抗菌肽在洗發(fā)液中防腐效能及安全性評(píng)價(jià)初探

桂銀雪 楊娜 滕達(dá)2， 王秀敏2， 毛若雨2， 郝婭2，滕國(guó)新 王建華2，

（1. 北京城市學(xué)院航天城校區(qū)生物醫(yī)藥學(xué)部，北京 100094；2. 北京生泰云科技有限公司研發(fā)中心，北京 100081；3. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部飼料生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，北京 100081；4. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所基因工程研究室，北京 100081）

洗發(fā)、護(hù)發(fā)類化妝品是人們?nèi)粘Ｉ钪械谋貍溆闷?。隨著人們對(duì)不同功能產(chǎn)品的需求，氨基酸、蛋白質(zhì)、植物提取物等多種營(yíng)養(yǎng)成分被添加到洗/護(hù)發(fā)產(chǎn)品中，同時(shí)也為微生物的生長(zhǎng)提供了有利條件［1］?！痘瘖y品安全技術(shù)規(guī)范》（2015年版）規(guī)定，每克或每毫升化妝品中不得檢出糞大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌［2］。因此防腐劑在防止化妝品污染，尤其在二次污染中起到了舉足輕重的作用。然而研究表明，在防腐劑使用中居于首位的對(duì)羥基苯甲酸酯（尼泊金酯類），會(huì)由于接觸性過(guò)敏而引起皮膚損傷和皮炎癥狀發(fā)生，同時(shí)它還能夠促進(jìn)脂肪形成，可能是造成肥胖流行的因素之一［3-5］。此外，許多微生物對(duì)現(xiàn)在廣泛使用的防腐劑，包括尼泊金甲酯、卡松、布羅波爾等都具有抗藥性［6-7］。2014年，歐盟已禁止將尼泊金酯類防腐劑添加到化妝品中。因此，研究和開發(fā)防腐效果、無(wú)毒副作用的化妝品防腐劑特別是洗發(fā)類產(chǎn)品的防腐劑已成為化妝品行業(yè)研發(fā)熱點(diǎn)。

抗菌肽是一類小分子多肽，是生物免疫防御系統(tǒng)的重要組成部分，具有抗菌譜廣、熱穩(wěn)定性好、分子量小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單及兩親性和強(qiáng)陽(yáng)離子性等優(yōu)點(diǎn)?？咕囊志鷻C(jī)理獨(dú)特，常以多靶位點(diǎn)共同作用的方式進(jìn)行殺菌，因而病原菌很難通過(guò)改變細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)而產(chǎn)生抗性［8］。另外，抗菌肽作為天然多肽類抗菌物質(zhì)，對(duì)人體更加安全，如乳酸菌素（Nisin）已被作為天然防腐劑而廣泛應(yīng)用于食品領(lǐng)域［9］。因此，本研究主要通過(guò)體外抗菌實(shí)驗(yàn)檢測(cè)抗菌肽對(duì)洗發(fā)液中主要污染細(xì)菌及皮膚常駐菌群金黃色葡萄球菌、大腸桿菌群和銅綠假單胞菌的抑制作用，研究抗菌肽在洗發(fā)液中的防腐效力，并且對(duì)抗菌肽的安全性能進(jìn)行評(píng)估，為替代洗發(fā)液及關(guān)聯(lián)產(chǎn)品中尼泊金甲酯等常規(guī)防腐劑進(jìn)行前期探索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株 大腸桿菌（Escherichia coli，E.coli）CVCC195和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S. aureus）ATCC25923購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，P.aeruginosa）CICC10419購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 細(xì)胞及小鼠 Hacat人永生化表皮細(xì)胞（北京協(xié)和醫(yī)院）；6周齡SPF級(jí)SD雌鼠（180 g/只）（北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司）。

1.1.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑 抗菌肽：N2和N6強(qiáng)耀生物有限公司合成，NZ2114和DLP4來(lái)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所基因工程室；椰油酸單乙醇酰胺（CMEA）、椰油基二乙酸酰胺（65011∶1）、珠光漿、檸檬酸、陽(yáng)離子瓜爾膠（C-14S）、（廣州市雨露化工有限公司）、對(duì)羥基苯甲酸甲酯（尼泊金甲酯）（浙江圣效化學(xué)品有限公司）；MH 瓊脂培養(yǎng)基；DMEM 培養(yǎng)基（JIBCO），2′，7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽（DCFH-DA（Sigma）。

