藻類誘變育種技術(shù)研究進(jìn)展

付峰 隋正紅 孫利芹 畢璐萍 丁麗君 陳奇

（1. 煙臺(tái)大學(xué)海洋學(xué)院，煙臺(tái) 264005；2. 中國(guó)海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，青島 266003；3. 煙臺(tái)大學(xué)生命學(xué)院，煙臺(tái) 264005）

藻類是水生生態(tài)系統(tǒng)中主要的初級(jí)生產(chǎn)者，在整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)中具有舉足輕重的地位，它們?cè)谌蚨趸脊潭ê铜h(huán)境修復(fù)中起著十分重要的作用。同時(shí)藻類與人類生活及經(jīng)濟(jì)發(fā)展也有著密切的關(guān)系，藻類分布廣泛且具有多樣性，許多藻類富含蛋白質(zhì)、維生素、微量元素以及各種生物活性物質(zhì)等，是人類的重要營(yíng)養(yǎng)源，是人類發(fā)展“藍(lán)色農(nóng)業(yè)”的基礎(chǔ)。

隨著藻類養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，種質(zhì)成了決定養(yǎng)殖質(zhì)量和產(chǎn)量的關(guān)鍵問題。應(yīng)用傳統(tǒng)的育種方法如選擇育種、雜交育種等，培育出了一系列的優(yōu)良品系或品種，推動(dòng)了我國(guó)海藻養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。然而傳統(tǒng)育種具有育種周期長(zhǎng)、性狀不穩(wěn)定等缺點(diǎn)，限制了藻類遺傳育種的研究進(jìn)展。藻類誘變育種技術(shù)是近些年隨著生物技術(shù)發(fā)展起來(lái)的育種技術(shù)，它是指利用各種物理和化學(xué)因素誘發(fā)藻體產(chǎn)生遺傳變異，再根據(jù)育種目標(biāo)，定向選擇、培育新品種，同時(shí)獲得有價(jià)值的突變?cè)弩w的育種方法［1］。在自然條件下，藻類自發(fā)突變的頻率很低，而人工誘變可使突變率提高千倍以上，能有效地提高育種的效率，是人工獲得新種質(zhì)的重要手段。藻類誘變育種技術(shù)在提高產(chǎn)量、改善品質(zhì)、增強(qiáng)抗性等方面已顯示出巨大潛力［2］。

誘變育種技術(shù)根據(jù)不同作用機(jī)理，主要包括物理誘變和化學(xué)誘變。物理誘變是通過(guò)不同的輻射源對(duì)植物進(jìn)行電離或非電離輻射，是一種應(yīng)用比較早、操作方便、誘變頻率較高的誘變技術(shù)；化學(xué)誘變是利用化學(xué)誘變劑誘導(dǎo)植物發(fā)生突變，具有成本低、使用方便、誘變作用專一性強(qiáng)等特點(diǎn)，是一種迅速發(fā)展的育種方法。本文就這兩類誘變技術(shù)的誘變機(jī)理、生物學(xué)效應(yīng)以及在藻類育種中的應(yīng)用情況進(jìn)行了綜述，并對(duì)藻類誘變育種的應(yīng)用前景進(jìn)行了展望，以期為藻類誘變育種研究提供參考。

1 物理誘變育種

物理誘變輻射源有紫外線、X射線、γ射線、α射線、重離子束、超聲波和激光等。其中對(duì)藻類誘變效果好，應(yīng)用較廣泛的有紫外線、X射線、γ射線和離子束。

1.1 紫外線

紫外線是一種非電離輻射，是使用最早、沿用最久、應(yīng)用最廣泛的一種物理誘變劑。紫外線可引起DNA與蛋白質(zhì)的交聯(lián)、胞嘧啶與尿嘧啶之間的水合作用、DNA鏈的斷裂、形成嘧啶二聚體等，從而導(dǎo)致基因突變。而形成嘧啶二聚體是產(chǎn)生突變的主要原因；嘧啶二聚體不僅可以由單鏈上相鄰的兩個(gè)胸腺嘧啶之間反應(yīng)后形成，也可以產(chǎn)生于雙鏈相對(duì)應(yīng)的兩個(gè)胸腺嘧啶之間［3］。

