三氟甲基芳酰胺類化合物的合成及其對(duì)光合作用電子傳遞影響的理論研究

楊關(guān)天，張 曉 編譯

(華東理工大學(xué) 藥學(xué)院，上海 200237)

在光合作用中，一系列的電子傳遞反應(yīng)使得高等植物、藍(lán)藻和某些細(xì)菌可以將光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能。農(nóng)化公司基于部分化合物能夠干擾光合電子傳遞這一特性，開(kāi)發(fā)了一系列除草劑來(lái)控制雜草(圖1)。光合抑制劑的作用主要是阻斷電子在光系統(tǒng)II中的傳遞，或者分流光系統(tǒng)I中的電子。

作物具有解毒酶，能夠在除草劑應(yīng)用的情況下生存。然而，除草劑對(duì)雜草有高的選擇壓，在使用后幾年內(nèi)，雜草一般會(huì)快速產(chǎn)生抗性，大多數(shù)除草劑的商業(yè)壽命會(huì)大大地縮短。因此持續(xù)需要發(fā)現(xiàn)用于管理雜草抗性的新的具有活性的化合物骨架。

圖1 抑制光合作用的商品化除草劑

如圖1所示，多種光合作用抑制劑都有酰胺結(jié)構(gòu)。事實(shí)上，該類官能團(tuán)或氨基甲酸酯基團(tuán)是作用于光合作用器除草劑常見(jiàn)的結(jié)構(gòu)特征。在本文中介紹了一系列三氟甲基芳酰胺類化合物的合成，研究了在離體條件下對(duì)光合作用電子傳遞鏈的抑制和活體條件下對(duì)藍(lán)藻菌株的生長(zhǎng)抑制作用。另外，還對(duì)芳酰胺進(jìn)行了理論研究(分子建模和構(gòu)-效關(guān)系)，并將研究結(jié)果與試驗(yàn)研究、化學(xué)知識(shí)和相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行了比較。

1 材料與方法

1.1 通用方法

分析純1-氟-2-硝基-4-三氟甲基苯、哌啶、嗎啉、環(huán)己胺、二乙胺、4-溴苯胺、吡咯烷、異煙酰氯鹽酸鹽、煙酰氯鹽酸鹽、2-氯吡啶-3-羧酸和苯甲酰氯均購(gòu)自Sigma-Aldrich (St.Louis，MO，USA)，使用時(shí)不需要進(jìn)一步純化。無(wú)水氯化錫和三乙胺均購(gòu)自Vetec(巴西里約熱內(nèi)盧)并按標(biāo)準(zhǔn)使用。以CDCl3和CD3OD作為氘代試劑，化合物的1H NMR和13C NMR的核磁圖譜由Varian Mercury 300儀器(Varian，Palo Alto，CA，USA)分別在300 MHz和75 MHz下表征。使用具有高性能金剛石ATR附件的Varian 660紅外光譜儀，掃描范圍4 000～500 cm－1，以及Perkin Elmer Paragon 1000傅立葉轉(zhuǎn)換紅外分光光度計(jì)(Perkin Elmer do Brasil Ltda，S?oPaulo，Brazil)，用溴化鉀做基線，掃描范圍600～4 000 cm－1，測(cè)定并記錄紅外數(shù)據(jù)。用MQAPF-301熔點(diǎn)儀(Microquimica，Campinas，Brazil)測(cè)定化合物熔點(diǎn)。在覆蓋有60GF254硅膠的TLC板上進(jìn)行薄層色譜分析。柱色譜使用60～230目硅膠作為固定相。

1.2 合成

1.2.1 1-(2-硝基-4-(三氟甲基)苯基)哌啶(2)

將100 mL圓底燒瓶置于冰浴中，分別加入8.60 mL(88.2 mmol)哌啶、4.10 mL二甲基甲酰胺(DMF)和4.20 mL (28.7 mmol)1-氟-2-硝基-4-三氟甲基苯(1)。除去冰浴，將反應(yīng)液在室溫下磁力攪拌1.5 h。加入水，把反應(yīng)液移入分液漏斗中。乙酸乙酯(4×80 mL)萃取水相。合并有機(jī)相，將所得有機(jī)相用飽和食鹽水洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾并減壓濃縮。所得固體用甲醇重結(jié)晶。得到橙色固體2，收率91%(7.15 g，26.1 mmol)。

TLC Rf=0.40(乙酸乙酯-己烷16∶1，體積比)。熔點(diǎn)：50.1～50.7 ℃。IR(ATR，cm-1)ˉνmax：2938，2867，2827，1621，1560，1528，1493，1449，1386，1323，1297，1260，1233，1211，1149，1115，1080，1064，1021，974，929，906，882，856，832，789，760，724，678，629，528。1H NMR(300 MHz，CDCl3)δ：1.61-1.75(m，6H)，3.12(t，4H，J=5.3 Hz)，7.14(d，1H，J=8.7 Hz)，7.60(dd，1H，J=8.7 Hz和J=2.3 Hz)，8.03(d, 1H, J=2.3 Hz。13C NMR(75 MHz,CDCl3)δ：24.0，25.8，52.3，120.6，120.9(q，JC-F=34.1Hz)，123.7(q，JC-F=269.6 Hz)，124.6(q，JC-F=4.0 Hz)，130.1(q，JC-F=3.4 Hz)，139.8，148.8。HRMS(M+H+)：C12H14F3N2O2分子質(zhì)量的計(jì)算值：275.1007；實(shí)測(cè)值：275.0926。

