植物源殺蟲劑發(fā)展新方向

葉 萱 編譯

(上海市農(nóng)藥研究所，上海 200032)

植物通過基礎(chǔ)代謝作用能合成許多化學(xué)物質(zhì)，其中大部分是植物生長、發(fā)育和繁殖等重要功能所需的物質(zhì)，但有一小部分為次生化合物途徑的底物。在這些化合物中，一些類別在適應(yīng)環(huán)境和防御機(jī)制中具有一定作用而值得關(guān)注：蛋白質(zhì)化合物和次級代謝物。植物會(huì)因多種因素產(chǎn)生這兩類物質(zhì)。作為植物構(gòu)成物質(zhì)，它們能夠降低植物組織的適口性或使取食生物中毒；作為誘導(dǎo)性物質(zhì)，在植物組織遭受危害時(shí)，植物合成這些物質(zhì)。從進(jìn)化的角度看，這些化合物與植物成功抵御昆蟲危害的保護(hù)機(jī)制有緊密的關(guān)系。因此，這些化合物對許多害物有毒，是防治害物潛在的方法。

人類使用植物和植物產(chǎn)品防治害蟲和微生物的確切時(shí)間已無法知曉，但與農(nóng)業(yè)生產(chǎn)有久遠(yuǎn)的關(guān)系。最初簡單、直接地應(yīng)用植物防治害物，隨著知識的擴(kuò)展和經(jīng)歷不同的文明，在19世紀(jì)前，開始應(yīng)用植物提取物為農(nóng)藥。同時(shí)期，對一些植物次生化合物進(jìn)行了鑒定和表征，近而用于趨避劑和殺生劑，主要為煙堿和其同分異構(gòu)體假木賊堿等生物堿。但是其他兩個(gè)重要類別化合物改變了天然化合物的合成之路，開始了天然化合物啟發(fā)的農(nóng)藥研發(fā)之路。這兩類為魚藤酮和除蟲菊酯。

一直到二戰(zhàn)，植物源農(nóng)藥被廣泛用于農(nóng)業(yè)害蟲的防治。然而，在20世紀(jì)30年代末，植物源農(nóng)藥被合成有機(jī)化合物取代，這些物質(zhì)持效期長，選擇性小，如六六六(C6H6Cl6)、滴滴涕(C14H9Cl5)、艾氏劑(C12H8Cl6)、狄氏劑(C12H8Cl6O)和氯丹(C10H6Cl8)。此后有機(jī)氯農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)中一直占據(jù)主導(dǎo)地位，直到20世紀(jì)70年代農(nóng)場工人急性中毒、地下水污染、野生動(dòng)物的死亡、傳粉媒介受到影響和昆蟲抗性的產(chǎn)生等許多事件的出現(xiàn)，引起人們對農(nóng)藥選擇性和在環(huán)境中的持效性的關(guān)注。

自此以后，全球?qū)r(nóng)藥對人畜健康和環(huán)境影響的關(guān)注不斷增加對合成殺蟲劑使用的行政管理和和限制。目前是重新評估植物殺蟲劑的恰好時(shí)機(jī)，植物源殺蟲劑受到科學(xué)巨大進(jìn)步的影響，在過去20多年中有關(guān)植物提取物防治節(jié)肢動(dòng)物的文獻(xiàn)量大量增加。本文對使用最廣和最有發(fā)展前景的植物源殺蟲劑進(jìn)行收集和分類。介紹了一些商業(yè)化防治害蟲的植物化學(xué)物質(zhì)類別，也討論了作為植物部分防御機(jī)制的蛋白質(zhì)化合物。雖然對這些蛋白質(zhì)化合物進(jìn)行了大量研究，但仍沒有有效地應(yīng)用于田間。

1 次級代謝產(chǎn)物

次級代謝產(chǎn)物可作為趨避劑、取食抑制劑和毒物有效防治植食性昆蟲。這類植物化學(xué)物質(zhì)被廣泛用于作物保護(hù)直到20世紀(jì)40年代有機(jī)氯農(nóng)藥的登場?，F(xiàn)在這些物質(zhì)主要用于有機(jī)農(nóng)業(yè)中，但仍是生物勘探新分子的重要途徑。事實(shí)上，已對許多植物品種的殺蟲特性進(jìn)行了篩選，文獻(xiàn)也報(bào)道了大量的具有生物活性的化合物，然而，其中很少的物質(zhì)被適當(dāng)?shù)販y試，現(xiàn)在只有4個(gè)有效商業(yè)化的植物源產(chǎn)品：除蟲菊酯、魚藤酮、印楝素和精油。表1列出了過去10年商業(yè)化的主要活性物質(zhì)。自此以后，全球市場沒有發(fā)生大的變化，部分原因是為天然產(chǎn)品申請專利有很大的難度。

從經(jīng)濟(jì)角度看，除蟲菊酯代表最重要一類商業(yè)化植物源殺蟲劑。通常從除蟲菊(Chrysanthemum cinerariaefolium)的花提取，此植物的活性化合物是1類結(jié)構(gòu)相似的酯。除蟲菊酯I含量最大，也是殺蟲活性最高的成分(圖1A)。已知除蟲菊酯具有擊倒作用，作用于昆蟲后，昆蟲先過度興奮，而后麻痹死亡。這是由于除蟲菊酯作用后，昆蟲的神經(jīng)細(xì)胞膜內(nèi)的鈉離子通道打開而引發(fā)的癥狀。純除蟲菊酯對哺乳動(dòng)物具有中等毒性(LD50～350～500 mg/kg)，但商業(yè)化產(chǎn)品(有效成分約25%)毒性低(約1 500 mg/kg)。然而，除蟲菊酯特別不穩(wěn)定，在紫外光下極易分解。一些研究表明在田間除蟲菊脂的半衰期約為2 h，這大大限制了其防治農(nóng)業(yè)害蟲的應(yīng)用。盡管如此，除蟲菊酯仍然列于植物源殺蟲劑的首位，在全球銷售用于家庭園藝和花卉植物栽培中的害蟲管理。