紫外誘變因?yàn)槠湓O(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便，而且成本低、安全性高等特點(diǎn)，得到了廣泛的應(yīng)用，成為誘變育種的首選方法。紫外線誘變?cè)谖⒃逵N中應(yīng)用的比較多，獲得了大量具有優(yōu)良性狀的突變?cè)逯?，具有較好的誘變效果［4-5］。de Jaeger等［6］通過(guò)紫外線輻射斜生柵藻得到了5株缺乏淀粉的突變?cè)逯?，它們的三酰甘油（TAG）含量顯著提高，其中最有前景的一株突變體的TAG含量可以達(dá)到藻體干重的49.4%。為了提高誘變效率，有的研究者采用了多次紫外輻射誘變，結(jié)合高通量的篩選方法。Lim［7］等通過(guò)5輪紫外誘變Tetraselmis suecica，結(jié)合熒光激活的細(xì)胞分選法，獲得了中性脂含量明顯提高（分別提高了114%和123%）的兩株藻M5和M24，有望作為生物柴油制備的原料。

在大型海藻育種中也有紫外誘變研究的報(bào)道，但是由于紫外線對(duì)藻體組織的穿透能力有限，通常是用藻體的原生質(zhì)體、孢子、配子或幼嫩的葉狀體做為材料進(jìn)行誘變［8］。付峰［9］等用紫外線輻射處理野生型龍須菜果孢子體放散剛附著的果孢子，并通過(guò)高溫脅迫篩選，初步獲得了2株具有耐高溫、生長(zhǎng)快速等優(yōu)良性狀的四分孢子體突變?cè)逯?，研究顯示剛放散的果孢子對(duì)于紫外線輻射非常敏感，紫外輻射果孢子是龍須菜的一種有效的誘變育種方法。Godfroy等［10］利用紫外線輻射和EMS兩種方法對(duì)水云進(jìn)行誘變，利用基因組重測(cè)序，比較這兩種方法引起突變的數(shù)目、類型和分布，發(fā)現(xiàn)紫外輻射能夠引起更大量的遺傳損傷，在突變個(gè)體的基因組中發(fā)現(xiàn)有多于400處突變，研究顯示了紫外線誘變適合用于定向誘導(dǎo)基因組局部突變（TILLING）技術(shù)體系。

1.2 射線

射線輻射源包括X射線、γ射線、α射線或β射線等。輻射可以造成共價(jià)鍵斷裂，引起DNA鏈的斷裂，當(dāng)修復(fù)時(shí)不能恢復(fù)到原狀就會(huì)產(chǎn)生突變。如果射線擊中染色體則可能導(dǎo)致斷裂，再修復(fù)時(shí)會(huì)造成缺失、重復(fù)、倒位和易位等染色體畸變［3］。

藻類輻射育種早期主要以X射線為誘變?cè)?，后期γ射線、α射線和β射線等其他射線輻射應(yīng)用逐漸增多。20世紀(jì)70年代培育出的海帶新品種1170是經(jīng)過(guò)4 000 r的X射線處理后，又經(jīng)過(guò)篩選和自交獲得的品系，含碘量較高，葉片較厚，適溫性較高［11］。魏慧慧等［12］采用X射線對(duì)龍須菜進(jìn)行輻照誘變，驗(yàn)證了果孢子作為誘變材料相對(duì)于龍須菜藻尖的優(yōu)越性，并篩選獲得了具有耐高溫和低磷速生特性的龍須菜抗逆突變體。

γ射線具有很強(qiáng)的穿透力，是目前藻類育種中最常使用的輻射誘變?cè)粗弧hoi等［13］利用γ射線輻射柵藻，用尼羅紅染色方法篩選獲得了生長(zhǎng)快速、高油脂含量的突變體，油脂含量比野生型提高了25%，隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA分析顯示突變體中發(fā)生了部分遺傳修飾，二維蛋白質(zhì)電泳也顯示，在突變體中有關(guān)油脂合成和能量代謝的一些蛋白質(zhì)過(guò)表達(dá)，研究證實(shí)射線育種可以用來(lái)有效開發(fā)生物燃料微藻。Yoon等［14］利用γ射線輻射異形水綿，得到了生物量和淀粉含量提高的突變株，對(duì)其進(jìn)行蛋白組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，有18個(gè)差異表達(dá)蛋白與光合、碳水化合物等代謝通路相關(guān)。

條斑紫菜和壇紫菜是我國(guó)大規(guī)模養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)品種，紫菜色素含量的高低決定著商品紫菜質(zhì)量的好壞，同時(shí)色素突變體對(duì)于紫菜的遺傳學(xué)，生理學(xué)和育種學(xué)等方面的研究，以及對(duì)于養(yǎng)殖品種的改良都具重大意義［15］。因此國(guó)內(nèi)外的研究者陸續(xù)開展了誘變獲得紫菜人工色素突變體的研究。嚴(yán)興洪等［15-16］利用60Co-γ射線分別對(duì)壇紫菜葉狀體和條斑紫菜殼孢子苗進(jìn)行誘變，分離獲得了多種色素突變體，各色素突變品系的葉狀體活體吸收光譜不僅與野生型品系有明顯的差異，而且各突變品系之間也存在較大的差異。