硝基化合物3－7(圖2)的合成與化合物2的相似。

1.2.2 2-(哌啶-1-基)-5-(三氟甲基)苯胺(8)

將50 mL圓底燒瓶置于冰浴中，分別加入10.8 mL(129.6 mmol)濃鹽酸，6.71 g (35.4 mmol)氯化錫(II)，20.0 mL甲醇和1.50 g (5.47 mmol)1-(2-硝基-4-(三氟甲基)苯基)哌啶(2)。除去冰浴，在室溫下持續(xù)攪拌反應(yīng)液42 h。隨后向反應(yīng)液中加入氫氧化鈉溶液，約至pH 10。然后把反應(yīng)液轉(zhuǎn)入分液漏斗中。乙酸乙酯(4×80.0 mL)萃取。合并有機(jī)相，將所得有機(jī)相用飽和食鹽水洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾并減壓濃縮。濃縮物經(jīng)硅膠柱層析純化，用己烷-乙酸乙酯(11∶1，體積比)洗脫。得到白色固體8，收率78%(1.34 g，5.49 mmol)。

TLC Rf=0.48(己烷-乙酸乙酯11∶1，體積比)。熔點(diǎn)：50.0～50.5 ℃。IR(ATR，cm-1)ˉνmax：3452，3355，2950，2865，2805，1611，1589，1512，1469，1439，1379，1328，1288，1256，1227，1205，1160，1104，1064，936，892,860,810,745,722,663,643。1H NMR(300 MHz，CDCl3)δ：1.60-1.75(m，6H)，2.88(brs，4H)，4.11(brs，2H，NH2)，6.93-7.03(m，3H)。13C NMR(75 MHz，CDCl3)δ：24.4，26.8，52.4，111.5(q，JC-F=3.5 Hz)，115.5(q，JC-F=4.1 Hz)，119.7，124.7(q，JC-F=270.0 Hz)，126.1(q，JC-F=31.9 Hz)，141.7，143.4。HRMS(M+H+)：C12H16F3N2分子質(zhì)量的計(jì)算值：245.1266；實(shí)測(cè)值：245.1182。

由化合物3－7合成化合物9－13(圖3)的方法與制備化合物8的相似。

圖2 硝基化合物2－7的合成

1.2.3 N-(2-(哌啶-1-基)-5-(三氟甲基)苯基)異煙酰胺(14)

將25 mL圓底燒瓶置于冰浴中，分別加入0.629 g(3.389 mmol)異煙堿酰氯鹽酸鹽，0.800 mL三乙胺，8.00 mL二氯甲烷和0.400 g (1.64 mmol)2-(哌啶-1-基-5-(三氟甲基)苯胺(8)。除去冰浴，在室溫下攪拌反應(yīng)液3 h。然后，加入10. 0mL蒸餾水，并將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到分液漏斗中。水相用乙酸乙酯(4×30.0 mL)萃取。合并有機(jī)相，將所得有機(jī)相用飽和食鹽水洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾并減壓濃縮。濃縮物經(jīng)硅膠柱層析純化，用己烷-乙酸乙酯(3∶1，體積比)洗脫。用丙酮進(jìn)一步重結(jié)晶固體。得到白色固體化合物14，收率75%(430 mg；1.23 mmol)。

TLC Rf=0.13(己烷-乙酸乙酯3∶1，體積比)。熔點(diǎn)：95.6～96.7 ℃。IR(ATR，cm-1)vmax：3347，2945，2917，2811，1679，1611，1587，1556，1527，1455，1434，1380，1334，1308，1239，1165，1107，1093，1061，1022，915，895，878，839，826，751，728，681，662，644。1H NMR(300 MHz，CDCl3)δ：1.65-1.81(m，6H)，2.86(t，4H，J=5.1 Hz)，7.28(d，1H，J=8.4 Hz)，7.37(dd，1H，J=8.4 Hz和J=1.8Hz)，7.76(dd，2H，J=4.5 Hz和J=1.5 Hz)，8.83-8.85(m，3H)，9.55(s，1H，NH)。13C NMR(75 MHz，CDCl3)δ：24.0，27.1，53.8，116.6，120.8，121.1，121.6(q，JC-F=3.7 Hz)，124.2(q，JC-F=270.5 Hz)，127.5，(q，JC-F=32.3 Hz)，133.4，141.8，145.9，151.1，163.0。HRMS(M+H+)：C18H19F3N3O分子質(zhì)量的計(jì)算值：350.1480；實(shí)測(cè)值：350.1420。

