活性

張寶俊，郭崇友 編譯

(南京紅太陽股份有限公司，南京 211300)

已獲得了與萎銹靈(carboxin)相關的甲酰胺(carboxamide)類化合物，并已證明其可選擇性防治由擔子菌綱病原菌引起的植物病害。1990年發(fā)現(xiàn)的2-氯-N-(1,1,3-三甲基茚滿-4-基)吡啶-3-甲酰胺(BC723)能有效防治由子囊菌綱病原菌引起的灰霉病及擔子菌綱病原菌引起的小麥葉銹病(Puccinia recondita)和水稻紋枯病(Rhizoctonia solani)。BC723具有抑制灰葡萄孢菌和水稻紋枯病菌等病原菌的線粒體琥珀酸脫氫酶復合物(SDC)的活性。BC723類似物對灰霉菌、水稻紋枯病菌殺菌活性的構(gòu)效關系在之前已有研究報道。在這之后，以BC723為先導化合物發(fā)現(xiàn)了吡噻菌胺{N-[2-(1,3-二甲基丁基)-3-噻吩基]-1-甲基-3-(三氟甲基)吡唑-4-甲酰胺}，一些其他琥珀酸脫氫酶抑制劑(SDHI)類廣譜殺菌劑也被發(fā)現(xiàn)和推出。幾乎所有的這類殺菌劑都具有吡啶或者吡唑基團作為羧酸部分。但前期有關N-(1,1,3-三甲基茚滿-4-基)-甲酰胺類的構(gòu)效關系研究表明，3-取代吡嗪-2-甲酰胺類也可能具有與2-取代吡啶-3-甲酰胺類一樣高的活性。據(jù)此，為了發(fā)現(xiàn)另外一種比BC723更廣譜和更有效抑制SDC的新型SDHI殺菌劑，開始重新對羧酸部分進行研究。對吡嗪類化合物驗證中，發(fā)現(xiàn)3-(三氟甲基)吡嗪-2-甲酰胺類對多種植物病害具有較高的抑制活性。通過對一系列化合物殺菌效果的優(yōu)化研究，最終發(fā)現(xiàn)了pyrazi fl umid[N-(3′,4′-二氟聯(lián)苯-2-基)-3-(三氟甲基)吡嗪-2-甲酰胺](圖1)。Pyrazi fl umid對蔬菜、果樹、草坪、水稻的灰霉病、菌核病、白粉病等多種病害具有極高活性。該產(chǎn)品已經(jīng)通過了日本植物保護協(xié)會的官方評審，代號為NNF-0721，并已在日本獲準登記。本文闡述了吡嗪-2-甲酰胺類的發(fā)現(xiàn)、化學性質(zhì)，同時通過對黃瓜灰霉病、小麥葉銹病和大麥白粉病防治效果的評價探討了構(gòu)效關系。

圖1 Pyrazi fl umid的發(fā)現(xiàn)

1 材料和方法

1.1 化合物制備

使用以四甲基硅烷為內(nèi)標的Bruker ARX-400 NMR譜儀，通過1H-NMR光譜確定化合物的化學結(jié)構(gòu)。以Mettler FP80 熔點測試儀測定熔點，測定結(jié)果未校正。

1.1.1 合成

根據(jù)圖2所示，測試化合物根據(jù)2種路線中的任意一條路線來合成的。

圖2 3-(三氟甲基)吡嗪-2-甲酰胺的合成路線

第1條路線(路線A)是：甲基3-(三氟甲基)吡嗪-2-羧酸鹽(2)和相應的聯(lián)苯胺(4)反應生成N-(取代的聯(lián)苯-2-基)3-(三氟甲基)吡嗪-2-甲酰胺(5)。第2條路線(B)是：由甲基3-(三氟甲基)吡嗪-2-羧酸鹽(2)合成3-(三氟甲基)吡嗪-2-羧酸(3)后與相應的聯(lián)苯胺(4)合成而或得。甲基3-(三氟甲基)吡嗪-2-羧酸鹽(2)由甲基3-氯吡嗪-2-羧酸鹽(1)三氟甲基化獲得。下文以pyraziflumid和化合物14的合成為例進行介紹。