除了色素突變體的研究，在紫菜抗逆速生新品種的誘變遺傳育種方面，也取得了一定的成果。陳昌生等［17］將壇紫菜野生絲狀體經(jīng)一定劑量60Co-γ射線輻照后，進(jìn)一步培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)子代葉狀體發(fā)生了變異，經(jīng)大量培養(yǎng)后篩選出紫色突變體，以及在生長(zhǎng)速度和蛋白含量等方面比對(duì)照組都有顯著提高的優(yōu)良個(gè)體。Zhang等［18］利用60Co-γ射線誘變條斑紫菜原生質(zhì)體細(xì)胞，結(jié)合高溫脅迫篩選，獲得了耐高溫突變株T-17，其生長(zhǎng)速度明顯高于野生型。Chen等［19］利用60Co-γ射線誘變Porphyra chauhanii野生品系葉狀體，結(jié)合高溫脅迫篩選，獲得了生長(zhǎng)快速的耐高溫突變株 TR-5，分析顯示該藻株三種主要光合色素（葉綠素a、藻紅蛋白和藻藍(lán)蛋白）的含量明顯高于野生型，藻體葉片比野生型薄。

1.3 重離子束

針對(duì)傳統(tǒng)輻射源的突變頻率較低和突變隨機(jī)性較大等問題，人們又發(fā)掘和利用了新的誘變因素及誘變技術(shù)，其中重離子輻射技術(shù)發(fā)展迅速。重離子束具有傳能線密度（Linear energy transfer，LET）高的特點(diǎn)，與X 射線、γ射線、電子束等低LET方法相比，重離子束單位劑量的誘變效率要高10倍，已經(jīng)在微生物及植物誘變育種中取得了巨大的經(jīng)濟(jì)與社會(huì)效益。重離子束輻照主要是引起DNA 鏈發(fā)生各種斷裂及交聯(lián)，進(jìn)而誘發(fā)細(xì)胞突變［20］。重離子束輻射需要特殊的儀器設(shè)備，是一種新型的輻射源，在藻類誘變育種中的應(yīng)用不如紫外線和γ射線廣泛，但是也顯示出其良好的前景。

近些年重離子束輻射在微藻育種中主要應(yīng)用在產(chǎn)油微藻方面。王芝瑤等［21］利用碳離子束對(duì)微擬球藻進(jìn)行誘變育種，最終獲得兩株突變?cè)逯闔P-1 和HP-2，其生長(zhǎng)速度和油脂產(chǎn)率均明顯高于野生型藻株。Hu等［22］利用碳離子束輻射結(jié)合葉綠素?zé)晒夥椒?，篩選獲得了一株鏈帶藻Desmodesmussp. S1突變株，其油脂產(chǎn)量比野生型高20.6%，而且重離子束對(duì)該藻的突變率可以達(dá)到28.5%，說(shuō)明重離子束輻射對(duì)微藻的誘變是非常有效的。Wang等［23］利用碳離子輻照羊角月牙藻后，分離獲得了5個(gè)葉綠素a缺陷的子代，分析它們的光合作用特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)光合效率、光保護(hù)能力和光捕獲天線的表達(dá)都受到輻射的顯著影響，這也是碳離子束輻射引起綠藻光合色素改變研究的首次報(bào)道，為揭示重離子束輻射誘變機(jī)制提供了研究基礎(chǔ)。

在紫菜和海帶中也有重離子束輻射誘變的研究，顯示出其在大型海藻中的應(yīng)用潛力。Niwa等［24］利用碳離子束輻照條斑紫菜配子體葉片，誘導(dǎo)獲得了色素突變體，并對(duì)其中紅色和綠色突變體的生長(zhǎng)和光合色素含量與野生型進(jìn)行了對(duì)比，顯示重離子束誘變是一種紫菜遺傳育種研究的有效方法。魯曉萍［25］對(duì)條斑紫菜絲狀體進(jìn)行重離子束輻照誘變，并利用SSR分子標(biāo)記分析突變體的遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)誘變絲狀體間的遺傳多樣性較高，說(shuō)明誘變可以有效豐富條斑紫菜的種質(zhì)資源。李曉捷等［26］利用碳離子束對(duì)海帶進(jìn)行輻射育種，對(duì)正向變異幅度大的候選植株進(jìn)行DNA變異檢測(cè)，將表型性狀和品質(zhì)性狀明顯改良并且DNA結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變異的植株作為新品種選育的育種材料，研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)重離子輻射可誘導(dǎo)海帶配子體產(chǎn)生大量變異，能在較短的時(shí)間內(nèi)獲得優(yōu)良變異植株，獲得與優(yōu)良性狀相關(guān)的新基因源。