表1 商業(yè)化植物源殺蟲劑中的主要次生化合物和官能團(tuán)

圖1 A)除蟲菊酯I的三維結(jié)構(gòu)和分子式，B)魚藤酮的三維結(jié)構(gòu)和分子式

魚藤酮為熱帶豆科植物根或根莖產(chǎn)生的異黃酮類物質(zhì)(圖1B)。它們是毒性極高的次生化合物，抑制昆蟲的食欲，致其數(shù)小時(shí)或數(shù)日內(nèi)死亡。在67種以上豆科植物中這些物質(zhì)的含量豐富，且由其開發(fā)了一個(gè)廣譜非內(nèi)吸殺蟲劑，用于防治蚜蟲、薊馬和刺吸式害蟲。此化合物的作用機(jī)制不同于除蟲菊酯，其作用于線粒體，阻斷了從復(fù)合體I鐵硫中心到輔酶Q的電子轉(zhuǎn)移，阻礙了能量的(ATP)生成。魚藤酮作為殺蟲劑，是胃毒劑，通過昆蟲的攝入才能起作用。此外，魚藤酮的降解非常快，但持效期比除蟲菊酯長，在空氣和日光中為3～4 d。在近20年魚藤酮商業(yè)化用于有機(jī)農(nóng)業(yè)，然而，在近年，一些研究表明急性暴露于大鼠，可產(chǎn)生相似于帕金森的大腦損傷，這使有關(guān)許多天然產(chǎn)品使用的生物安全標(biāo)準(zhǔn)的建立減慢了。

另一次生化合物類別印楝素是檸檬苦素類物。其分子機(jī)構(gòu)復(fù)雜，作用譜廣，對550種昆蟲有生物活性，主要為鞘翅目(甲殼蟲、象甲)、網(wǎng)翅目(蜚蠊)、雙翅目(蠅)、半翅目(臭蟲)、同翅目(蚜蟲、蜂和螞蟻)、等翅目(白蟻)、鱗翅目(蛾類)、直翅目(蝗蟲)、隱翅目(蚤)和纓尾目(薊馬)。此物質(zhì)根據(jù)印楝樹命名，在印度幾個(gè)世紀(jì)用于抗菌劑和殺蟲劑。

商業(yè)印楝素為胃毒劑，但高劑量使用時(shí)，也常會(huì)有觸殺毒性。報(bào)道直接用于地面或注射入植物莖桿，也有內(nèi)吸作用。不過，印楝素作用特性會(huì)根據(jù)昆蟲的發(fā)育階段、季節(jié)和天氣條件的不同發(fā)生變化。在暴露后，印楝素可能立即抑制昆蟲的食欲，以及具有內(nèi)吸中毒和抑制蛻皮活性；也可延遲甚至阻礙昆蟲胚后發(fā)育，出現(xiàn)產(chǎn)卵缺陷，不育，抑制酶和幾丁質(zhì)合成。目前，有2類商業(yè)化的植物源農(nóng)藥印楝素：冷壓種子直接得到的油對軟體昆蟲有效；具有較高活性的用水醇提取的種子提取物，三萜類印楝素A為活性物質(zhì)。印楝素有許多類似物，而印楝素A和其他少量的化合物的復(fù)雜混合物共同起作用，且難以提取。雖然對哺乳動(dòng)物(LD50＞5 000 mg/kg)、魚和傳粉昆蟲無毒，印楝素對天敵的影響變化很大，需要特別注意。一些田間試驗(yàn)表明印楝素在日光照射下持效期約20 h，對于某些作物，印楝素可能具有內(nèi)吸作用，在田間的持效期增加。

由于詳盡登記程序的豁免，原材料豐富且容易獲得，活性成分的成本相對低等原因，最近許多公司在商業(yè)開發(fā)精油殺蟲劑。精油是通過水蒸餾芳香植物葉片、花或果實(shí)獲得的一小部分物質(zhì)。精油一般是由50多種化合物(常見的化合物見圖2)組成的復(fù)雜混合物，可能含有單帖、倍半帖烯、乙醇、酮、醛和酚，通常約12個(gè)主要化合物的含量占90%。從結(jié)構(gòu)來看，帖烯常見的特征為其烴骨架，此結(jié)構(gòu)賦予了主要與蛋白失活和抑制酶活性的疏水性，典型的例子為乙酰膽堿酯酶。

精油防治昆蟲的活性直接與其化學(xué)成分有關(guān)，其次與作物種植和環(huán)境條件有關(guān)。這些情況使標(biāo)準(zhǔn)化大規(guī)模生產(chǎn)和實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)的再現(xiàn)性相當(dāng)難。然而在20世紀(jì)90年代人們對精油的興趣日益高漲，大量的試驗(yàn)表明其對許多害蟲具有熏蒸和觸殺活性。雖然天敵經(jīng)直接接觸對精油敏感，但捕食者和寄生者經(jīng)殘留接觸不會(huì)有中毒風(fēng)險(xiǎn)。

圖2 商業(yè)化殺蟲劑精油的最主要活性化合物的三維結(jié)構(gòu)