1.1.4 主要實(shí)驗(yàn)儀器 高速冷凍臺(tái)式離心機(jī)，全溫振蕩培養(yǎng)箱，自電熱壓力蒸汽滅菌鍋，pH計(jì)，流式細(xì)胞儀，二氧化碳培養(yǎng)箱。

1.2 方法

1.2.1 抗菌肽最小抑菌濃度（MIC）測(cè)定 參照臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（Clinical and laboratory standards institute，CLSI）制定的操作方法［10］，即將受試菌株的單菌落挑至MH液體培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)活化后，轉(zhuǎn)接至MH液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（OD600nm = 0.4-0.6），然后制備成105CFU/mL的菌液，加入96孔無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，每孔90 μL。抗菌肽用PBS通過(guò)2倍倍比法進(jìn)行稀釋，每孔10 μL抗菌肽，使其終濃度分別為 0.0625、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64、128和 256 μg/mL，陰性對(duì)照組為PBS代替抗菌肽的受試菌液，空白對(duì)照組為無(wú)菌MH培養(yǎng)基。每個(gè)處理3個(gè)平行樣。將培養(yǎng)板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱孵育16-18 h，直至陰性對(duì)照孔出現(xiàn)肉眼可見的明顯渾濁菌液，能夠完全抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低濃度即為抗菌肽對(duì)受試菌株的MIC值。

1.2.2 抗菌肽殺菌曲線的測(cè)定 受試菌過(guò)夜活化后轉(zhuǎn)接至MH液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，然后制備成105CFU/mL的菌液。加入抗菌肽溶液，使其終濃度分別為1倍、2倍和4倍 MIC，37℃，250r/min培養(yǎng)。同時(shí)，加入相同體積的生理鹽水和1×倍MIC濃度的尼泊金甲酯分別作為對(duì)照組。在0、0.5、1、2、3、4、6、8、10 和 24 h 時(shí)間點(diǎn)分別取 100 μL菌液樣品后進(jìn)行10倍梯度稀釋，涂板計(jì)數(shù)，繪制時(shí)間-殺菌曲線。

1.2.3 洗發(fā)液基礎(chǔ)配方的配制 將陽(yáng)離子瓜爾膠（0.3%）加入無(wú)菌燒杯中，用100倍去離子水溶解備用；椰油酸單乙醇酰胺（CMEA）（6%）和椰油基二乙酸酰胺（65011∶1）（6%）加入燒杯加熱到70-80℃熔化備用；去離子水（84%）加入燒杯加熱到50℃，加入椰油酸單乙醇酰胺（CMEA）、椰油基二乙酸酰胺（65011∶1）、珠光漿（3.5%）、陽(yáng)離子瓜爾膠攪拌2 h；加入檸檬酸（0.2%）攪拌1 h；冷卻至30-40℃后分裝［11］。本實(shí)驗(yàn)受試配方pH為6.5。

1.2.4 抗菌肽在洗發(fā)液中殺菌效果的測(cè)定 將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的受試菌，用新鮮的MH培養(yǎng)基稀釋，控制菌量在5×107-5×108CFU/mL，作為測(cè)試菌液。取若干份制備好的洗發(fā)水9 g于無(wú)菌錐形瓶中，加入1 mL細(xì)菌懸液并充分?jǐn)嚢杈鶆颍謩e加入不同濃度的NZ2114、N2和尼泊金甲酯混勻后封口膜封好，加入1 mL生理鹽水組作為空白對(duì)照，然后將樣品靜置在30℃條件下，于接種后第1、2、5、7和14天分別測(cè)樣品中活細(xì)菌含量［12］。