1.4 常壓室溫等離子體

常壓室溫等離子體（Atmospheric and room temperature plasma，ARTP）作為一種新興的高效生物突變手段，具有放電均勻、活性粒子濃度高、化學(xué)活性物種可調(diào)控性好、操作簡(jiǎn)單、安全性高、環(huán)境友好、突變速度快、突變率高及突變多樣性大等特點(diǎn)［27］。目前該技術(shù)已成功應(yīng)用于包括微生物和微藻的突變。

等離子體的主要組分是高濃度的活性粒子，能夠穿透細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，破壞DNA分子，引起突變，從而改變目標(biāo)生物的代謝途徑［27］。曹旭鵬等［28］利用ARTP技術(shù)對(duì)湛江等鞭金藻進(jìn)行誘變，建立一整套誘變株篩選方法，獲得了4株耐高光或高溫的藻株，常規(guī)培養(yǎng)條件下7株高生長(zhǎng)速率和5株高油脂含量的藻株。吳曉英等［29］通過(guò)等離子體誘變雨生紅球藻篩，成功篩選獲得一株生產(chǎn)性能穩(wěn)定的高產(chǎn)蝦青素藻株M45，該突變株生長(zhǎng)速率和生物量分別較出發(fā)株提高了8.57%和6.45%，蝦青素含量較出發(fā)株提高了51.96%。Fang等［30］利用ARTP技術(shù)對(duì)鈍頂螺旋藻進(jìn)行誘變，獲得3株有代表性的誘變株，有效地提高了生長(zhǎng)速率或多糖含量，也證明了ARTP技術(shù)對(duì)于多細(xì)胞微藻是一種有效的誘變技術(shù)。

2 化學(xué)誘變育種

目前烷化劑是藻類誘變育種中最有效和應(yīng)用最多的化學(xué)誘變劑。這類誘變劑具有一個(gè)或多個(gè)活性烷基，它們易取代DNA分子中活潑的氫原子，直接與一個(gè)或多個(gè)堿基起烷化反應(yīng)，從而改變DNA分子結(jié)構(gòu)，引起突變［3］。相對(duì)于物理誘變，化學(xué)誘變對(duì)處理材料引起的生物損傷小，誘發(fā)染色體畸變的比率相對(duì)較小，誘發(fā)位點(diǎn)具有特異性，誘發(fā)突變多是基因的點(diǎn)突變［31］。應(yīng)用比較多的化合物是甲基磺酸乙酯（Ethyl methanesulphonate，EMS）和N-甲基-N-硝基-N-亞硝基胍（N-methyl-N’-Nitronitrosoguanidine，MNNG）等。

近些年EMS和 MNNG誘變?cè)谖⒃逯袘?yīng)用廣泛，主要利用其誘導(dǎo)產(chǎn)生代謝產(chǎn)物過(guò)表達(dá)的突變體，如蝦青素、類胡蘿卜素和二十碳五烯酸（EPA）［32］等。Ong等［33］利用EMS誘變小球藻獲得了兩株耐熱突變體，在高溫（40℃）培養(yǎng)時(shí)的生長(zhǎng)速度比野生型快3.3-6.7倍，固碳速率明顯高于野生型。Perin等［34］利用EMS和插入突變技術(shù)對(duì)微擬球藻Nannochloropsis gaditana進(jìn)行了隨機(jī)誘變，篩選獲得了光利用效率和產(chǎn)量明顯提高的藻株，顯示了誘變導(dǎo)致的遺傳改變具有產(chǎn)生高產(chǎn)量微擬球藻的潛能。Shirnalli等［35］利用MNNG誘變，獲得了2株高生物量、高藻藍(lán)蛋白和蛋白質(zhì)含量的鈍頂螺旋藻突變株。Sandesh等［36］利用紫外線、EMS和MNNG對(duì)雨生紅球藻進(jìn)行誘變，并利用除草劑草銨膦進(jìn)行突變株的篩選，獲得的突變株總類胡蘿卜素和蝦青素含量提高了23%-59%，從轉(zhuǎn)錄水平上分析發(fā)現(xiàn)類胡蘿卜素合成途徑相關(guān)基因的表達(dá)均明顯高于野生型，其中紫外誘變獲得的突變體的番茄紅素環(huán)化酶活性最高，其次是MNNG誘變的突變體，研究揭示了誘變可以改變野生型藻體的生化特征，主要是由于其分子水平上的改變。