2 蛋白質(zhì)化合物

2.1 源于植物的殺蟲肽

2.1.1 環(huán)肽

對源于植物的殺蟲肽類物質(zhì)，人們對其中的環(huán)肽很是關(guān)注。這類頭尾相連的環(huán)肽在堇菜科、茜草科和葫蘆科植物中廣泛發(fā)現(xiàn)。根據(jù)環(huán)肽骨架的loop 5中順式脯氨酸模體的存在(M?bius)或缺少(bracelet),環(huán)肽被分為2類：即M?bius和bracelet。從結(jié)構(gòu)上看，環(huán)肽一般由27～37個(gè)氨基酸殘基形成扭曲的三鏈β折疊，環(huán)骨架和稱為半胱氨酸結(jié)(CCK)中的3個(gè)二硫鍵起穩(wěn)定作用(圖3A)。在半胱氨酸結(jié)中由Cys1-Cys4和Cys2-Cys5形成的二硫鍵以及相連的骨架片段，穩(wěn)定嵌入環(huán)，而第3個(gè)Cys3-Cys6二硫鍵穿過此環(huán)(圖3A)。此獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征不僅可用于區(qū)分環(huán)肽和從細(xì)菌、植物和動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的其他圓型蛋白，而且使其額外穩(wěn)定，不易被酶降解，不受溫度變化和化學(xué)物質(zhì)的影響。由于這些特性，已評估環(huán)肽的抗細(xì)菌、殺線蟲和殺蟲的生物功能。

害蟲防治受到極大的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)關(guān)注。為了增加作物的生產(chǎn)效力，已開發(fā)了多種防治害蟲的方法，其中包括環(huán)肽的應(yīng)用。Jennings等人研究表明kalata B1(茜草科耳草屬Oldenlandia affinis中含量最豐富的環(huán)肽之一)除了具有抗微生物活性，也能抑制危害番茄、玉米和煙草的鱗翅目害蟲——澳洲棉鈴蟲(Helicoverpa punctigera)幼蟲的生長和發(fā)育。他們發(fā)現(xiàn)用含有kalata B1人工飼料飼喂的50%幼蟲在處理后16 d死亡。此外，50%存活的幼蟲在1齡期發(fā)育受到抑制，而對照能正常發(fā)育到第5齡期。

圖3 A)從Oldenlandia affinis分離得到的環(huán)肽家族成員kalata B1的三維結(jié)構(gòu)和表面靜電勢(PDB編碼：1nb1)，箭頭指示為二硫鍵；B)從豌豆分離得到的PA1b的三維結(jié)構(gòu)(PDB編碼：1p8b)，表面電勢計(jì)算中標(biāo)出了參與PA1b疏水補(bǔ)丁形成的殘基(Phe10、Arg21、Ile23和Leu27)，用箭頭標(biāo)出了二硫鍵；C)從綠豆分離得到的防御素家族成員VrD1的三維結(jié)構(gòu)和表面電勢

1年后，Jennings等人評估了kalata B1和B2對棉花主要害蟲棉鈴蟲(Helicoverpa armigera)的生物活性。從O. affinis分離、純化得到Kalata B1和B2，二者的不同為5個(gè)氨基酸取代物不同，但都具有1個(gè)保守的折疊。以植物的濃度水平，把kalata B1和B2都加入人工飼料中。試驗(yàn)結(jié)果表明二者對棉鈴蟲幼蟲的致死率分別為20%和28%，幼蟲的體重分別為對照的1/3和1/4。

最近，Pinto等人從茜草科Palicourea rigida發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新穎的bracelet類成員，即parigidin-br1。評估了parigidin-br1對重要的甘蔗害蟲小蔗螟(Diatraea saccharalis)的殺蟲特性，結(jié)果表明以1 μM處理后15 d初孵幼蟲的死亡率為60%，與對照相比幼蟲體中減少46%。有趣的是，Pinto等人也發(fā)現(xiàn)paridigin-br1以劑量依賴式(1、5、10 μM)抑制常危害玉米和棉花的鱗翅目害蟲草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)的昆蟲細(xì)胞系(SF-9)，這表明環(huán)肽對昆蟲具有離體和活體活性。

2.1.2 豌豆白蛋白1b(PA1b)

除了環(huán)肽外，抑制劑半胱氨酸結(jié)(inhibitory cysteineknot，ICK)家族的一個(gè)成員，豌豆白蛋白1b主要對米象(Sitophilus oryzae)、谷象(Sitophilus granarius)和玉米象(Sitophylus zeamays)具有殺蟲活性，也引起人們的關(guān)注。PA1b從豆科植物(例如豌豆)種子中提取，為1個(gè)含有37個(gè)氨基酸殘基的富含半胱氨酸的肽，由PA1基因編碼，翻譯后修飾產(chǎn)生2個(gè)成熟的肽PA1a(6 kDa)和PA1b(3.8 kDa)。有趣的是，對豌豆中編碼PA1b同源物的數(shù)個(gè)核苷酸序列研究表明此類殺蟲肽具有多基因特性。從結(jié)構(gòu)上看，PA1b為與彈性loops相連，3個(gè)二硫鍵穩(wěn)定的三鏈反向平行β-折疊(圖3B)。和環(huán)肽一樣，在不考慮其環(huán)骨架的情況下，此結(jié)構(gòu)排列也賦予PA1b耐酶降解性和熱穩(wěn)定性，此特性支持PA1b是目前所知的很少的經(jīng)口活性肽之一。除了knottin折疊，PA1b表面具有靜電性和兩親性(圖3B)，與來自漏斗網(wǎng)蜘蛛(Hadronyche infensa)的蜘蛛毒素ACTX-Hi:OB4219的相似，表明此物質(zhì)具有阻礙通道活性，分別來自中華鱟(Tachypleus tridentatus)和垂序商陸(Phytolacca americana)的抗微生物和抗真菌的蛋白tachystatin A和PAFP-S也具有此情況。