三氟甲基芳酰胺15－36(圖4)的合成方法與化合物14的相似。

圖3 胺8－13的合成

圖4 三氟甲基芳酰胺化合物14－36的制備

1.3 生物測(cè)定

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的方法(稍作調(diào)整)，從市售菠菜葉(Spinacia oleracea L.)中分離具有光合活性的類囊體膜。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，將20 g植物材料懸浮于含有10 mmol/L NaCl、5 mmol/L MgCl2和0.4 mol/L蔗糖的100 mL預(yù)冷的20 mmol/L Tricine-NaOH緩沖液(pH=8.0)中，并在勻漿器中以最大速度勻漿30 s。用手術(shù)紗布過(guò)濾勻漿液，于4℃，以500×g轉(zhuǎn)速離心濾液1 min；再以1500×g轉(zhuǎn)速離心所得上清液10 min。將沉淀的葉綠體懸浮在無(wú)蔗糖緩沖液中進(jìn)行滲透性溶脹，之后立即用蔗糖緩沖液以1∶1稀釋，并在冰中和黑暗條件下保存以備使用。用80%(體積比)丙酮稀釋后，根據(jù)Arnon公式計(jì)算葉綠素含量。通過(guò)光驅(qū)動(dòng)鐵氰化物還原來(lái)測(cè)量光合電子傳遞的基礎(chǔ)速率。將相當(dāng)于5 μg葉綠素等分的類囊體膜試樣在24 ℃下加入含有10 mmol/LNaCl、5 mmol/L MgCl2、0.2 mol/L蔗糖和2 mmol/L K3[Fe(CN)6]的20 mmol/L Tricine-NaOH緩沖液(pH=8.0)中。暴露于[800 μmol/(m2·s)]飽和光下，20 min內(nèi)每隔1 min測(cè)量1次鐵氰化物還原速率，設(shè)置空白對(duì)照，檢測(cè)波長(zhǎng)420 nm。取曲線[摩爾消光系數(shù)1 000 (mol L-1)-1cm-1]的線性部分計(jì)算活性。將三氟甲基芳酰胺類化合物14－36溶于DMSO配制成20 mmol/L的溶液，然后用DMSO稀釋為100倍的工作液，把稀釋溶液加入到反應(yīng)混合液中，使這些化合物的濃度為0.5～100 μmol/L，進(jìn)行至少4次平行試驗(yàn)測(cè)定化合物對(duì)光合電子傳遞的影響，結(jié)果以處理組和對(duì)照組(相同體積的溶劑)的百分比表示。在其他條件不變，加入0.5 mmol/L ADP和2 mmol/L K2HPO4后研究磷酸化電子流情況。為了研究解偶聯(lián)活性，在向基礎(chǔ)反應(yīng)混合物中加入2 mmol/L NH4Cl之后，每隔30 s測(cè)量1次鐵氰化物還原物，一共測(cè)10 min。試驗(yàn)報(bào)告值是所有重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。用Windows的Prism 6版本6.03(GraphPad Software，LaJolla，CA，USA)軟件，通過(guò)非線性回歸分析計(jì)算50%抑制濃度(IC50)及置信區(qū)間。

按文獻(xiàn)報(bào)道在(24±1) ℃、14 h[150 μmol/(m2·s) PAR]光照和10 h黑暗中培養(yǎng)細(xì)長(zhǎng)聚球藻(Synechococcus elongates)菌株P(guān)CC6301。然后，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期晚期的細(xì)胞進(jìn)行4 000×g轉(zhuǎn)速離心沉降5 min，接種到96孔板，每孔0.2 mL，使葉綠素初始濃度約為1.0 mg/L。每孔加入2 μL適度稀釋的化合物溶液(溶解于DMSO)，化合物的最終濃度為0.5～200 μ/mol。采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，每處理重復(fù)4次。每個(gè)孔中的細(xì)胞生長(zhǎng)1周，每天用Ledetect 96微孔板吸光度測(cè)讀儀(Labexim，Lengau，Austria)測(cè)定吸光度，此儀器在660 nm處配備LED插件，以除去在750 nm處的吸收濁度。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換，生長(zhǎng)常數(shù)以各處理與對(duì)照(相同體積DMSO)的平均值百分比來(lái)表示(不少于16次重復(fù))。數(shù)據(jù)為重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。按上述方法計(jì)算50%抑制濃度(IC50)及其置信區(qū)間。把十二烷基硫酸鈉(SDS)[160 μmol/L (0.02倍臨界膠束濃度)]或Triton稀釋100倍[25 μmol/L (0.1倍臨界膠束濃度)]加入生長(zhǎng)培養(yǎng)基用來(lái)評(píng)價(jià)表面活性劑對(duì)溴化酰胺類化合物抑制活性的影響，前期研究表明其影響藍(lán)藻菌株P(guān)CC9438的聚磷酸鹽吸收而不影響藻類生長(zhǎng)。