MNNG對(duì)于龍須菜來(lái)說(shuō)是一種高效誘變劑。張學(xué)成等［37］利用MNNG誘變處理龍須菜藻體，通過(guò)羥脯氨酸及高溫（35℃）篩選，獲得了龍須菜良種981，近些年又用同樣的方法，對(duì)981龍須菜進(jìn)行了進(jìn)一步的遺傳改良。研究發(fā)現(xiàn)紫菜比江蘺等海藻更難被一般的化學(xué)誘變劑所誘變。經(jīng)過(guò)國(guó)內(nèi)外學(xué)者數(shù)年來(lái)的努力，在紫菜色素突變體的誘導(dǎo)和分離中取得了一定的成果，MNNG被證明是最有效的化學(xué)誘變劑。利用MNNG對(duì)條斑紫菜、壇紫菜等紫菜屬種類的生活史中各階段的藻體，如絲狀體［38］、殼孢子［39］、葉狀體［40］等進(jìn)行誘變處理，成功地得到了大量的色素突變體，并分析了誘變獲得的突變體的色素組成和變化特征。

3 展望

大量實(shí)踐證明，誘變技術(shù)在創(chuàng)造新種質(zhì)，培育植物新品種，提高種質(zhì)資源多樣性等方面具有獨(dú)特的作用。高等植物中誘變技術(shù)育種已取得了舉世矚目的成就，育成品種的數(shù)量、種植面積和取得的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)效益均居世界各國(guó)首位［41］。藻類誘變育種工作起步較晚，目前研究主要集中在雨生紅球藻、小球藻、鈍頂螺旋藻等生物活性物質(zhì)含量較高的微藻，以及一些生物能源微藻中，旨在提高藻體的代謝物質(zhì)含量和產(chǎn)量，取得了不俗的成績(jī)，篩選獲得了大量的具有優(yōu)良性狀的變異藻株。近些年誘變技術(shù)也逐漸應(yīng)用到一些大型經(jīng)濟(jì)海藻的色素突變體和優(yōu)良品種的遺傳選育方面。傳統(tǒng)的物理和化學(xué)誘變技術(shù)，結(jié)合目前新的誘變?cè)慈珉x子束、常壓室溫等離子體等誘變技術(shù)，正越來(lái)越多地應(yīng)用到藻類育種中，在藻類種質(zhì)改良和遺傳學(xué)研究中起到重要的作用。

在誘變育種中，突變是隨機(jī)的，能夠產(chǎn)生大量的突變體，篩選具有目標(biāo)性狀的突變體是費(fèi)時(shí)費(fèi)力的，因此建立高通量的突變體篩選方法，將有利于獲得有益變異的藻株。傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)特征和生理生化分析的方法已經(jīng)很難滿足現(xiàn)代藻類種質(zhì)鑒定和新品種選育的要求。分子標(biāo)記技術(shù)的出現(xiàn)為這一問題的解決帶來(lái)了契機(jī)，利用分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)突變體進(jìn)行分析、鑒定篩選，可以有效提高選擇效率［42］。將生化分析、物理學(xué)分析以及分子標(biāo)記輔助等篩選方法有效結(jié)合，逐步建立目標(biāo)突變體的定向篩選技術(shù)，這也是今后藻類誘變育種研究的重要內(nèi)容。

與常規(guī)育種方法相比，藻類誘變育種是一種高效的育種手段，具有操作簡(jiǎn)單、效率高等優(yōu)點(diǎn)，可以在短時(shí)間內(nèi)帶來(lái)豐富的遺傳變異。但誘變育種也存在一些不足，如誘變的頻率和幅度還不夠高、誘變的方向具有不確定性、誘變的效果不理想。要解決這一問題，就必須根據(jù)藻類的生物學(xué)特性，借鑒高等植物成熟的誘變育種體系，選用合適的誘變方法，選擇適宜的誘變材料，擴(kuò)大誘變?nèi)后w，建立高效的篩選技術(shù)，獲得優(yōu)良的新種質(zhì)。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，充分利用分子遺傳學(xué)和基因工程相關(guān)技術(shù)，在分子水平上揭示突變的發(fā)生機(jī)理，使定向誘變成為可能，實(shí)現(xiàn)藻類育種的高效發(fā)展。