一些研究已評估了PA1b的殺蟲潛力，表明其具有殺滅米象、谷象和玉米象等谷物象甲和尖音庫蚊(Clulex pipiens)和埃及伊蚊(Aedes aegyptii)等人類疾病傳播媒介的作用。另一方面，好像PA1b對棉夜蛾(Spodotera littoralis)和歐洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)等其他農(nóng)藝重要毛蟲沒有活性，表明PA1b的毒性活性和昆蟲科沒有相關(guān)性。為了弄清PA1b的作用機(jī)制，da Silva等人評估了取代單個(gè)殘基的影響和PA1b對敏感和抗性米象品系以及SF9昆蟲細(xì)胞的活性。在此研究中，得到13個(gè)PA1b突變體，其中與PA1b的兩親性/靜電性(Phe10、Arg21、Ile23和Leu27)有關(guān)的殘基被丙氨酸取代。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)受體結(jié)合和殺蟲活性與PA1b一面的理化特性的保持有本質(zhì)的相關(guān)性，對PA1b表面暴露的疏水補(bǔ)丁(hydrophobic patch)修飾導(dǎo)致離體和活體殺蟲活性的顯著下降或喪失。也好像即使生物活性減少或沒有，缺少Phe10、Arg21、Ile2和Leu27的突變體能保持野生型PA1b折疊和對降解有耐受性，再一次說明疏水補(bǔ)丁對PA1b殺蟲活性的重要性。主要通過化學(xué)分析和對這些肽的離體折疊研究了PA1b突變體和異構(gòu)體。然而，最近的研究表明通過農(nóng)桿菌滲入法(Agroinfiltration)PA1b和其類似物能夠在本氏煙中異源表達(dá)，且能以最大量產(chǎn)生8 d。此策略已能使生物活性PA1b異構(gòu)體成功大量表達(dá)，表明PA1b在農(nóng)用工業(yè)可有多種用途。

2.1.3 防御素

除了上面提到的CCK和ICK殺蟲肽外，已知的γ-硫堇蛋白防御素為富半胱氨酸家族，由45～54個(gè)氨基酸組成的堿性肽。已確定豌豆、蘿卜和大麥等一些植物組織中的此家族的成員。已有文獻(xiàn)詳盡地介紹了防御素的三維結(jié)構(gòu)，除了PhD1外，其他防御素的CSαβ模體中含有1個(gè)α-螺旋和被4個(gè)二硫鍵穩(wěn)定的三鏈反平行β-折疊，一共有5個(gè)二硫鍵。除了二硫鍵中的8個(gè)高度保守的半胱氨酸殘基外，防御素家族成員也共有其他重要?dú)埢?，包括Gly13、Gly34和Glu29，以及11位的1個(gè)芳香族殘基。此外，這些保守殘基側(cè)面區(qū)域可能變化大，這可能是防御素呈現(xiàn)多種生物活性的原因。如已發(fā)現(xiàn)的抗細(xì)菌、抗真菌、殺蟲，抑制α-淀粉酶和蛋白酶的活性。

Chen等人報(bào)道了對綠豆象(Callosobruchus chinensis)有殺蟲活性的植物防御素。在此研究中他從抗豆象的綠豆中分離和過度表達(dá)(不同體系)了編碼新穎防御素的cDNA，命名為VrCRP。評估了含有不同量VrCRP的人工種子抑制綠豆象成蟲出現(xiàn)的活性，結(jié)果，含有0.2% VrCRP的種子徹底阻礙了豆象的發(fā)育。數(shù)年后，此研究團(tuán)隊(duì)也報(bào)道了此肽的溶液結(jié)構(gòu)，除了含有半胱氨酸穩(wěn)定的αβ模體，也具有1個(gè)不尋常的310螺旋，此結(jié)構(gòu)可能是由于位置23的精氨酸被保守的谷氨酸取代導(dǎo)致的Thr10位移誘導(dǎo)產(chǎn)生。此外，Chen等人也提出來自綠豆的VrD1通過抑制昆蟲中腸的多糖水解酶而有殺蟲活性，而β2和β3間的loop可能是其結(jié)合位點(diǎn)(圖4)。最近，在轉(zhuǎn)基因作物領(lǐng)域，Choi等人提議在水稻體內(nèi)表達(dá)來自蕪菁(Brassica rapa)的植物防御素BrD1以賦予水稻抗褐飛虱(Nilaparvata lugens)的能力。在生測中發(fā)現(xiàn)，表達(dá)BrD1的轉(zhuǎn)基因水稻品系在接種褐飛虱后5 d內(nèi)能成功地降低若蟲的成活率，與野生敏感對照相比致死率為約78.6%～95.7%。這些數(shù)據(jù)清晰地表明植物防御素在抗蟲作物的開發(fā)中會(huì)有很好的前景。

2.1.4 Jaburetox-2Ec：來源于刀豆(CanavaIia ensiformis)的不尋常的殺蟲肽

除了以上提及的肽類，在此部分介紹從刀豆中的脲酶同工酶——刀豆毒素衍生而來的不尋常的肽jaburetox-2Ec的殺蟲活性。研究表明在將刀豆毒素飼喂于產(chǎn)生組織蛋白酶的害蟲秘魯皮蠹(Dysdercus peruvianus)和四紋豆象(Callosobruchus maculatus)試驗(yàn)中，此物質(zhì)是有效的殺蟲毒性蛋白。然而，此殺蟲活性是刀豆毒素被昆蟲組織蛋白酶水解產(chǎn)生10 kDa殺蟲肽pepcanatox所致。Mulinari等人介紹了在異源體系(大腸桿菌)產(chǎn)生相當(dāng)于pepcanatoxde的重組肽jaburetox-2Ec的方法。他們研究表明用含有0.01%(w/w)純jaburetox-2Ec的棉花種子飼喂秘魯皮蠹3齡幼蟲11 d，幼蟲全部死亡。也報(bào)道用含有16.3 μM jaburetox-2Ec的飼料飼喂草地貪夜蛾3齡幼蟲2 d，蟲體比對照小20%。此外，草地貪夜蛾幼蟲攝取47 μM jaburetox-2Ec后全部死亡。從結(jié)構(gòu)看，用從頭建模預(yù)測jaburetox-2Ec具有1個(gè)β-發(fā)夾的三維理論模型，成孔肽以及神經(jīng)毒素也好像具有此結(jié)構(gòu)。