1.2.5 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)采用MTT比色法，參照實(shí)驗(yàn)手冊(cè)［13］，步驟略有改動(dòng)。HaCaT以2.5×l05cell/mL密度接種于96孔板中，每孔100μL，設(shè)置3個(gè)重復(fù)。24 h后移除培養(yǎng)基，每孔按濃度梯度加入 100 μL濃度為 0.5、1、2、4、8、16、32、64、128 μg/mL 樣品肽，對(duì)照孔加等量的 PBS 溶液。繼續(xù)孵育24 h后，移除培養(yǎng)基，PBS洗兩次，每孔中加入100 μL濃度為5 mg/mL的MTT（避光操作）。將96孔板移至培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h，而后吸棄MTT液，加入150 μL DMSO，微量振蕩器振蕩10 min待孔底結(jié)晶完全溶解后，使用酶標(biāo)儀570 nm波長(zhǎng)處測(cè)各孔吸光度即OD值。根據(jù)以下公式計(jì)算細(xì)胞存活率：存活率（%）=處理組OD 值/對(duì)照組OD值×100%。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞活性氧 利用熒光探針DCFH-DA 檢測(cè)細(xì)胞內(nèi) ROS 的形成。HaCaT細(xì)胞分別用80 μg/mL的N2和NZ2114，2 mg/mL的尼泊金甲酯作用4 h后，用 PBS 洗兩次，每組細(xì)胞加入 20μM 的 DCFH-DA，在 37oC下孵育 30 min，吸棄上清，然后用胰酶消化，PBS 洗兩次后立即用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng) 488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)525 nm，每次記數(shù)1×104個(gè)細(xì)胞。

1.2.7 小鼠皮膚刺激性實(shí)驗(yàn) 取6周齡SPF級(jí)SD雌鼠一只，將其背部毛剪短后使用8%的硫化鈉將老鼠背部的毛脫盡，分區(qū)域滴100 μL 濃度為80μg/mL的N2和NZ2114，2 mg/mL的尼泊金甲酯，以無(wú)菌水和30% SDS作為對(duì)照組。敷用4 h后用溫水清洗殘留的藥物，于清洗后的 1、24、48 h觀察涂抹部位皮膚反應(yīng)，按表 1進(jìn)行皮膚刺激反應(yīng)評(píng)分判斷皮膚刺激強(qiáng)度，48 h觀察后，取小鼠皮膚組織，制備切片并在顯微鏡下觀察病理學(xué)變化。

表1 皮膚刺激反應(yīng)評(píng)分

2 結(jié)果

2.1 抗菌肽最小抑菌濃度（MIC）測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)所用4種抗菌肽分別來(lái)自不同生物體，均由本小組前期工作創(chuàng)制制備［14-16］。NZ2114是由真菌防御素Plectasin突變而來(lái)的抗菌肽，DLP4是從黑水虻中分離出來(lái)的昆蟲防御素，N2和N6是海蚯蚓抗菌肽NZ17074的突變體，它們的序列及理化性質(zhì)如表2所示。

測(cè)定抗菌肽和尼泊金甲酯對(duì)洗發(fā)水主要污染細(xì)菌的MIC值，結(jié)果如表3所示，尼泊金甲酯對(duì)E.coliCVCC195、P. aeruginosaCICC10419和S. aureusATCC25923的MIC值均為2 mg/mL，N2，N6對(duì)E.coliCVCC195和P. aeruginosaCICC10419的抗菌活性是尼泊金甲酯的1 000-2 000和125倍（MIC值分別 為 1 μg/mL 和 16 μg/mL），NZ2114和 DLP4對(duì)S.aureusATCC25923的抗菌活性是尼泊金甲酯的250和125倍（MIC值分別為8和16 μg/mL），抗菌肽的抗菌活性顯著優(yōu)于尼泊金甲酯，根據(jù)抗菌活性高低，選用N2和NZ2114分別進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表2 抗菌肽序列及理化性質(zhì)

