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    水脅迫下沙漠小球藻蛋白質(zhì)組學(xué)分析

    2018-11-07 08:58:50譚君牟云周光普周永順徐杰高劍峰
    生物技術(shù)通報(bào) 2018年10期
    關(guān)鍵詞:小球藻沙漠蛋白質(zhì)

    譚君 牟云 周光普 周永順 徐杰 高劍峰

    (石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,石河子 832003)

    資源、能源和環(huán)境是當(dāng)前人類社會(huì)發(fā)展面臨和必須解決的三大難題。目前,我國能源短缺,形勢嚴(yán)峻,石油等化石能源儲(chǔ)備嚴(yán)重不足,遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足經(jīng)濟(jì)和社會(huì)高速發(fā)展的需要,迫切需要從戰(zhàn)略角度發(fā)展新的可再生能源[1]。微藻已被作為重要的可再生能源資源,并已經(jīng)有許多研究報(bào)道了有關(guān)微藻的生物學(xué)特性。例如,運(yùn)用雙向電泳技術(shù)(2-DE)、研究了集胞藻(Synechocystissp. PCC 6803)的蛋白質(zhì)[2], 不同濃度 NaCl脅迫下魚腥藻(Anabaena doliolum)蛋白質(zhì)組學(xué)差異[3]以及紡錘形馬尾藻在鎘脅迫下的蛋白質(zhì)組分的差異[5]。利用2-DE、Western-blot等技術(shù)研究熱休克蛋白在逆境中誘導(dǎo)表達(dá)并證實(shí)了chaperonin 家族的一員HSP60蛋白可通過熱激的方式進(jìn)行誘導(dǎo)[7]。通過挑選單克隆及多克隆抗體來分析強(qiáng)壯前溝藻(Amphidinium carterae)膜骨架中兩種不同類型的骨架蛋白[8]。此外, Song等[4]研究了在正常和缺氮組球等鞭金藻在油脂積累過程中的蛋白組學(xué)變化。Simon等[6]通過質(zhì)譜分析鑒定了聚胞藻的192種可溶性蛋白。

    綜上可知,國內(nèi)外有關(guān)微藻蛋白質(zhì)組學(xué)的研究已有較大的突破,這不僅提高了人們認(rèn)識(shí)微藻及其生命過程的能力,也促進(jìn)了微藻生物柴油制備的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。與高等植物相比,有關(guān)微藻抗逆的蛋白組學(xué)研究就相對滯后;并且有關(guān)微藻蛋白組學(xué)研究大多集中在海洋藻類,對于沙漠藻類的干旱脅迫蛋白組學(xué)研究還未見報(bào)道。本研究基于前期建立了沙漠小球藻蛋白質(zhì)組雙向電泳體系[9],以小球藻為研究對象,改進(jìn)研究方法,從蛋白質(zhì)組學(xué)水平研究干旱脅迫下小球藻的蛋白質(zhì)表達(dá)特點(diǎn),旨在為探索沙漠小球藻應(yīng)答干旱脅迫的分子機(jī)制提供試驗(yàn)依據(jù),為沙漠微藻制備生物柴油的工廠化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    所用藻種(Chlorellasp.)由石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院細(xì)胞與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室從新疆塔克拉瑪干沙漠沙樣中分離、純化并鑒定。將藻種接種于BBM液體培養(yǎng)基中進(jìn)行活化,取活化后處于對數(shù)生長期的藻液以10%的接種量分別接種至BBM液體培養(yǎng)基和PEG6000添加量為20%的BBM液體培養(yǎng)基中培養(yǎng),光照強(qiáng)度4 000 lx,12 h光照,溫度為23℃。