圖4 昆蟲中腸中主要作為拒食劑干擾營養(yǎng)吸收的蛋白質(zhì)化合物的作用機(jī)制

2.2 殺蟲肽酶抑制劑

在蛋白質(zhì)化合物中，植物肽酶抑制劑(PIs)是在新栽培品種中異源表達(dá)的一類有發(fā)展前景的物質(zhì)，是應(yīng)對昆蟲和植物病原體對當(dāng)前農(nóng)藥抗性不斷增加的可靠的替代方法。它們的結(jié)構(gòu)特性決定其主要被1個(gè)基因激活，因此進(jìn)行了PI在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)的多個(gè)研究，以增加作物的抗性。

PIs普遍存在于植物的塊莖和豆科植物的種子中，但也在數(shù)種植物的不同組織中發(fā)現(xiàn)。雖然還沒有完全弄明白其生理作用，但有證據(jù)表明植物以貯存蛋白(一般在貯存組織中達(dá)10%)積累PI，PI也被用于應(yīng)對機(jī)械性受傷和機(jī)會(huì)性侵染。另一方面，PI通過抑制昆蟲中腸中的蛋白酶活性，減少昆蟲生長和發(fā)育必須的氨基酸的量，使植物防御植食性害蟲的危害。分子量為3～25 kDa的PI能夠與靶標(biāo)蛋白酶形成穩(wěn)定的復(fù)合體，阻礙酶到達(dá)活性位點(diǎn)。文獻(xiàn)介紹PI能夠作用于4類蛋白酶：絲氨酸、半胱氨酸、金屬蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶，因此，在發(fā)現(xiàn)有的抑制劑同屬于多個(gè)類別之前，一直根據(jù)酶抑制劑的催化位點(diǎn)的化學(xué)性質(zhì)對其分類。根據(jù)Rawling等人的提議和更新到2007年的植物PI數(shù)據(jù)庫，至少有16個(gè)植物蛋白酶抑制劑類別。其中，Kunitz和Bowman-Birk類別被研究最多，用于防治農(nóng)業(yè)昆蟲和病原菌。表2列出了重要作物中發(fā)現(xiàn)的類別。

表2 根據(jù)重要作物中序列的相似性對蛋白酶抑制劑家族進(jìn)行分類

續(xù)表

在暴露較多的圍繞P1殘基的loop中的每一抑制域有一反應(yīng)位點(diǎn)肽鍵，根據(jù)位點(diǎn)的數(shù)量，可分為簡單抑制劑或復(fù)雜抑制劑，也即相應(yīng)地為同型或異型的；包括修飾的抑制劑，大部分抑制劑含有二硫鍵。除了半胱氨酸-PI和金屬蛋白酶抑制劑外，其他家族可能都含有絲氨酸蛋白酶和另一機(jī)械類(methanistic class)蛋白酶，即主要對絲氨酸蛋白酶有活性但也抑制胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和枯草桿菌蛋白酶的Kunitz類。

Kunitz類蛋白酶抑制劑是廣泛存在于不同植物家族的最大的蛋白酶抑制劑類別，但主要存在于豆科種子中。被純化和表征的第一個(gè)植物Kunitz類抑制劑為1945年從大豆獲得的胰蛋白酶抑制劑(大豆胰蛋白酶抑制劑-STI Kunitz)。此家族的成員具有1個(gè)典型的構(gòu)型，能夠與靶標(biāo)酶形成非常牢固的復(fù)合體。絲氨酸、半胱氨酸和天冬氨酸蛋白酶主要被Kunitz類抑制。植物kunitz類抑制劑含有約180個(gè)氨基酸殘基，分子量為18～22 kDa，結(jié)構(gòu)為1個(gè)多肽鏈，也稱為“單頭”(single headed)；半胱氨酸殘基含量低(一般4個(gè)，Cys39-Cys86和Cys136-Cys145)，參與了1個(gè)或2個(gè)二硫鍵的形成。一般，Kunitz類抑制劑只有一個(gè)反應(yīng)位點(diǎn)，通常為賴氨酸或精氨酸，但有些抑制劑可能含有另一獨(dú)立反應(yīng)位點(diǎn)。Kunitz類對不同蛋白水解酶有活性，但通常為胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶等絲氨酸蛋白酶，因此被認(rèn)為對未來植物防御昆蟲方面具有很重要的作用。簡而言之，昆蟲攝入此類蛋白酶抑制劑后，中腸中的蛋白酶被完全抑制，使昆蟲對基本氨基酸的吸收下降，直到饑餓而死。最近，許多研究認(rèn)為表達(dá)Kunitz抑制劑的基因的轉(zhuǎn)基因植物對害蟲和病原菌有防御性。