1.4 分子模型和定量構(gòu)效關(guān)系

對(duì)化合物14－36進(jìn)行了分子建模和定量構(gòu)效關(guān)系(QSAR)研究。雖然樣本數(shù)量對(duì)于QSAR回歸模型很少，但是根據(jù)ASTM標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)光譜定量分析是合理的。該標(biāo)準(zhǔn)表明，對(duì)于復(fù)雜數(shù)據(jù)，如果使用3個(gè)或更少的因素構(gòu)建多元模型，那么校正集應(yīng)最少包含24個(gè)樣品。

基于苯甲酰苯胺和其他含芳基小分子的晶體結(jié)構(gòu)以及與蛋白質(zhì)結(jié)合的配體(PDB編碼2P16和2W26)，使用WebLab ViewerPro 4.0和GaussView 4.1.2進(jìn)行分子建模?？梢栽诟咚?3W的AM1水平驗(yàn)證最穩(wěn)定的構(gòu)象。應(yīng)用密度泛函理論(DFT)，首先在高斯03W的B3LYP/3-21G*水平，然后在B3LYP/6-31G**水平進(jìn)行幾何優(yōu)化。其后，在相同的DFT水平下對(duì)自由基陰離子14*－－36*－進(jìn)行幾何優(yōu)化，并計(jì)算原子電荷和自旋密度。使用Gaussian03W、MarvinView5.3.4和SymyxDraw3.3計(jì)算化合物14－36的分子描述符。電子親和力(EA)為自由基陰離子與其相應(yīng)的中性物質(zhì)之間的電子能量差異。SCORE是相對(duì)于最簡(jiǎn)單的化合物34對(duì)生物活性的正、零或負(fù)貢獻(xiàn)的描述符，根據(jù)先驗(yàn)法和密度泛函理論計(jì)算(DFT)的分子構(gòu)象得到的。一共有146個(gè)分子描述符。

用數(shù)字濾波器識(shí)別和消除皮爾遜相關(guān)系數(shù)絕對(duì)值(|r|)與生物活性(pIC50=－log(IC50mol/L)小于0.5以及于pIC50在散布圖中的異常散布的描述符。使最初146個(gè)描述符縮減為21。然后用預(yù)測(cè)子排序選擇法(ordered predictor selection algorithm)選擇變量，并用得到的5個(gè)分子描述符建立了最小二乘法(PLS)回歸模型。利用QSAR建模軟件進(jìn)行PLS建模和模型驗(yàn)證(留一法和留多法交叉驗(yàn)證，y隨機(jī)化和符號(hào)變化檢驗(yàn))。在化學(xué)計(jì)量分析之前，將描述符和生物活性自動(dòng)標(biāo)定(以均值為中心，并標(biāo)定為統(tǒng)一方差)。

2 結(jié)果和討論

2.1 酰胺的合成

三氟甲基芳酰胺14－36按如下3步制備：商品化的1-氟-2-硝基-4-三氟甲基苯(1)和不同胺之間發(fā)生親核芳香取代反應(yīng)，以81%～98%產(chǎn)率得到硝基化合物2－7(圖2)。

然后，用SnCl2/HCl還原硝基化合物，得到相應(yīng)還原胺8－13，產(chǎn)率為56%～94%(圖3)。

最后，化合物8－13被不同的酰氯?；?，生成對(duì)應(yīng)三氟甲基芳酰胺14－36(圖4)。對(duì)這些酰胺化合物進(jìn)行生物活性測(cè)試，研究了基團(tuán)R1(與氮相連的脂肪族、芳香族和脂環(huán)族基團(tuán))和基團(tuán)R2(與羰基相連的苯基和芳香雜環(huán)基團(tuán))對(duì)生物活性的影響。圖4列出了化合物14－36的收率。

用紅外和核磁(1H和13C)表征所有合成的目標(biāo)化合物。用高分辨質(zhì)譜確認(rèn)了目標(biāo)化合物的分子式。

2.2 生物活性測(cè)定

由于幾種作用于光合系統(tǒng)的除草劑具有酰胺結(jié)構(gòu)，通過(guò)測(cè)量分離的類囊體膜對(duì)鐵氰化鉀的光驅(qū)動(dòng)還原作用，來(lái)研究三氟甲基芳酰胺類化合物14－36對(duì)葉綠體電子傳遞的影響。結(jié)果見(jiàn)表1，以抑制50%的活性的濃度(IC50)表示。

除化合物25和32外，其余化合物對(duì)從水到鐵氰化鉀的電子傳遞均存在不同程度的抑制作用。有趣的是，活性最高的化合物19、24、30和36具有共同的結(jié)構(gòu)特征，即對(duì)溴苯基，此基團(tuán)好像能夠顯著增加化合物骨架的抑制活性。