1.1.2 甲基3-(三氟甲基)吡嗪-2-羧酸鹽(2)

將32.5 g (188 mmol)甲基3-氯吡嗪-2-羧酸(1)、35.8 g (188 mmol)碘化銅混合物加入到60 mL二甲基甲酰胺(DMF)和60 mL甲苯中，在溫度達到100 ℃時加入54.2 g (282 mmol)甲基-2-(氟磺酰)二氟乙酸鹽。在氬氣中混勻后加熱到115 ℃保持2 h。冷卻后，反應混合物通過硅藻土過濾，隨后用乙酸乙酯稀釋濾液。用水和鹽水洗滌有機層，加入硫酸鈉使其干燥，然后在真空中濃縮。殘留物通過色譜柱(SiO2，正己烷∶醋酸鹽=4∶1)得到無色油狀液體即為甲基3-(三氟甲基)吡嗪-2-羧酸鹽(2) (24.0 g，收率62%)。1H-NMR (CDCl3) δ ppm: 8.85 (d, 1H), 8.83(d, 1H), 4.05 (s, 3H)。

1.1.3 3-(三氟甲基)吡嗪-2-羧酸(3)

將9.8 g (47.5 mmol)的化合物甲基3-(三氟甲基)吡嗪-2-羧酸(2)溶于30 mL乙醇中，水冷卻后加入KOH水溶液[3.2 g (48.0 mmol) KOH溶于40 mL水]，在室溫下攪拌1.5 h。反應混合液在真空下濃縮，殘留物用乙醚清洗。水層用c-HCl酸化，隨后用乙酸乙酯萃取并用水和鹽水洗滌。用無水硫酸鎂干燥，真空濃縮得到白色晶體3-(三氟甲基)吡嗪-2-羧酸(3)(7.00 g，收率63%)。熔點146.5～147°C.1H-NMR(CDCl3) δ ppm: 8.96 (d, 1H), 8.88 (d, 1H), 3.2-3.9 (br,1H)。

1.1.4 N-(取代的聯(lián)苯-2-基)-3-(三氟甲基)吡嗪-2-甲酰胺 (5)

1.1.4.1 通過路線A合成N-(3′,4′-二氟聯(lián)苯-2-基)-3-(三氟甲基)吡嗪-2-甲酰胺 (pyrazi fl umid)

將40.0 g (195 mmol) 3′,4′-二氟聯(lián)苯-2-胺(4)、40 mL N,N-二甲基乙酰胺和28%甲醇鈉混合物加入118 mL(580 mmol)甲醇溶液中，再加入50.1 g (243 mmol)甲基3-(三氟甲基)吡嗪-2-羧酸鹽(2)，于室溫下攪拌9 h。將反應混合液倒入含有250 g冰水和50 mL的c-HCl混合液中，隨后用乙酸乙酯進行萃取。萃取液用水和鹽水洗過之后在真空條件下濃縮，殘留物在庚烷和乙酸乙酯中重結(jié)晶后得到淡黃色晶體(pyrazi fl umid)(60.4 g，收率86%)。熔點119～120 ℃。1H-NMR(CDCl3) δ ppm: 9.56 (s, 1H), 8.83 (d,1H), 8.64 (s, 1H),8.54 (d, 1H), 7.47 (dt, 1H), 7.3 (m, 4H), 7.19 (m,1H)。水中溶解度：2.32×10-3g/L(20 ℃)，分配系數(shù)為log Po/w：3.51 (25 ℃)。

1.1.4.2 通過路線B合成3-(三氟甲基)-N-[4'-(三氟甲基)聯(lián)苯-2-基]吡嗪-2-甲酰胺(14)

