“俄色葉”飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

陳蓉，陳華林，徐俊，蔡曉洋，敬勇，李敏

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué) 中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611137；2.中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，四川 成都 611137)

因俄色葉因具有良好的“降三高”作用，部分公司已進(jìn)行俄色葉的試生產(chǎn)和試銷。另外，有研究表明，俄色葉可制成俄色黃酮分子膠囊[7]、俄色-A毛囊靶向脂質(zhì)體[8]、俄色總黃酮緩釋栓劑與片劑[9]、俄色黃酮微囊[10]、俄色黃酮-β-環(huán)糊精包合物[11]、復(fù)方顆粒劑[12]等藥物，具有極高的臨床應(yīng)用價(jià)值。

目前俄色葉飲片尚無標(biāo)準(zhǔn)可依，無法有效保障其質(zhì)量的穩(wěn)定性和可控性，因此建立俄色葉飲片標(biāo)準(zhǔn)顯得尤為迫切。本文通過對俄色葉飲片進(jìn)行質(zhì)量研究，為全面控制俄色葉飲片質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)、SQP電子分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)、HWS型恒溫恒濕培養(yǎng)箱(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)、ULUP-IV-10T優(yōu)普系列超純水儀(四川優(yōu)普超純科技有限公司)、ZF-90多功能暗箱式紫外透射儀(上海寶山顧村電光儀器廠)、DZKW-4型電子恒溫水浴鍋(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)、A580型紫外可見分光光度計(jì)(翱藝儀器上海有限公司)、安捷倫1200高效液相色譜儀(DAD檢測器，安捷倫科技有限公司)。

1.2 試藥

根皮素對照品(純度≥98%，批號(hào)：wkq18032810)，根皮苷對照品(純度≥98%，批號(hào)：wkq18050407)，均由四川省維克奇生物科技有限公司提供。甲醇(賽默飛世爾科技公司，色譜純，批號(hào)：LOT145176)。甲醇(批號(hào)：2017090101)、甲酸(批號(hào)：20110510)、乙醇(批號(hào)：2017022801)、乙酸乙酯(批號(hào)：2017051201)等為分析純，均購于成都市科隆化學(xué)品有限公司。

30批俄色葉飲片由四川興盛源藥業(yè)有限公司提供，經(jīng)由成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室李敏教授鑒定為薔薇科蘋果屬植物變?nèi)~海棠Malustoringoides(Rehd.)Hughes.和花葉海棠Malustransitoria(Batal.)Schneid.的干燥葉。其中15批采用凈制的方法炮制，另外15批采用切制的方法炮制。俄色葉飲片詳細(xì)信息見表1。

表1 俄色葉飲片樣品來源

2 方法及結(jié)果

2.1 性狀

對收集到的30批飲片的形狀、大小、色澤、表面特征、氣、味等進(jìn)行研究。結(jié)果表明，不同飲片的性狀略有不同。見表2，圖1～4。

表2 凈制飲片水分、總灰分、酸不溶性灰分及浸出物測定結(jié)果n=3，%

圖1 凈制俄色葉(變?nèi)~海棠)

圖2 凈制俄色葉(花葉海棠)

圖3 切制俄色葉(變?nèi)~海棠) 圖4切制俄色葉(花葉海棠)

凈制飲片葉易皺縮，完整者呈卵形或橢圓形，先端漸尖或急尖，邊緣鈍鋸齒或微鋸齒，常具不規(guī)則3～5個(gè)深裂，亦有不裂。上表面多為暗綠色或淺棕綠色，疏被柔毛；下表面多為灰綠色或灰棕色，被柔毛，葉脈尤甚；葉柄被柔毛。質(zhì)脆。氣微香，味微苦。見圖1～2。

切制飲片為不規(guī)則碎片，葉片暗綠色。見圖3～4。

2.2 鑒別

2.2.1 顯微鑒別

通過對兩種飲片的葉中脈橫切面及粉末進(jìn)行觀察和測量，其顯微鑒別特征總結(jié)如下。葉中脈橫切面：上下表皮各1列細(xì)胞，排列緊密，切向延長，可見單細(xì)胞非腺毛；葉肉為異面葉型，柵欄細(xì)胞1～3列，短柱狀，呈橙黃色,排列較整齊，不通過主脈，海綿組織疏松，細(xì)胞內(nèi)含草酸鈣方晶和簇晶；主脈向下突出，維管束外韌型，環(huán)狀，外圍有纖維束，其周圍薄壁細(xì)胞含草酸鈣方晶和簇晶，形成晶纖維(見圖5～6)。粉末：棕綠色至黃綠色，上表皮細(xì)胞多角形、狹長形或方形；下表皮有多數(shù)單細(xì)胞非腺毛，常彎曲，長130～800 μm，氣孔不定式，保衛(wèi)細(xì)胞直徑3～13 μm，副衛(wèi)細(xì)胞4～8個(gè)；草酸鈣簇晶散在薄壁組織中，直徑為2～29 μm；草酸鈣方晶的直徑為2～24 μm；纖維成束，周圍薄壁細(xì)胞含草酸鈣方晶，形成晶纖維；導(dǎo)管為梯紋或螺紋，直徑2～20 μm。見圖7。