1946年D.E. Bowman從大豆種子中分離純化得到第一個(gè)Bowman-Birk抑制劑(BBI)，1963年Y. Birk對其進(jìn)行了表征。在數(shù)種單子葉和雙子葉植物中可發(fā)現(xiàn)此類物質(zhì)，它們主要貯存在種子中，但也會(huì)因傷誘導(dǎo)在葉片中產(chǎn)生。BBI類是富含半胱氨酸的蛋白質(zhì)，為含有2個(gè)反應(yīng)位點(diǎn)(雙頭抑制劑)的小分子多肽(8～9 kDa)，2個(gè)反應(yīng)位點(diǎn)獨(dú)立但同時(shí)與同源蛋白酶反應(yīng)。通常，這2個(gè)同源域由1個(gè)具有胰蛋白酶反應(yīng)點(diǎn)的N-末端和與胰凝乳蛋白酶反應(yīng)的C-末端組成，由7個(gè)保守的二硫鍵穩(wěn)定。核磁共振(NMR)和x射線晶體的研究表明雙頭BBI的2個(gè)反應(yīng)點(diǎn)位于分子的兩端(圖5B)。與胰蛋白的S1點(diǎn)相應(yīng)的P1殘基為精氨酸或賴氨酸，負(fù)責(zé)識別活性位點(diǎn)，并與其結(jié)合。疏水亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和絡(luò)氨酸是與胰凝乳蛋白酶位點(diǎn)結(jié)合的臨近殘基，而丙氨酸僅對彈性蛋白酶位點(diǎn)有選擇性。此外，BBI家族含有一個(gè)獨(dú)特的與二硫鍵連接的含有9個(gè)殘基的loop，以類底物方式與蛋白酶結(jié)合。

圖5 (A)來源于大豆的Kunitz型抑制劑(PDB編碼：lavw)，(B)來自于豇豆的Bowman-Birk抑制劑(3ru4)，(C)來自于茄子的防御素(5cad)，(D)來自于雪花蓮的甘露糖凝集素(PDB編碼：lniv)

對于其他類PPI，用于轉(zhuǎn)基因作物提高作物抗植食性害物要更好于直接用于田間。一些研究已表征了編碼Bowman-Birk類蛋白酶抑制劑的基因，目前正在進(jìn)行一些大田試驗(yàn)來評估過表達(dá)此PI增強(qiáng)作物抗昆蟲的價(jià)值。

2.3 殺蟲劑——和幾丁質(zhì)結(jié)合的豌豆球蛋白(7S貯存蛋白)

在20世紀(jì)70年代熱帶農(nóng)業(yè)國際研究所確定了對四紋豆象具有高度抗性的第一個(gè)基因型豇豆(栽培品種TVu 2027)，并以此栽培品種培育了數(shù)個(gè)其他的抗性品系。起初，對四紋豆象的抗性被認(rèn)為與豇豆中表達(dá)的高水平胰蛋白酶抑制劑有關(guān)。然而，隨后Macedo等人研究表明不同豌豆球蛋白的存在是抗性產(chǎn)生的最可能原因。自此，發(fā)現(xiàn)豌豆球蛋白具有多種生物特性，如抗微生物活性、結(jié)合蔗糖活性和殺蟲活性。

一般，豌豆球蛋白被描述為不同的7S貯存球蛋白(約20.1～94 kDa，多亞基物)，被不同程度糖基化的多基因家族編碼，通常在豆科植物種子和非豆科植物中發(fā)現(xiàn)。已獲得一些豌豆球蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，報(bào)道主要為被非共價(jià)鍵相互作用穩(wěn)定的三聚體構(gòu)象。最近，也報(bào)道茄子(Solanum melongena)中三聚體豌豆球蛋白的每個(gè)單體由疏水和陰離子配體結(jié)合口袋2個(gè)區(qū)域組成(圖5C)。此外，研究已表明這些糖蛋白對水解具有耐受性，說明對幾丁質(zhì)有很強(qiáng)的親合力，已知幾丁質(zhì)在數(shù)種昆蟲的圍食膜形成中具有重要作用(圖4)(PM)。在此種情形下，已報(bào)道豌豆球蛋白與幾丁質(zhì)結(jié)合特性影響了昆蟲圍食膜的滲透性和結(jié)構(gòu)，而可能導(dǎo)致圍食膜的生理機(jī)能的改變，因此直接影響幼蟲的發(fā)育和存活。此外，由于豌豆球蛋白與含幾丁質(zhì)的表面的特異性結(jié)合，也抑制具有幾丁質(zhì)細(xì)胞壁的酵母細(xì)胞。然而，有趣的是，豆象甲蟲(例如四紋豆象)不具有真正意義上的PM，但以圍食膜凝膠代之。在此種情況下，研究已表明7S貯存豌豆球蛋白可能被中腸上皮細(xì)胞吸收，近而在血淋巴中以三聚體形式流動(dòng)，也達(dá)到內(nèi)臟器官，包括脂肪體和馬氏管，導(dǎo)致豆象甲蟲幼蟲生理不穩(wěn)定。說來奇怪，最近，Alexandre等人發(fā)現(xiàn)四紋豆象雄雌蟲脂肪體中的豌豆球蛋白能夠部分地水解為數(shù)個(gè)片段，最后沉積在這些昆蟲的卵中，成為防御性武器，因此提高四紋豆象幼蟲后代的存活率。

評估了7S貯存豌豆球蛋白對墨西哥豆象(Zabrotes subfasciatus)、小蔗螟、四紋豆象、地中海實(shí)蠅(Ceratitis capitata)和印度谷螟(Plodia interpunctella)等許多昆蟲的幼蟲和成蟲的活性。Moura等人研究表明從青皮象耳豆(Enterolobium contortisiliquum)種子(EcV)中分離得到的豌豆球蛋白混入飼料中飼喂四紋豆象和墨西哥豆象幼蟲，LD50分別為1.1和0.43%(w:w)；而使四紋豆象和墨西哥豆象幼蟲體重減少50%的有效劑量(ED50)分別為1.03和0.65%(w:w)。此外，1年后他們報(bào)道從Erythrina velutina種子分離的豌豆球蛋白，稱為EvV，對四紋豆象和墨西哥豆象的LD50分別為0.26和0.10%(%，w:w)，以及ED50分別為0.19和0.14%(w:w)。此外，發(fā)現(xiàn)處理12 h后，EvV不僅耐四紋豆象和墨西哥豆象幼蟲酶的水解，而且在施用24 h后，耐墨西哥豆象幼蟲酶的水解。在2個(gè)研究中EcV和EvV都為耐蛋白水解，能結(jié)合幾丁質(zhì)的蛋白質(zhì)，表明這些物質(zhì)可作為新穎的天然殺蟲劑，經(jīng)胃毒作用防治害蟲。