為了獲得更多該類化合物的作用機(jī)制信息，對(duì)3個(gè)抑制作用最強(qiáng)的化合物進(jìn)行了詳細(xì)的研究。首先，分別在基本條件、解偶聯(lián)和磷酸化條件下，評(píng)估了化合物濃度增加對(duì)鐵氰化物的還原作用的影響。結(jié)果見(jiàn)圖5的上排圖，顯示在所有條件下的結(jié)果十分相似。這些結(jié)果表明，三氟甲基芳酰胺既不為解偶聯(lián)劑，也不為能量轉(zhuǎn)移抑制劑，而是直接與電子傳遞鏈相互作用。然后，通過(guò)添加細(xì)胞色素b6f抑制劑2,5-二溴-3-甲基-6-異丙基-對(duì)苯醌(DB-MIB)，使基本條件下鐵氰化物還原過(guò)程被阻斷，添加苯二胺能夠使不經(jīng)過(guò)PSⅠ的水到鐵氰化物的電子傳遞恢復(fù)。這些化合物也以相當(dāng)?shù)乃俣雀蓴_電子傳遞(圖5中下排圖)，證明PSⅠ不是其作用靶標(biāo)，并且大多數(shù)光合抑制劑除草劑，其作用靶標(biāo)是PSⅡ。

圖5 化合物19、24和36在基本的、解偶聯(lián)和磷酸化條件下對(duì)光合電子流的影響(上圖)，三氟甲基芳酰胺類化合物對(duì)鐵氰化物在完整電子傳遞鏈中和單獨(dú)的光系統(tǒng)II中還原的影響(下圖)

表1 化合物14－36在離體條件下對(duì)功能完整的葉綠體a(取自菠菜葉片)中鐵氰化物還原活性的影響

表2 溴苯基三氟甲基芳酰胺化合物19、24、30、36對(duì)細(xì)長(zhǎng)聚球藻a生長(zhǎng)影響的活體測(cè)試

能夠干擾光合作用電子傳遞鏈的化合物對(duì)光合生物具有潛在的生物活性。然而，離體試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，低的細(xì)胞膜滲透性/溶解性、亞細(xì)胞區(qū)室和代謝/解毒反應(yīng)的存在等若干因素可以使活性化合物在細(xì)胞內(nèi)喪失抑制活性。為了驗(yàn)證以上觀點(diǎn)，研究了在希爾反應(yīng)中抑制作用最強(qiáng)的化合物對(duì)光合自養(yǎng)型藍(lán)藻——細(xì)長(zhǎng)聚球藻菌株P(guān)CC6301的生長(zhǎng)抑制活性。結(jié)果見(jiàn)表2。

4種化合物都能顯著抑制藻的生長(zhǎng)。然而，在相對(duì)有效性和抑制斜率方面，活體試驗(yàn)與離體試驗(yàn)有所差異(圖6)?；衔飳?duì)細(xì)胞和類囊體膜的不同滲透性，或者藍(lán)藻細(xì)胞對(duì)活性分子部分解毒的效率不同均可能造成這種差異。這些溴代苯基三氟甲基芳酰胺類化合物的活體活性較低(活體ID50比離體ID50高1至2個(gè)數(shù)量級(jí))以及化合物19和30相對(duì)于化合物24和36抑制曲線的斜率明顯不同(圖6)，進(jìn)一步證明了上述推斷的可能性。為了證實(shí)該假設(shè)，將160 μmol/L十二烷基苯磺酸鈉(SDS)或25 μmol/L稀釋100倍的聚乙二醇辛基苯基醚(Triton)加入培養(yǎng)基中，來(lái)進(jìn)一步評(píng)價(jià)三氟甲基芳酰胺類化合物對(duì)藍(lán)藻生長(zhǎng)的影響。試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，發(fā)現(xiàn)前一種表面活性劑增加了螺旋藻藍(lán)藻對(duì)聚磷酸鹽2054的吸收，且不影響藻類生長(zhǎng)，而后者對(duì)聚磷酸鹽代謝有不利影響。但是，在該情況下得到的抑制曲線與不加表面活性劑時(shí)得到的抑制曲線完全重疊(數(shù)據(jù)未顯示)。

圖6 化合物19、24、30和36對(duì)離體光合作用電子流動(dòng)和活體藍(lán)藻生長(zhǎng)的影響比較

2.3 定量構(gòu)效關(guān)系分析

為了獲取酰胺化合物14－36的結(jié)構(gòu)和干擾光合作用電子傳遞作用信息，進(jìn)行了定量構(gòu)效關(guān)系分析。表3列出了定量構(gòu)效關(guān)系模型數(shù)據(jù)。表4為定量構(gòu)效關(guān)系模型的相關(guān)矩陣和回歸系數(shù)。所選的5個(gè)描述符是：LUC，原子軌道對(duì)連接-CF3基團(tuán)的芳香族碳原子的LUMO軌道的貢獻(xiàn)，為L(zhǎng)UMO軌道的原子軌道系數(shù)的平方；PoI3D，Thole的分子極化率，為使用Marvin View 5.3.4計(jì)算的分子3D結(jié)構(gòu)；wC，碳含量的質(zhì)量百分比；EA，電子親和力；和SCORE。測(cè)量的化合物14－36(表1)的離體活性(IC50)范圍為2個(gè)數(shù)量級(jí)。根據(jù)Pearson相關(guān)系數(shù)的絕對(duì)值，描述符之間的相關(guān)系數(shù)為0.46～0.89，描述符與pIC50之間的中度相關(guān)系數(shù)為0.63～0.73(表4)。