表3 尼泊金甲酯及抗菌肽的最小抑菌濃度（MIC值）

2.2 抗菌肽殺菌曲線

通過(guò)體外殺菌-時(shí)間曲線來(lái)檢測(cè)不同濃度抗菌肽的殺菌能力。如圖1所示，N2對(duì)E. coliCVCC195和P. aeruginosaCICC10419抗菌效果隨濃度增加而增強(qiáng)，N2對(duì)E. coliCVCC195呈現(xiàn)出快速殺菌作用，1 μg/mL（1×MIC）N2在2 h內(nèi)殺菌率高達(dá)99.9%；N2對(duì)P. aeruginosaCICC10419的殺菌作用相對(duì)緩慢，64 μg/mL（4×MIC）在 3 h 內(nèi)可高效殺菌，16 μg/mL（1×MIC）處理組的活菌數(shù)持續(xù)減少至8 h，殺菌率達(dá) 到 99.9%；32 μg/mL（4×MIC） 濃 度 的 NZ2114對(duì)S. aureusATCC25923在1 h內(nèi)快速殺菌，8 μg/mL（1×MIC）在2 h 的殺菌率達(dá)到99.9%，且抗菌肽組24 h內(nèi)菌落數(shù)均未出現(xiàn)反彈；而2 mg/mL（1×MIC）的尼泊金甲酯只能抑制E. coli，P. aeruginosa和S.aureus的生長(zhǎng)，無(wú)法達(dá)到徹底殺菌的效果。

圖1 抗菌肽殺菌動(dòng)力學(xué)曲線

2.3 抗菌肽在洗發(fā)液中殺菌效果

通過(guò)測(cè)定抗菌肽在洗發(fā)液中的殺菌效果與常用防腐劑進(jìn)行比較。在接種5×108CFU/mLE. coliCVCC195的洗發(fā)水中分別添加5 μg/mL N2和1 mg/mL尼泊金甲酯（圖2-A），細(xì)菌生長(zhǎng)狀態(tài)與空白樣品組相似，沒有受到抑制，并有繁殖生長(zhǎng)趨勢(shì)。10 μg/mL N2組細(xì)菌數(shù)大約降低1.5個(gè)數(shù)量，20、40和80 μg/mL N2組1d內(nèi)殺菌率高達(dá)100%，且14 d檢測(cè)無(wú)反彈現(xiàn)象。當(dāng)添加2 mg/mL尼泊金甲酯時(shí)，洗發(fā)液中的細(xì)菌在7 d內(nèi)逐漸減少直至全部死亡。N2對(duì)接種5×107CFU/mLP. aeruginosaCICC10419的洗發(fā)水也具有快速殺菌作用（圖2-B），添加濃度為40 μg/mL 以上時(shí)，銅綠假單胞菌在1 d內(nèi)全部失活，10 μg/mL時(shí)5 d內(nèi)也可全部失活，當(dāng)添加2 mg/mL尼泊金甲酯時(shí)，5 d內(nèi)洗發(fā)液中的細(xì)菌全部死亡。N2在洗發(fā)液中殺滅大腸桿菌和綠膿桿菌效力分別比尼泊金甲酯高 7 倍和 5 倍，并且所需濃度遠(yuǎn)低于尼泊金甲酯。

圖2 抗菌肽在洗發(fā)液中菌效果測(cè)定

接種S. aureusATCC25923的洗發(fā)水空白樣品組細(xì)菌的生長(zhǎng)受到一定抑制，14 d后菌落數(shù)由2.5×107CFU/mL 減 少 到 2.5×105CFU/mL， 添 加 5 μg/mL NZ2114和1 mg/mL尼泊金甲酯時(shí)，細(xì)菌14 d內(nèi)完全失活，添加NZ2114濃度增加至10 μg/mL時(shí)，7 d內(nèi)洗發(fā)液中的細(xì)菌全部死亡；添加濃度大于20 μg/mL時(shí)，1 d內(nèi)殺菌效率即可達(dá)到100%；當(dāng)添加高濃度的尼泊金甲酯（2 mg/mL）時(shí)，1 d菌落數(shù)從2.5×107CFU/mL降到1×103CFU/mL，2 d細(xì)菌全部失活。這說(shuō)明抗菌肽N2和NZ2114對(duì)洗發(fā)水中主要污染細(xì)菌具有快速高效的殺菌作用，而且其有效抑菌（金黃色葡萄球菌）效力比傳統(tǒng)防腐劑至少高 200 倍以上。