豌豆球蛋白除具有殺豆象活性，研究也表明來自豇豆的豌豆球蛋白能夠與小蔗螟幼蟲的圍食膜結(jié)合，用含有2%(w:w)豌豆球蛋白的人工飼料飼喂，與對照相比成蟲的出現(xiàn)量減少40%。相似地，Macedo等人報(bào)道用含有EvV的人工飼料飼喂地中海實(shí)蠅，LD50和ED50分別為0.14和0.12%(w:w)，這可能與幼蟲圍食膜中的EvV與幾丁質(zhì)結(jié)合特性和EvV在地中海實(shí)蠅消化道中對蛋白酶水解敏感性低有關(guān)。同時(shí)，他們研究發(fā)現(xiàn)把EvV加入人工飼料中飼喂對印度谷螟幼蟲的LD50(致死)和ED50(體重減少)分別為0.23和0.27%(w:w)。然而，在此種情況下，EvV對酶解敏感，能夠產(chǎn)生具有免疫活性和能夠結(jié)合到圍食膜基質(zhì)的數(shù)個(gè)片段，這表明EvV在鱗翅目昆蟲中腸中被分解后具有不同的作用。

2.4 殺蟲劑——與碳水化合物結(jié)合的植物凝集素

植物凝集素，最初被稱為凝集素，由具有至少1個(gè)可逆性結(jié)合甘露糖和N-乙酰氨基葡萄糖(幾丁質(zhì)-多聚物)等特異性單-和/或寡糖的非催化區(qū)域的各種各樣結(jié)合碳水化合物的蛋白質(zhì)組成。根據(jù)整體區(qū)域排列，植物凝集素被分為4個(gè)主要類別，部分凝集素(merolectins)：只有1個(gè)結(jié)合碳水化合物的區(qū)域；全凝集素(hololectins)：2個(gè)或多個(gè)具有相同的或高度同源的結(jié)構(gòu)的結(jié)合碳水化合物的區(qū)域；超凝集素(superlectin)：具有能夠識別結(jié)構(gòu)無關(guān)碳水化合物的2個(gè)或多個(gè)結(jié)合碳水化合物區(qū)域；嵌合凝集素(chimerolectins)：具有1個(gè)或多個(gè)結(jié)合碳水化合物區(qū)域，這些區(qū)域與具有額外生物活性的另一區(qū)域有關(guān)。此外，隨著分子生物學(xué)和生物化學(xué)的發(fā)展，在區(qū)域排列知識中增加了序列相似性和進(jìn)化關(guān)系，由此目前把植物凝集素分為12個(gè)類別。從結(jié)構(gòu)上看，這些蛋白主要由與loops相連的反平行的β-折疊組成，含有一定的螺旋結(jié)構(gòu)(圖5D)。此外，可能發(fā)現(xiàn)被氫鍵、鹽和疏水相互作用穩(wěn)定的二聚和/或四聚體構(gòu)型。對于其生物學(xué)特性，研究表明植物凝集素對鞘翅目、雙翅目、鱗翅目和同翅目等害蟲具有很好的殺蟲活性。對于其作用機(jī)制，已有人提出植物凝集素可能與昆蟲中腸圍食膜相互作用，抑制營養(yǎng)的吸收；結(jié)合到中腸上皮細(xì)胞上的糖蛋白上，破壞組織(圖4)；干擾昆蟲基因的表達(dá)；與靶標(biāo)昆蟲刷狀緣膜囊(brush border membrane vesicles, BBMV)受體蛋白相互作用；與昆蟲口器區(qū)域的感覺感受器上的碳水化合物結(jié)合，破壞膜的完整性，影響昆蟲檢測食物的能力。此外，植物凝集素對蛋白酶的降解有高抗作用。

Macedo等人已從不同植物品種開發(fā)了具有殺蟲活性的凝集素，能夠防治經(jīng)濟(jì)重要性害蟲。在其研究中，源于欒樹(Koelreuteria paniculata，KpLec)種子和羊蹄甲(Bauhinia monandra，BmoLL)葉的凝集素加入人工飼料飼喂，對四紋豆象的LD50分別為0.7和0.3%(w:w)。然而，只有KpLec對鱗翅目地中海粉螟有活性，LD50為0.65%(w:w)。相似地，Coelho等人報(bào)道來自Annona coriacea (ACLEC)的凝集素混入人工飼料飼喂對地中海粉螟幼蟲的LD50為1.5%(w:w)。除了能降低昆蟲幼蟲的存活率，Macedo等人也研究表明Talisi esculenta凝集素(TEL)的殺蟲活性受不同碳水化合物的調(diào)節(jié)，加入甘露糖后其對四紋豆象的活性完全消失，表明碳水化合物-凝集素與昆蟲消化道中的復(fù)合糖相互作用。雪花蓮凝集素(Galanthus nivalis: agglutinin GNA)等其他植物凝集素被昆蟲攝入后能夠與中腸上皮細(xì)胞相互作用，隨后進(jìn)入血淋巴，由此可對這些分子進(jìn)行新的生化技術(shù)應(yīng)用。