將192 mg (1.00 mmol)3-(三氟甲基)吡嗪-2-羧酸(3)，238 mg (1.00 mmol) 4'-(三氟甲基)聯(lián)苯-2-胺(4)和255 mg (1.00 mmol)2-氯-1-甲基吡啶鹽碘化物加入到10 mL的四氫呋喃溶液里，混合均勻后再加入303 mg(3.00 mmol)三乙胺，于室溫下攪拌9 h。用乙酸乙酯稀釋反應混合液，隨后用水和鹽水洗滌。有機層用硫酸鎂酸酐干燥，然后在真空中濃縮。將殘留物用硅膠柱層析柱(洗脫液：己烷∶乙酸乙酯=2∶1)純化，得到的白色固體即為3-(三氟甲基)-N-[4'-(三氟甲基)聯(lián)苯-2-基]吡嗪-2-甲酰胺(化合物14)(293 mg，收率62%)。熔點147～148 ℃。1H-NMR (CDCl3) δ ppm:9.5 (s, 1H), 8.81 (s, 1H), 8.58 (d, 1H), 8.54 (d, 1H), 7.76(d, 2H), 7.59 (d, 2H), 7.48 (t, 1H), 7.3 (m, 2H)。

1.4.3 其他衍生物

其他的衍生物也用相似的方法合成(利用吡嗪羧酸/脂和相應的聯(lián)苯-2-胺以及市售試劑和溶劑)。

2 生物測定

2.1 施用方法

將每個化合物制備成有效成分100 g/L的乳油制劑，以含濕潤劑(Mai-Rinoh?, 0.1 mL/L)的水稀釋成一定濃度(有效成分0.5～200 mg/L)。于黃瓜1.5葉期、小麥幼苗2葉期、大麥苗2葉期時噴施相當于每公頃2 000 L的測試溶液。風干后，接種靶標真菌，每個處理2個重復。

2.2 接種方法

2.2.1 黃瓜灰霉病

將處理組的黃瓜子葉切除，置于塑料盒中。將一定孢子濃度(1×106孢子/L)灰葡萄孢菌懸液接種至具馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基的濾紙片(直徑6 mm)上，將濾紙片置于子葉中心，于15 ℃濕潤環(huán)境下保持5 d。

2.2.2 小麥葉銹病

將葉銹菌(1×106孢子/mL)接種到被處理過的小麥上，置入20 ℃、相對濕度100%的培養(yǎng)室，于黑暗條件保持24 h。隨后將接種的植物置于溫室培養(yǎng)7 d。