2.4 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

如圖3所示，N2和NZ2114在0.5-64 μg/mL濃度下細(xì)胞的存活率均在90%以上，在高濃度128 μg/mL時(shí)，細(xì)胞的存活率也在85%以上，對(duì)細(xì)胞影響不明顯；而尼泊金甲酯在正常應(yīng)用濃度1-2 mg/mL時(shí)，細(xì)胞存活率僅為30%-50%，對(duì)細(xì)胞具有一定的細(xì)胞毒性。

圖3 HaCaT細(xì)胞毒性的測(cè)定

圖4 HaCaT細(xì)胞活性氧測(cè)定

2.5 抗菌肽對(duì)HaCaT細(xì)胞ROS的影響

通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)法，分析高濃度抗菌肽作用下HaCaT內(nèi)的活性氧水平。結(jié)果如圖4所示，空白對(duì)照組活性氧含量為11.9%，H2O2陽(yáng)性對(duì)照組活性氧含量為98.10%，尼泊金甲酯組活性氧含量為41.4%，是NZ2114和 N2活性氧水平的11.5和5.5倍（3.6%和7.5%），抗菌肽組不僅不會(huì)提高細(xì)胞內(nèi)活性氧水平，與對(duì)照組相比還具有輕微的抗氧化作用。

2.6 小鼠皮膚刺激性實(shí)驗(yàn)

如圖5-A所示，小鼠皮膚對(duì)照區(qū)和處理區(qū)觀察2 d后，僅30%SDS組有明顯紅斑刺激癥狀，根據(jù)表1 皮膚刺激反應(yīng)總積分為值為2分，N2、NZ2114和尼泊金甲酯區(qū)未見明顯異常，皮膚刺激反應(yīng)總積分值小于 0.5。

小鼠皮膚組織病理學(xué)觀察結(jié)果如圖5?？瞻讓?duì)照組小鼠皮膚組織（角質(zhì)層、表皮和真皮）結(jié)構(gòu)清晰，未見異常；30% SDS陽(yáng)性對(duì)照組的局部表皮可見濃腫，角質(zhì)層明顯角化過(guò)度，表皮棘層增厚，真皮炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，病變部位纖維組織增生，乳頭內(nèi)毛細(xì)血管擴(kuò)張；尼泊金甲酯組，可見表皮基底層胞漿空泡樣變，細(xì)胞核固縮，呈現(xiàn)凋亡樣改變，病變細(xì)胞分布于表皮，真皮結(jié)構(gòu)未見異常；N2處理組的皮膚組織結(jié)構(gòu)清晰，未見異常；NZ2114處理組有輕微表皮棘層增厚現(xiàn)象，其余未見異常。

圖5 小鼠皮膚刺激性實(shí)驗(yàn)

3 討論

抗菌肽作為天然多肽，通過(guò)破壞細(xì)菌的細(xì)胞壁，與細(xì)胞內(nèi)大分子物質(zhì)結(jié)合等多種途徑抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，且不易產(chǎn)生耐藥性。已有研究表明抗菌肽可以作為防腐劑應(yīng)用在化妝品，食品等領(lǐng)域［17-18］。防腐劑的主要作用是防治微生物污染，大腸埃希菌、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌是化妝品防腐效果評(píng)價(jià)用菌株，并且化妝品中禁止檢出［2］。本研究發(fā)現(xiàn)所選取的4種抗菌肽對(duì)大腸埃希菌、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌有不同程度的抑制效果。其中，NZ2114和DLP4是由6個(gè)半胱氨酸組成的CSαβ模體（Cysteine-stabilized alpha beta），主要針對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌具有較好的抗菌活性［15］，而N2和N6則是由兩個(gè)反向平行的折疊片層組成的β-折疊構(gòu)象，對(duì)革蘭氏陰性菌具有強(qiáng)抗菌活性，且N2的疏水活性比N6強(qiáng)（分別為0.521和0.375）（表2），具有更強(qiáng)的抗菌活性［16］。根據(jù)MIC結(jié)果可以更精確反應(yīng)4種抗菌肽之間殺菌效果的差異（表3）。N2對(duì)E.coliCVCC195的抗菌活性分別是N6和DLP4的2倍和16倍，而對(duì)P. aeruginosaCICC10419三種抗菌肽活性相同，NZ2114對(duì)革蘭氏陰性菌幾乎無(wú)殺菌效果，針對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌，尤其是S. aureus具有高效殺菌活性性（MIC 在 0.11-0.9 μmol/L 之間）［14］，且效果優(yōu)于DLP4，而Nisin同樣作為針對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌廣泛應(yīng)用的抗菌肽類食品防腐劑，其對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC為0.5-4.1 mg/L，抗菌活性遠(yuǎn)低于NZ2114［19］。此外，Nisin的溶解度和熱穩(wěn)定性與pH相關(guān)。Nisin在酸性環(huán)境下具有較高的溶解度和熱穩(wěn)定性，隨著pH升高，溶解度降低，熱穩(wěn)定性降低，當(dāng)pH＞7時(shí)，溶解度幾乎為0，而洗發(fā)水一般呈弱酸性，pH6左右，這對(duì)Nisin的溶解度和熱穩(wěn)定性影響較大［20-21］。所以選擇N2和NZ2114分別作為預(yù)防洗發(fā)水中大腸埃希菌、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的抗菌肽。