表3 QSAR模型數(shù)據(jù)：分子描述符、生物活性的實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值，殘差和殘差百分比

表4 QSAR模型的相關(guān)矩陣與回歸系數(shù)

最終該最小二乘回歸(PLS)模型有1個(gè)潛在的可描述71.0%原始信息的變量。模型的基本統(tǒng)計(jì)量(R2= 0.677，Q2=0.603)滿足QSAR的最低要求(R2＞0.6，Q2＞0.5)。標(biāo)準(zhǔn)誤差(校正標(biāo)準(zhǔn)差SEC=0.473，驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)差SEV=0.501)略高于pIC50(4.36)平均值的10%。表3顯示，13個(gè)化合物的實(shí)測(cè)pIC50高于預(yù)測(cè)，10個(gè)低于預(yù)測(cè)，9個(gè)殘差百分比超過(guò)10%，其中2個(gè)化合物(32和34)殘差百分比高于20%。

根據(jù)文獻(xiàn)對(duì)該模型進(jìn)行了進(jìn)一步驗(yàn)證。通過(guò)留N法交叉驗(yàn)證(LNO，圖4)證實(shí)了優(yōu)化模型的平穩(wěn)性。Q2LNO平均值在一個(gè)較小范圍內(nèi)圍繞Q2LOO(Q2來(lái)源于留一法交叉驗(yàn)證)擺動(dòng)，而用三分之一樣本交叉驗(yàn)證時(shí)相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)差小。用y隨機(jī)化分析檢驗(yàn)偶然相關(guān)性。比較隨機(jī)模型[即具有擾亂(scrambled)的pIC50的模型]和最終的QSAR模型，由于兩者的參數(shù)不能滿足偶然相關(guān)的最低標(biāo)準(zhǔn)：⑴ Q2＜0.1和R2＜0.4(圖6)；⑵ R的散點(diǎn)(yal，y)對(duì)R2和R的散點(diǎn)(yal，y)對(duì)Q2的線性回歸方程的截距分別小于0.3和0.05，所以其不是偶然相關(guān)。最后，檢查QSAR模型的符號(hào)變化。由于模型相關(guān)性和相應(yīng)回歸系數(shù)具有相同的符號(hào)，所以描述符的符號(hào)基本沒(méi)有變化(表4)。

對(duì)比本文的回歸模型和2010年以來(lái)報(bào)道的PSII抑制劑的其他QSAR模型(表5)，就會(huì)發(fā)現(xiàn)該模型的質(zhì)量令人滿意。就分子數(shù)量而言，14－36的化合物庫(kù)正好達(dá)到PLS的最低要求，這就是沒(méi)有用數(shù)據(jù)分割模型驗(yàn)證(外部驗(yàn)證)的原因。2017年報(bào)道的最新模型是合理的，在所有報(bào)道的PSII抑制劑活性模型中，其所用的化合物(43個(gè))數(shù)量最多。在這種情況下，幾個(gè)驗(yàn)證模型均可被應(yīng)用，避免使用PLS等基于壓縮數(shù)據(jù)的回歸分析。

根據(jù)本文的生物活性測(cè)定，活性最好的化合物有19、24、30和36(IC50為1～5 μmol/L或pIC50為5.3～6.0，表1)。預(yù)測(cè)活性以pIC50表示為5.4～6.1(表3)。這些值雖然較小，但與用細(xì)長(zhǎng)聚球藻(Synechococcus elongates)藍(lán)藻葉綠體進(jìn)行的相似生測(cè)中，眾所周知的商品化除草劑莠去津(IC50=0.23 μmol/L或pIC50=6.6)、敵草隆(IC50=0.27 μmol/L，pIC50=6.6)和莠去津衍生物TPA[1-三氟甲基-3-甲基-5-(4-三氟甲基苯基)甲氨基-2,4,6-三嗪(IC50=0.05 μmol/L，pIC50=7.3)]等的抑制活性相當(dāng)。

表5 本文光系統(tǒng)Ⅱ抑制劑的最終QSAR模型和近期其他QSAR模型的比較

圖7 在最大N代表樣本最重要部分(43%)的留N法交叉驗(yàn)證(LNO，N=1，2，...，10)中，最終QSAR模型的性能

2.4 QSAR模型的化學(xué)分析

所選的QSAR模型5個(gè)分子描述符，即LUC，PoI3D，wC，EA和SCORE具有相當(dāng)大的回歸系數(shù)(絕對(duì)值為0.18～0.20，表4)。只有SCORE和Pol3D的回歸系數(shù)為正。分子描述符可以指示良好的PSII抑制劑的分子特征：反應(yīng)性、構(gòu)象特征以及與受體的分子間的相互作用。三氟甲基芳酰胺14－36的作用很可能和文獻(xiàn)中報(bào)道的作用于QB活性位點(diǎn)的質(zhì)體醌-9(PQ-9)置換劑除草劑相似。