1.上表皮 2.柵欄細(xì)胞 3.木質(zhì)部 4.海綿組織 5.下表皮 6.非腺毛 7.韌皮部 8.纖維 9.皮層

1.非腺毛 2.木質(zhì)部 3.上表皮細(xì)胞 4.柵欄組織 5.海綿組織 6.下表皮 7.韌皮部 8.纖維 9.皮層

1.非腺毛 2.上表皮細(xì)胞 3.下表皮細(xì)胞及氣孔 4.晶纖維 5.簇晶 6.方晶 7.螺紋導(dǎo)管 8.梯紋導(dǎo)管

2.2.2 薄層鑒別

根據(jù)《四川藏藥材標(biāo)準(zhǔn)》(2014年版)俄色葉項(xiàng)下的薄層鑒別方法，取根皮素適量，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的對照品溶液。以硅膠G薄層板為吸附板，以氯仿-甲醇-甲酸(8∶2∶0.1)為展開劑，以三氯化鋁試液為顯色劑。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同淺藍(lán)色熒光斑點(diǎn)。見圖8。

注：1～8為凈制俄色葉；9～15為切制俄色葉；S為根皮素對照品

2.3 檢查

2.3.1 水分

稱取俄色葉飲片粉末約2.0 g，照《中國藥典》2015年版(四部)通則0832項(xiàng)下水分測定法第二法進(jìn)行測定。結(jié)果表明，15批凈制飲片水分為6.88%～10.16%，平均為9.05%；切制飲片測定結(jié)果為7.01%～10.23%，平均為9.11%。詳見表2～3。

表3 切制飲片水分、總灰分、酸不溶性灰分及浸出物測定結(jié)果 n=3，%

2.3.2 灰分

稱取俄色葉飲片粉末約4.0 g，按照《中國藥典》2015年版(四部)通則2302灰分測定法進(jìn)行總灰分和酸不溶性灰分的測定。結(jié)果表明，凈制飲片總灰分為5.24%～6.37%，平均為5.80%；切制飲片為5.33%～6.17%，平均為5.82%。凈制飲片酸不溶性灰分為0.36%～0.48%，平均為0.42%；切制飲片為0.33%～0.47%，平均為0.42%。詳見表2～3。

2.4 浸出物

稱取俄色葉飲片粉末約2.0 g，精密稱定，按照《中國藥典》2015年版(四部)通則2201醇溶性浸出物測定法項(xiàng)下的熱浸法測定，用80%乙醇作溶劑。結(jié)果表明，凈制飲片浸出物為41.08%～44.49%，平均為43.02%；切制飲片測定結(jié)果為41.67%～43.92%，平均為42.72%。詳見表2～3。

2.5 含量測定

2.5.1 總黃酮含量測定

參照《四川省藏藥材標(biāo)準(zhǔn)》(2014年版)俄色葉總黃酮測定方法進(jìn)行測定，總黃酮含量以根皮苷計(jì)。結(jié)果表明，凈制飲片總黃酮含量為20.64%～25.95%，平均為22.93%，切制飲片總黃酮含量為20.77%～24.97%，平均為22.69%。詳見表4。

2.5.2 根皮素

參照《四川省藏藥材標(biāo)準(zhǔn)》(2014年版)中俄色葉根皮素測定方法進(jìn)行測定。結(jié)果表明，15批凈制飲片根皮素含量為0.170%～0.503%，平均為0.234%；切制飲片中根皮素含量為0.171%～0.498%，平均為0.229%。詳見表4。

表4 俄色葉飲片含量測定結(jié)果 n=3，%

2.6 工藝研究

2.6.1 俄色葉炮制方法對質(zhì)量的影響

依據(jù)《中華人民共和國藥典》(2015年版)和《四川省中藥飲片炮制規(guī)范》(2015年版)對飲片凈制工藝的相關(guān)要求，以及目前飲片生產(chǎn)企業(yè)對于俄色葉凈制的操作與要求，取干燥的俄色葉藥材分別進(jìn)行凈制和切制的處理。將凈制俄色葉和切制俄色葉各5批分別進(jìn)行水分、總灰分、浸出物、總黃酮、根皮素含量測定，觀察俄色葉炮制方法對其質(zhì)量的影響。結(jié)果表明，切制俄色葉較凈制飲片水分略有升高，總灰分、浸出物、總黃酮和根皮素均略有降低，對酸不溶性灰分無影響。詳見表5。

表5 不同炮制方法對俄色葉飲片質(zhì)量的影響 %

2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取模擬上市包裝的凈制俄色葉和切制俄色葉中試樣品各3批(批號(hào)：170101、170102、170103、170101q、170102q、170103q)進(jìn)行加速試驗(yàn)和長期試驗(yàn)考察。

2.7.1 加速試驗(yàn)