2.2.3 大麥白粉病

將從感病植物直接采集的大麥白粉病病原菌(Blumeria graminis f. sp. Hordei)孢子涂布于處理大麥植株上，接種后溫室中放置7 d。

2.3 評價方法

以植物葉片侵染面積來評價防治活性。目測法估量侵染面積，根據(jù)下式計算防治率(%)：防治率=(未經(jīng)處理葉片被侵染面積－經(jīng)處理葉片被

侵染面積)/未經(jīng)處理葉片被侵染面積×100通過防治率計算EC80，評價測試化合物的抗真菌活性。EC80為防治效果達到80%時測試化合物的濃度。

3 結(jié)果與討論

3.1 吡啶-3-和吡嗪-2-甲酰胺類的生物活性

根據(jù)之前發(fā)表的關于N-(1,1,3-三甲基茚滿-4-基)甲酰胺類的構(gòu)效關系的文章，3-取代吡嗪-2-甲酰胺類對由擔子菌綱和子囊菌綱病原菌引起的病害的防治活性和2-取代吡啶-3-甲酰胺類一樣高。圖3總結(jié)了N-(1,1,3-甲基茚滿-4-基)吡啶-3-和吡嗪-2-甲酰胺類化合物的關系及其對灰霉病和小麥葉銹病的殺菌活性。就吡啶-3-甲酰胺類來說，2-甲基吡啶-3-甲酰胺衍生物(1)對這2種病害具有中等活性。2-位取代基由甲基變?yōu)槁仍拥腂C723，對葉銹病的防治活性不變，但對灰霉病的防治活性提高了。此外，2-三氟甲基-吡啶-3-甲酰胺衍生物(3)對葉銹病的活性高于2-氯-取代衍生物(BC723)，而對灰霉病的防治活性相當。對吡嗪-2-甲酰胺類而言，3-甲基吡嗪-2-甲酰胺衍生物(4)對這2種病害具有中等活性。3-位取代基由甲基變?yōu)槁仍拥幕衔?，同樣對葉銹病的防治活性不變，但對灰霉病的防治活性顯著提高了。如果吡嗪-2-甲酰胺類的取代基效應與吡啶衍生物有相似的趨勢，那么就可以預測3-(三氟甲基)吡嗪衍生物對這2種病害的防效優(yōu)于BC723。但此前對3-(三氟甲基)吡嗪-2-羧酸一無所知，被當作一種新化合物來合成。利用其合成了3-(三氟甲基)吡嗪-2-甲酰胺類，并測試了它們的各種殺菌活性。

圖3 N-(1,1,3-三甲基茚滿-4-基)吡啶和吡嗪酰胺類的殺菌活性

表1總結(jié)了N-(1,1,3-三甲基茚滿-4-基)吡啶-3或吡嗪-2-甲酰胺類化合物及其對大麥白粉病、黃瓜灰霉病和小麥葉銹病的殺菌活性。在吡啶類衍生物中，2-(三氟甲基)吡啶-3-甲酰胺(3)對灰霉病的防治活性與氯取代衍生物(2, BC723)相當，而對小麥葉銹病的防治活性僅比后者略高一點。三氟甲基取代衍生物(3)對大麥白粉病的防治活性低于氯取代衍生物(2)。在吡嗪類衍生物中，3-(三氟甲基)吡嗪-2-甲酰胺(6)對灰霉病的防治活性與氯取代衍生物(5)相當，這與吡啶類衍生物的情況一致。但(三氟甲基)吡嗪衍生物(6)對小麥葉銹病和大麥白粉病的防治活性比氯取代衍生物(5)分別高10倍和20～200倍。因此，3-(三氟甲基)-吡嗪-2-甲酰胺對多種植物病害的防治活性比其他甲酰胺更高。這種活性的大幅度增強似乎與3-取代吡嗪-2-甲酰胺類特有的三氟甲基的取代基效應有關，因為2-取代吡啶-3-甲酰胺類并沒有出現(xiàn)這種情況。

表1 N-(1,2,3-三甲基茚滿-4-基)吡啶-3-或吡嗪-2-甲酰胺類及其生物活性

據(jù)報道，一些N-(聯(lián)苯-2-基)甲酰胺類具有與N-(1,1,3-三甲基茚滿-4-基)甲酰胺類化合物類似的生物活性。研究了(三氟甲基)吡嗪基團對N-(聯(lián)苯-2-基)甲酰胺的這一特殊取代基效應的普遍性，結(jié)果見表2。3-(三氟甲基)吡嗪-2-甲酰胺(8)對灰霉病的防治活性略高于氯取代衍生物(7)，但其對大麥白粉病和小麥葉銹病的防治活性均比氯取代衍生物(7)高10～100倍。因此，同樣在N-(聯(lián)苯-2-基)甲酰胺類化合物中觀察到(三氟甲基)吡嗪基團的特定取代基效應。由于N-(聯(lián)苯-2-基)-3-(三氟甲基)吡嗪-2-甲酰胺對所有這3種病害均具有均等的較高防治活性，因此后續(xù)研究將對聯(lián)苯基部分的取代基進行優(yōu)化。