對(duì)于最簡(jiǎn)單的化合物34來(lái)說(shuō)，描述符SCORE由于具有復(fù)雜性質(zhì)——空間、電子分布、氫鍵和親脂性特征對(duì)QSAR模型貢獻(xiàn)很大。化合物離體活性隨著SCORE正值的增加而增加，SCORE非負(fù)值的化合物為活性最高的19、24、30和36，以及活性次之的22和34。也就是，較好的PSII抑制劑具有1個(gè)扁平且較長(zhǎng)的基團(tuán)(或至少為占較小空間的1個(gè)基團(tuán))，主要為與胺相連的疏水基團(tuán)[-N(H)-R]?；钚宰罡叩幕衔飳?duì)應(yīng)的R為對(duì)溴苯基。化合物14-36的對(duì)溴苯基可能進(jìn)入活性位點(diǎn)的疏水性環(huán)境(1個(gè)亞口袋或小口袋)。SCORE包含有2個(gè)對(duì)pIC50有積極貢獻(xiàn)的因素：⑴ 與酰胺部分中的氮相連的芳基是苯基或鄰氯吡啶基，而其他類型的芳基具有負(fù)貢獻(xiàn)，這表明雜原子的存在與位置，決定了分子與受體的相互作用；⑵ 在胺[-N(H)-]部分和羰基(對(duì)于化合物15、26和32)之間形成的分子內(nèi)氫鍵可以穩(wěn)定分子構(gòu)象，表明可能與受體形成更強(qiáng)的鍵。

圖8 y隨機(jī)化驗(yàn)證的最終的QSAR模型的性能：R2與Q2散點(diǎn)圖

極化描述符PoI3D與離體活性呈正相關(guān)。通過(guò)觀察分子結(jié)構(gòu)(圖4)和Pol3D(表3)可知，在胺[-N(H)-R]部分引入鹵素原子(Br、Cl)和柔性環(huán)基團(tuán)(苯基、環(huán)己基)，分子極化率值可增加到36?3以上。一般來(lái)說(shuō)，配體的分子極化能力意味著在受體—配體配合物形成過(guò)程中其在受體外部電荷重新分布的能力。活性最高的化合物19、24、30和36在取代胺基中具有對(duì)溴苯基，而在化合物24的芳酰胺部分中增加氯，則對(duì)分子極化率沒(méi)有顯著影響。對(duì)溴苯基除了是富電子且扁平的基團(tuán)外，也是化合物1-36中拓?fù)湟饬x上最長(zhǎng)的取代基(從-NH-到末端溴之間存在5個(gè)鍵)，這使得這種取代基適合于增加分子極化率，并增強(qiáng)了三氟甲基芳基酰胺與PSII的復(fù)合體的形成。

描述符wC對(duì)模型的貢獻(xiàn)度為負(fù)：具有較高含量碳原子的化合物為弱的PSII抑制劑，換句話說(shuō)，具有較高含量的雜原子(鹵素、氮和氧)的分子是較好的PSII抑制劑?；钚宰罡叩幕衔?9、24、30和36是碳原子含量最低的化合物(48%～55%)。此外，含氯化合物(20－23)的碳含量也較低(52%～56%)。碳原子含量較高或雜原子含量較低意味著其是更疏水的抑制劑分子，這不利于作用于PSII的QB活性位點(diǎn)?；衔?4－36中的雜原子可以與受體建立強(qiáng)的氫鍵(N、O)和其他極性作用(N、O、F、Br、Cl)，增加分子極化率和溶解度，影響芳環(huán)中的電子離域。

電子親和力(EA)與離體活性呈負(fù)相關(guān)。EA越小表明自由基陰離子越穩(wěn)定，或者中性分子吸收電子的能力越強(qiáng)。酰胺化合物14－36都是電子受體，它們的EA為負(fù)值(表3)，但它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)(圖4)和分子量(與EA的相關(guān)性為－0.84)具有明顯差異。被吸收的電子更容易分布在大分子結(jié)構(gòu)或含有雜原子的結(jié)構(gòu)上。這就是活性最好的化合物具有最小EA的緣故，此外，高活性分子具有3個(gè)π電子體系，即電子受體芳基酰胺部分、三氟甲基苯基和對(duì)溴苯基?；衔?0－24的芳基酰胺部分的3-吡啶基環(huán)上有1個(gè)氯原子，因此EA值最低[(－12)～(－26) kcal/mol]，而化合物14－19的4-吡啶基環(huán)上缺少氯原子[EA為(－11)～(－26) kcal/mol]?；衔?5－30具有1個(gè)3-吡啶基環(huán)，稍大的EA[EA為(－6)～(－21) kcal/mol]。最弱的電子受體是在芳基酰胺部分有苯環(huán)的化合物31－36[EA為(－0.1)～(－16) kcal/mol]。