取模擬上市包裝的俄色葉和切制俄色葉中試樣品各3批，置于溫度(40±2)℃，濕度(75±5)%的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中進(jìn)行貯藏，在0，1，2，3，6個(gè)月取樣，對飲片的性狀進(jìn)行觀察，并測定水分、浸出物、總黃酮以及根皮素含量。2種飲片共6批樣品經(jīng)6個(gè)月考察發(fā)現(xiàn)，水分、總黃酮及根皮素含量無明顯變化，符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求，浸出物從第2月開始出現(xiàn)明顯較低的現(xiàn)象，到第6月時(shí)，兩種飲片浸出物的損失率分別達(dá)15.1%和14.05%，但均符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求。詳見圖9。

注：1.水分 2.浸出物 3.總黃酮 4.根皮素

2.7.2 長期試驗(yàn)

取上市包裝的凈制飲片和切制飲片各3批，置于室溫(25±2)℃，濕度(60±5)%的條件下貯藏，在0，1，2，3，6，12，18，24個(gè)月進(jìn)行取樣，對飲片的性狀進(jìn)行觀察，并測定水分、浸出物、總黃酮以及根皮素含量。2種飲片共6批樣品經(jīng)24個(gè)月考察發(fā)現(xiàn)，水分、浸出物、總黃酮及根皮素含量均符合質(zhì)量要求，到第24月時(shí)，兩種飲片浸出物的損失率分別達(dá)12.94%和14.02%，但均符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求。詳見圖10。

注：1.水分 2.浸出物 3.總黃酮 4.根皮素

3 結(jié)論

本文通過對俄色葉飲片水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物、總黃酮含量以及根皮素含量進(jìn)行研究，根據(jù)各項(xiàng)檢測結(jié)果，擬定俄色葉飲片水分不得過11.0%，總灰分不得過7.0 %，酸不溶性灰分不得過0.5%，浸出物不得少于34.0 %。按干燥品計(jì)算，總黃酮以根皮苷(C21H24O10)計(jì)，不得少于18.0%，根皮素(C15H14O5)含量不得少于0.18%。

4 討論

飲片是中藥配方顆粒、中藥湯劑、中成藥的直接原料藥，其質(zhì)量的好壞直接影響到三大產(chǎn)品的質(zhì)量。因此，飲片的質(zhì)量控制顯得至關(guān)重要。

俄色葉芽與俄色大葉的根皮素含量差異較大，研究發(fā)現(xiàn)俄色葉芽根皮素含量較大葉高，尤以5月份初生的葉芽根皮素含量最高，均值可達(dá)1.516%，而大葉根皮素含量平均僅為0.218%，二者均值差異達(dá)近7倍。《四川省藏藥材標(biāo)準(zhǔn)》(2014年版)俄色葉標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定根皮素含量不得少于0.35%，但在實(shí)際生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)，約60%的俄色葉藥材根皮素含量低于0.35%，這些含量較低的俄色葉中約97%的樣品為俄色大葉。根據(jù)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，“俄色樹”每年5月開始抽出葉芽，因葉芽采摘難度大，量比較小，且十分昂貴，因此常被制作成茶葉進(jìn)行銷售。而當(dāng)6～8月份時(shí)，葉芽較少，主要采集俄色大葉，以作藥用。因此俄色葉藥材資源以6～8月份采摘的俄色大葉為主。為保證俄色葉資源的有效利用，故擬定俄色葉凈制和切制飲片的根皮素含量均不得少于0.18 %。

加工炮制中凈選是確保中藥質(zhì)量和臨床用藥準(zhǔn)確性的一個(gè)首要環(huán)節(jié)，而切制是便于包裝、促進(jìn)有效成分溶出的一種重要手段。通過挑除俄色葉藥材中所混的枝梢、枯葉、枝梗等雜質(zhì)，提高藥材的品質(zhì)，形成凈制俄色葉飲片；取用凈制后的俄色葉切碎、包裝，形成切制俄色葉飲片。通過分析兩種炮制方式對俄色葉飲片質(zhì)量和成品率的影響，評(píng)價(jià)炮制方式是否合適。

根據(jù)加速試驗(yàn)和長期試驗(yàn)的結(jié)果，凈制俄色葉和切制俄色葉的外觀性狀及水分、總黃酮以及根皮素含量無明顯變化，各項(xiàng)指標(biāo)均符合其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，說明這兩種飲片在常溫條件下質(zhì)量穩(wěn)定，在常溫條件下可貯藏24個(gè)月。

本文首次對不同基原、不同批次的兩種俄色葉飲片從外觀性狀、顯微特征、薄層色譜、水分、灰分、浸出物、總黃酮以及根皮素含量等進(jìn)行了研究，擬定了俄色葉飲片質(zhì)量控制指標(biāo)，為俄色葉飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定奠定了基礎(chǔ)，能夠有效保障俄色葉飲片質(zhì)量的穩(wěn)定、可控，同時(shí)也為俄色資源的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了科學(xué)支撐。