3.2 構(gòu)效關系

3.2.1 N-(4'-取代聯(lián)苯-2-基)-3-(三氟甲基)吡嗪-2-甲酰胺類

聯(lián)苯基部分4'-位被烷基基團、三氟甲基或者鹵原子取代的N-(聯(lián)苯-2-基)-3-(三氟甲基)吡嗪-2-甲酰胺類的殺菌活性見表3。甲基或者叔丁基衍生物(9、10)對灰霉病的防治活性與未取代的化合物(8)相當，但對葉銹病和白粉病的防治活性低于后者。鹵原子或三氟甲基衍生物(11－14)對葉銹病防治活性與未取代的化合物(8)相當，但對灰霉病和白粉病防治活性高于后者。這表明聯(lián)苯基4'-位的吸電子基團可能有助于提高化合物的殺菌活性。因此，在后續(xù)研究中考察了各個位置的取代基效應。

表2 N-(聯(lián)苯-2-基)-3-取代吡嗪-2-甲酰胺類及其生物活性

表3 N-(4'-取代聯(lián)苯-2-基)-3-(三氟甲基)吡嗪-2-甲酰胺類及其生物活性

3.2.2 N-(取代聯(lián)苯-2-基)-3-(三氟甲基)吡嗪-2-甲酰胺類

表4為2′-、3′-或4′-位被氟原子、氯原子或三氟甲基取代的N-(聯(lián)苯-2-基)-3-(三氟甲基)吡嗪-2-甲酰胺類化合物及其殺菌活性。4′-位被氟原子取代的衍生物(11)對灰霉病的防治活性最強， 3′-位取代的衍生物(15)次之，2′-位取代的衍生物(16)的活性最低。類似地，4′-位被氯原子和三氟甲基取代的衍生物(12、14)對灰霉病的活性是各自位置異構(gòu)體中最高的。3′-位被氟原子取代的衍生物(15)對葉銹病的活性最高，其次為4′-和2′-位取代的衍生物(11、16)。類似地，3′-位被氯原子和三氟甲基取代的衍生物(17、19)對葉銹病的活性是各自位置異構(gòu)體中最高的。以上結(jié)果表明，測試化合物對灰霉病的防治活性可能主要取決于4′-位的吸電子基團的特異效應，而對葉銹病的防治活性受3′-位取代基的影響。2′-位被氯原子或三氟甲基取代的化合物16和18對灰霉病和葉銹病的活性是各自位置異構(gòu)體中最低的，這可能是由于2′-位取代不利于對灰霉病和葉銹病的防治活性。

表4 N-(單取代聯(lián)苯-2-基)-3-(三氟甲基)吡嗪-2-甲酰胺類及其生物活性

氟原子取代的衍生物(11、15、16)對白粉病的防治活性相當。4′-位被氯原子取代的衍生物(12)對白粉病的防治活性比它的位置異構(gòu)體(17、18)低，而4′-位被三氟甲基取代的衍生物(14)的活性則比它的位置異構(gòu)體(19)高。因此，測試化合物對白粉病的防治活性沒有觀察到上文中提到的取代基的位置特異性效應。

3.2.3 N-(二取代聯(lián)苯-2-基)-3-(三氟甲基)吡嗪-2-甲酰胺類

由于已經(jīng)闡明了在聯(lián)苯基上具有單個取代基的衍生物的構(gòu)效關系，接下來測定了具2個取代基的衍生物的殺菌活性。聯(lián)苯基的2個位置被氟原子、氯原子或三氟甲基取代的N-(聯(lián)苯-2-基)-3-(三氟甲基)吡嗪-2-甲酰胺類及其殺菌活性見表5。在3'-和4'-位為氟原子、氯原子或三氟甲基的化合物20－23對灰霉病的防治活性與4'-位為氟原子、氯原子或三氟甲基的對應單取代化合物11、12和14一樣高。化合物20－23對葉銹病的防治活性也與3'-位為氟原子或氯原子的對應單取代化合物15和17相當。對在3'和4'-位取代的衍生物評價結(jié)果表明，4'-位和3'-位的取代基的位置特異性可獨立地起作用，提高對灰霉病和葉銹病的防治活性。但化合物20和23對葉銹病的防治活性比3'-位氟原子衍生物(15)略高。那么，除了3'-位的位置特異性效應外，3'-位的氟原子和4-位的三氟甲基或氟原子對防治葉銹病可能產(chǎn)生協(xié)同效應。