有趣的是，為了把這些蛋白質(zhì)用作其他殺蟲分子的載體，已開發(fā)了凝集素與簡單和/或復(fù)雜碳水化合物反向結(jié)合的能力。Fitches等人研究了GNA攜帶和傳遞殺蟲螨毒液神經(jīng)毒素1(SFI1)到番茄蛾(Lacanobia oleracea)幼蟲的血淋巴中的潛力。結(jié)果，他們發(fā)現(xiàn)雖然GNA和SFI1單獨(dú)對番茄蛾幼蟲沒有急性毒性，但飼喂含有2.5%(w:w)SFI1/GNA結(jié)合體的人工飼料6 d后，番茄蛾1齡幼蟲的死亡率為100%。此外，此結(jié)合體也引起約90%的第4和5齡幼蟲死亡，且隨著劑量增加，死亡率增加。數(shù)年后，他們報(bào)道SFI1/GNA結(jié)合體對煙蚜(Myzus persicae)和褐飛虱(Nilaparvata lugens)有毒。此發(fā)現(xiàn)清楚地表明蛋白質(zhì)結(jié)合體策略可作為替代性方法用于作物保護(hù)，用植物凝集素作為載體把毒素傳遞到昆蟲體內(nèi)的靶標(biāo)點(diǎn)。

隨著當(dāng)前基因工程的發(fā)展，為提高作物的產(chǎn)量在作物體內(nèi)表達(dá)植物凝集素編碼序列已獲得關(guān)注。Dutta等人利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法在煙草中首次表達(dá)大蒜葉凝集素(ASAL)編碼序列。研究發(fā)現(xiàn)表達(dá)ASAL的轉(zhuǎn)基因煙草田中的煙蚜存活率約16%，而對照的約75%。Dutta等人發(fā)現(xiàn)與對照相比，表達(dá)ASAL的轉(zhuǎn)基因水稻處理的褐飛虱的存活率和繁殖率分別降為36%、32%，二點(diǎn)黑尾葉蟬(Nephotettix virescens)40.5%、29.5%。有趣的是，Bharathi等人通過穩(wěn)定表達(dá)ASAL和FNA的轉(zhuǎn)基因水稻間的雜交，逐漸增加水稻中2個(gè)凝集素基因(ASAL和GNA)，來進(jìn)一步研究植物轉(zhuǎn)化的概念。在此研究中，他們發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步雜交的水稻品系被主要刺吸式害蟲危害的程度要輕于其母本轉(zhuǎn)基因作物，因?yàn)槠淠芨行У亟档屠ハx的存活率、取食能力和繁殖力。總的來說，有關(guān)植物凝集素的所有這些發(fā)現(xiàn)表明這些分子在防治害蟲方面有巨大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

3 新一代植物源殺蟲劑的挑戰(zhàn)和發(fā)展前景

雖然文獻(xiàn)對數(shù)種植物次生化合物的殺蟲活性進(jìn)行了較廣泛的介紹，但其中只有一些物質(zhì)被批準(zhǔn)使用和商業(yè)化，且主要用于有機(jī)農(nóng)業(yè)。從商業(yè)化角度看，此類植物藥劑由于缺乏商業(yè)化所需的生物活性和防效的標(biāo)準(zhǔn)和技術(shù)而受到了限制。植物化學(xué)物質(zhì)的固有特性(作用慢、防效變化大、持效期短)和沒有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)是其農(nóng)業(yè)市場進(jìn)入率低的主要原因。而蛋白類化合物比次生代謝物在環(huán)境中更穩(wěn)定和持效期更長，可利用納米粒子工程化技術(shù)優(yōu)化而更好地被昆蟲攝入和接觸。然而，依靠種植作物來專門提取殺蟲劑的道路還很遙遠(yuǎn)，因?yàn)檫@需要在土地和技術(shù)上進(jìn)行巨大的投資。如果能以低成本、高效率容易的合成，特別是預(yù)測和合理設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)以增加其生物活性，就可獲得大量的此類物質(zhì)。

轉(zhuǎn)基因表達(dá)蛋白類化合物可能是增加植物防御能力最可靠的方法。蛋白質(zhì)化合物由于結(jié)構(gòu)特性，需要把其編碼基因(1個(gè)基因)轉(zhuǎn)入目標(biāo)植物，在此植物組成型啟動(dòng)子的作用下表達(dá)。此外，植物基因組的轉(zhuǎn)化作為產(chǎn)生異源蛋白、以植物為離體生物工廠、優(yōu)化化合物的產(chǎn)出和使可能的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)最低化的方式具有很大吸引力。基因工程的另一優(yōu)勢就是重組基因，作為防御機(jī)制直接在作物體內(nèi)表達(dá)的可能性。在近年科學(xué)家在基因編碼蛋白化合物，把這些基因轉(zhuǎn)入作物使作物對害物具有防御能力方面進(jìn)行了許多研究。最近，CRISPR系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)和Cas9用作易重組核酸酶，組成了依靠序列特異性雙鏈斷裂誘導(dǎo)的基因組工程。自此，研究焦點(diǎn)變?yōu)檎T導(dǎo)許多植物發(fā)生NHEJ-介導(dǎo)的遺傳突變，這通過把表達(dá)核糖酶的DNA轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞獲得，通過隔離不含有轉(zhuǎn)基因DNA的后代而消除。此新工具已改變分子生物學(xué)，開辟了提高植物防御能力的新領(lǐng)域。

從長遠(yuǎn)來看，昆蟲抗性可能降低此技術(shù)的效果。且殺蟲劑越有效，選擇壓力越大，常導(dǎo)致抗性的快速進(jìn)化。這與殺蟲劑為化學(xué)物還是轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)的物質(zhì)(plant-incorporated protectant)無關(guān)。生物進(jìn)化和獲得抗性是發(fā)生在許多環(huán)境中的進(jìn)化機(jī)制，并不總是與轉(zhuǎn)基因生物的出現(xiàn)有關(guān)。

大多數(shù)的消費(fèi)者認(rèn)為植物源產(chǎn)品是用于有機(jī)農(nóng)業(yè)，然而，本文認(rèn)為植物源物主要是植物產(chǎn)生，但可以多種方式開發(fā)，能夠用于昆蟲的防治和大規(guī)模農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。