細(xì)菌在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生色素、釋放刺激性氣味、分解洗發(fā)水中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，造成產(chǎn)品變質(zhì)，另外金黃色葡萄球菌在生長(zhǎng)過(guò)程中釋放的外毒素會(huì)誘導(dǎo)皮膚細(xì)胞中IL-22大量表達(dá)，從而引起人過(guò)敏性皮炎癥狀發(fā)生，因此防腐劑的殺菌效率是影響產(chǎn)品質(zhì)量及人體健康的重要因素［22-23］。體外殺菌動(dòng)力學(xué)是衡量抗菌肽殺菌效率的主要指標(biāo)。N2和NZ2114在濃度為1倍MIC就可徹底殺菌，4倍MIC可以在1-3 h之內(nèi)快速殺滅99.9%的細(xì)菌，抑菌效率呈現(xiàn)濃度依賴性，且24 h未出現(xiàn)反彈現(xiàn)象（圖1）。尼泊金甲酯作為對(duì)照組，當(dāng)濃度為2 mg/mL（即0.2%添加）時(shí)對(duì)大腸桿菌、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌只能起到抑制作用但無(wú)法徹底殺滅菌株?！痘瘖y品安全技術(shù)規(guī)范》（2015年）規(guī)定尼泊金甲酯允許使用的最大濃度為0.4%，一般洗發(fā)水中的添加量約為0.2%，由此可知，在體外殺菌效率上，抗菌肽相較于常用的防腐劑具有明顯優(yōu)勢(shì)。在制備好的洗發(fā)水中進(jìn)行抗菌肽的防腐評(píng)估，殺菌效率與體外殺菌動(dòng)力學(xué)結(jié)果相似，均呈現(xiàn)濃度依賴性（圖3），且80 μg/mL的N2和NZ2114在1 d內(nèi)就可徹底殺死洗發(fā)水中的細(xì)菌，殺菌效率明顯優(yōu)于高濃度的尼泊金甲酯（N2對(duì)E. coliCVCC195和P. aeruginosaCICC10419的殺菌效率分別是尼泊金甲酯的7倍和5倍，NZ2114對(duì)S.aureusATCC25923的殺菌效率是尼泊金甲酯的2倍）。但是2 mg/mL的尼泊金甲酯在殺菌動(dòng)力學(xué)和洗發(fā)水殺菌實(shí)驗(yàn)中的殺菌效率有很大的差異，可能是由于本實(shí)驗(yàn)中配制的洗發(fā)水僅為基礎(chǔ)配方，不含有其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，不利于細(xì)菌的生長(zhǎng)，在添加尼泊金甲酯后比較容易造成細(xì)菌死亡［24］。