為了識(shí)別化合物14－36的反應(yīng)基團(tuán)，分析了高活性化合物19和非活性化合物25及其自由基陰離子19*－和25*－的電子特征，結(jié)果列于表6中。中性分子19和25吸收1個(gè)電子后其分子體積顯著增加，電子重新分布和出現(xiàn)非零的自旋密度。根據(jù)非氫原子(ΣQ)的電荷總和，可以注意到，化合物19和25中的負(fù)電荷都集中于芳基酰胺和胺部分，而三氟甲基苯基部分帶正電荷。在吸收電子后，19*－和25*－芳酰胺負(fù)電荷增加了0.7。然而，自由基的剩余負(fù)電荷分布不同：對(duì)于19*－和25*－，三氟甲基苯基的正電荷減少0.2，但19*－胺官能團(tuán)負(fù)電荷增加而25*－胺官能團(tuán)負(fù)電荷減少。通過(guò)分析非氫原子自旋密度(ΣS)的總和，可以很好地區(qū)分19*－和25*－中的3個(gè)分子片段：90%的自旋密度存在于酰胺部分(更確切地說(shuō)，在與羰基共軛的芳香環(huán)中)，約9%存在于三氟甲基苯基，僅有約1%的自旋密度分布在胺上。19*－和25*－的羰基的自旋密度分別為39%和36%。這2個(gè)自由基陰離子的自旋密度沒(méi)有本質(zhì)區(qū)別，但是電子吸收之后電荷分布有差異。據(jù)推測(cè)，對(duì)于化合物集14－36來(lái)說(shuō)，具有相似的趨勢(shì)，即胺部分是最易變的分子片段，而且其只包含少部分自旋密度。

羰基是1個(gè)反應(yīng)活性高、電子接受能力強(qiáng)的基團(tuán)，可被PSII還原。Funar-Timofei等人最近通過(guò)對(duì)接分析表明，活性最高的除草劑可能作用于PSII的活性位點(diǎn)QB，與His215形成氫鍵，由此除草劑接受了1個(gè)光電子，成為自由基陰離子?；衔?4－36也有此作用，含有三氟甲基苯基的酰胺作用于活性位點(diǎn)，其羰基與His215通過(guò)氫鍵相互作用。第3個(gè)分子片段——胺需要His215附近的1個(gè)亞口袋或新的小口袋。因此，此分子片段和三氟甲基苯基可以被認(rèn)為是固定片段，而芳酰胺則是反應(yīng)片段。胺部分與PSII相互作用，具有雙重作用：固定功能和確定分子極化性作用。莠去津和溴苯腈是眾所周知的與PSII對(duì)接時(shí)能與His215形成氫鍵的農(nóng)藥。

LUC是局部LUMO(最低未占軌道)描述符，與離體活性呈負(fù)相關(guān)性。該描述符解釋了中心苯環(huán)上胺和芳酰胺部分的結(jié)構(gòu)變化的影響以及該環(huán)內(nèi)三氟甲基基團(tuán)的誘導(dǎo)效應(yīng)。對(duì)于所有這些變化，LUC是一個(gè)很好的“傳感器”。沒(méi)有其他與前沿分子軌道有關(guān)的描述符與離體活性具有顯著相關(guān)性。預(yù)期化合物14－36分子中心片段的部分(三氟甲基苯基環(huán))結(jié)構(gòu)變化可能引起顯著影響。已知三氟甲基基團(tuán)為吸電子基團(tuán)，對(duì)自由基穩(wěn)定重要。例如，吸收電子后，在19*－和25*－中的-CF3的負(fù)電荷增加0.06。-CF3基團(tuán)對(duì)于通過(guò)各種分子間相互作用來(lái)穩(wěn)定分子復(fù)合物也是重要的。莠去津衍生物TPA的三氟甲基與PSII的活性位點(diǎn)QB存在分子間相互作用。LUC還可以“編碼”在配體-受體復(fù)合物形成過(guò)程中和光電子的吸收后-CF3基團(tuán)的變化。

表6 化合物19和25及其自由基陰離子19*-和25*-的電子特征(DFT計(jì)算)

3 結(jié) 論

本文通過(guò)3步反應(yīng)以較高收率合成了23個(gè)三氟甲基芳酰胺類化合物。對(duì)其進(jìn)行離體生物測(cè)試，結(jié)果表明，23個(gè)化合物中的20個(gè)化合物可以在微摩爾至毫摩爾范圍內(nèi)干擾光合作用電子傳遞。并發(fā)現(xiàn)含有4-溴苯基的化合物活性最高，其IC50接近1 μmol/L。以20 μmol/L的濃度添加進(jìn)培養(yǎng)基中時(shí)，該類含有4-溴苯基衍生物中有2種能夠完全抑制藍(lán)藻生長(zhǎng)。事實(shí)上，在QSAR研究中發(fā)現(xiàn)具有長(zhǎng)且扁平的4-溴苯基結(jié)構(gòu)的4種化合物活性最高。對(duì)QSAR模型的化學(xué)分析證實(shí)了其統(tǒng)計(jì)有效性，以及讓人們更好地了解如何建立更有效的PSII抑制劑模型。分子描述符表明芳香片段和雜原子在PSII抑制劑分子結(jié)構(gòu)中的重要性。因此，三氟甲基芳酰胺類化合物可作為開(kāi)發(fā)除草劑活性分子的新穎骨架。目前在進(jìn)一步研究該類化合物的作用方式，合成一系列具有更高活性的新苯基衍生物。