表5 N-(二取代聯(lián)苯-2-基)-3-(三氟甲基)吡嗪-2-甲酰胺類及其生物活性

3'-和5'-位被氟原子取代的化合物24對灰霉病和葉銹病的活性與3'-位單氟取代衍生物(15)相當。3'-和5'-位被2個氯原子或三氟甲基取代的化合物25和26對灰霉病和葉銹病的活性比3'-位單氯或單三氟甲基取代衍生物(17、19)略低。這些數(shù)據(jù)表明，對防治葉銹病來說，3'-、5'-雙取代的衍生物對3'-和5'-位的位置特異性取代基效應沒有產(chǎn)生額外貢獻。

2'-和4'-位被氟或氯原子取代的化合物27－29比各自2'-位取代衍生物(16、18)對灰霉病的防治活性高10倍，對葉銹病的防治活性僅略高一點。對灰霉病防治活性的大幅度提高可能是由4'-位的特定取代基效應引起的。2'-和5'-位被氟原子取代的化合物30比2'-位取代衍生物(16)對葉銹病的活性低10倍，對灰霉病的活性相當。這些評價結(jié)果也證明了4'-或3'-位的位置特異性取代基效應可能是獨立的，還提高了對灰霉病和葉銹病的防治活性。

3'-或4'-位氟取代化合物20、22和23對白粉病的防治活性比其他3'-和4'-雙取代的衍生物高。3'-和5'-被氟原子取代的化合物24是3',5'-二取代化合物中對白粉病防治活性最高的。2'-或4'-位被氟原子取代的化合物27和29對白粉病的活性也比2',4'-二氯衍生物(28)高。這些結(jié)果表明，在任一位置含有氟原子的二取代的衍生物可能都對白粉病具有較高防治活性。

在所測試化合物中，3'-和4'-位被氟原子取代的化合物20對3種病害均具有最高的活性。通過進一步的檢測和田間試驗，最終選擇了化合物20為開發(fā)化合物(pyrazi fl umid)，其憑借優(yōu)異的性能成為新型殺菌劑候選。

4 結(jié) 論

Pyraziflumid是一種新穎SDHI殺菌劑，屬3-(三氟甲基)吡唑-2-甲酰胺類，該類化合物與N-(聯(lián)苯-2-基)以及N-(1,1,3-三甲基茚滿-4-基)甲酰胺類類似，對多種植物病害具有極高防治活性。N-(聯(lián)苯-2-基)-3-(三氟甲基)吡嗪-2-甲酰胺類的構(gòu)效關系表明，對灰霉病的防治活性可能取決于4'-位的取代基效應，而對葉銹病的防治活性可能受3'-位取代基的影響。4'-或3'-位的位置特異性取代基效應似乎是獨立的，對灰霉病和葉銹病的防治活性起著積極作用。對白粉病的防治活性沒有觀察到取代基的位置特異性，但在任何位置含有氟原子的雙取代衍生物均表現(xiàn)出較高活性。通過評價對3種病害的防治活性探討構(gòu)效關系的結(jié)果表明，從獨特的位置特異性取代基效應的角度來看，作為殺菌劑pyrazi fl umid [N-(3′,4′-二氟聯(lián)苯-2-基)-3-(三氟甲基)吡嗪-2-甲酰胺]是最適宜的化合物。