革蘭氏陰性菌在死亡過(guò)程中會(huì)釋放內(nèi)毒素，它可以造成多種組織器官損傷，嚴(yán)重時(shí)可引起內(nèi)毒素血癥，對(duì)健康造成嚴(yán)重影響，然而統(tǒng)計(jì)表明由于皮膚軟組織感染引起的內(nèi)毒素血癥高達(dá)70%-81.1%，所以在殺滅洗發(fā)水中革蘭氏陰性菌的同時(shí)清除內(nèi)毒素也是至關(guān)重要的［25］。研究表明N2不僅能夠快速殺死大腸桿菌，還可以在體內(nèi)體外中和內(nèi)毒素，降低內(nèi)毒素感染對(duì)小鼠體內(nèi)TNF-α，IL-1，IL-6的影響，提高小鼠存活率［16］。而尼泊金甲酯僅能通過(guò)改變細(xì)菌滲透性，使細(xì)菌體內(nèi)的酶類和代謝物逸出導(dǎo)致其失活，無(wú)法清除釋放出來(lái)的內(nèi)毒素［26］。因此，以40 μg/mL N2和20 μg/mL NZ2114進(jìn)行復(fù)配并添加到洗發(fā)水中，可達(dá)到快速高效殺菌作用。此外，還能中和內(nèi)毒素防止皮膚感染引起其他并發(fā)癥。

洗發(fā)水防腐劑不僅要達(dá)到防腐要求，還要對(duì)人體安全無(wú)害，才能發(fā)揮其使用價(jià)值。通過(guò)對(duì)HaCaT細(xì)胞毒性測(cè)定可知（圖3），N2和NZ2114在使用濃度時(shí)（40和20 μg/mL）幾乎無(wú)細(xì)胞毒性，而尼泊金甲酯在洗發(fā)水中添加濃度為2 mg/mL時(shí)，具有較強(qiáng)毒性（細(xì)胞存活率約為40%）?；瘜W(xué)試劑對(duì)細(xì)胞的損傷主要是引起細(xì)胞內(nèi)ROS的升高，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HaCaT細(xì)胞ROS水平（圖4），尼泊金甲酯的濃度為2 mg/mL時(shí)，細(xì)胞內(nèi)ROS水平是正常細(xì)胞的3.5倍，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)正常細(xì)胞ROS的代謝水平，對(duì)細(xì)胞造成不可逆的損傷。高濃度的 N2和NZ2114（80 μg/mL）沒有引起ROS水平的提高，反而略微低于正常細(xì)胞ROS水平，可能具有輕微的抗氧化作用。進(jìn)一步通過(guò)小鼠皮膚刺激性實(shí)驗(yàn)，更加直觀地分析評(píng)價(jià)防腐劑的安全性能，肉眼觀察抗菌肽與尼泊金甲酯作用后的小鼠皮膚（圖5-A），并無(wú)明顯變化，然而病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)尼泊金甲酯對(duì)小鼠細(xì)胞損傷分布于表皮，呈現(xiàn)凋亡樣改變，抗菌肽N2和NZ2114對(duì)皮膚無(wú)明顯影響（圖5）。其他學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，尼泊金甲酯不僅對(duì)人體正常皮膚角質(zhì)細(xì)胞存在傷害，還可能有引發(fā)乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)［4，27］。在體內(nèi)外研究表明，尼泊金甲酯對(duì)精子形成和激素分泌均會(huì)產(chǎn)生不利影響［28］。而抗菌肽作為外用防腐制劑對(duì)皮膚損傷的研究鮮有報(bào)道，因此，抗菌肽作為防腐劑添加到化妝品中更加安全。

4 結(jié)論

抗菌肽不僅具有高效的抗菌作用，而且夠中和細(xì)菌死亡過(guò)程中釋放的內(nèi)毒素，還具有一定程度的抗氧化作用，與化妝品中主要的防腐劑尼泊金甲酯相比抗菌肽在安全性能方面更具優(yōu)勢(shì)，是一種極具開發(fā)價(jià)值的體表洗浴潤(rùn)膚等日化產(chǎn)品專用天然防腐劑，作為當(dāng)下高質(zhì)量發(fā)展、供給側(cè)改革、美好生活建設(shè)的題中應(yīng)有之義，值得重視和期待［29-30］。