    1.2 方法

    1.2.1 蛋白質(zhì)提取和定量試驗(yàn) 采用Trisol法[9-10]提取蛋白質(zhì)。取適量培養(yǎng)至對數(shù)生長期的藻液4℃6 000 r/min離心5 min,所得藻泥用ddH2O清洗3次,得鮮藻泥;經(jīng)液氮研磨,裝入1.5 mL離心管中,加入1 mL Trisol試劑,震蕩混勻,室溫靜置5 min;加入200 μL氯仿,充分混勻后靜置5 min,4℃ 12 000r/min離心15 min;棄上層無色液體后加入300 μL無水乙醇懸浮下層深紅色液體,4℃ 12 000 r/min離心5 min;轉(zhuǎn)移上清液至新的離心管中,加入1 mL異丙醇混勻,靜置20 min以沉淀蛋白,4℃ 12 000 r/min離心10 min,沉淀用95%乙醇清洗后空氣中干燥,待蛋白表面光滑后加入一定比例的裂解液溶解蛋白(干粉5 mg:50 μL),于30℃水浴中孵育2-4 h;4℃12 000 r/min離心30 min,所得上清液即為蛋白溶液。采用2D Quant Kit[10]定量蛋白質(zhì)。分別制備干旱后0、6、12、18、24和30 d的沙漠小球藻全蛋白,備用。

    1.2.2 雙向電泳檢測 雙向電泳體系為24 cm IPG膠條水化上樣量450 μg,在泡脹盤中對膠條進(jìn)行過夜被動(dòng)泡脹后,使用Ettan IPGphor3等電聚焦儀進(jìn)行第一向等電聚焦,程序設(shè)定為100 V 2 h;300 V 3 h;1 000 V 3 h;3 000 V 3 h;8 000 V 3 h;8 000 V,分別聚焦600 000 Vh、70 000 Vh、80 000 Vh;500 V,任意時(shí)間。分兩步平衡,每次15 min(平衡液Ⅰ含6 mol/L尿素、2%SDS、75 mmol/L Tris-HCL(pH8.8)、20% Glycetol(甘油)、0.0002% 溴酚藍(lán)和 1%DTT,平衡液Ⅱ含6 mol/L尿素、2%SDS、75 mmol/L Tris-HCL(pH8.8)、20% Glycetol( 甘 油 ) 和 2.5%Lodacetamide(碘乙酰胺)。使用EttanDaltSix垂直板電泳系統(tǒng),采用厚度為1 mm 12.5%SDS-PAGE分離膠進(jìn)行第二向SDS-PAGE蛋白電泳。按照以上方法對干旱脅迫后0、6、12、18、24和30 d的蛋白樣品進(jìn)行雙向電泳[9-10]。以 AgNO3染色法染色[11]。每個(gè)樣品進(jìn)行3次重復(fù),以獲得穩(wěn)定的差異電泳圖譜。

    1.2.3 差異蛋白的篩選 使用ImageScannerⅢ對圖像進(jìn)行掃描,并用Labscan軟件進(jìn)行照相,圖像分辨率300 dpi;用ImageMaster Platinum 7.0對掃描結(jié)果進(jìn)行分析,通過背景消減、蛋白質(zhì)點(diǎn)的檢測與匹配及差異表達(dá)量的比較后,將表達(dá)量上調(diào)或下調(diào)2倍以上的蛋白點(diǎn)視作表達(dá)量差異點(diǎn),經(jīng)ANOVA分析(P<0.05)且重復(fù)性較好的蛋白差異點(diǎn)。

    1.2.4 質(zhì)譜分析和數(shù)據(jù)庫檢索 從凝膠上挖去差異表達(dá)蛋白點(diǎn),委托上海生工生物工程股份有限公司完成膠內(nèi)酶解及質(zhì)譜分析;將得到的肽質(zhì)量指紋圖提交到Mascot(www.matrixscience.com)蛋白數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索參數(shù)設(shè)定如下:(1)Database:NCBInr;(2)species:Green plants;(3)Enzyme hydrolysates:Trypsin;(4)Fixed modification:Carbamidomethyl(C);(5)Variable modification:Acetyl(Protein N-term)、Deamidated(NQ)、Dioxidation(W)、Oxidation(M);(6)Peptide segment deviation:100 ppm[9]。 符 合質(zhì)譜要求的蛋白質(zhì)序列在Gene ontology數(shù)據(jù)庫中(http://amigo1.geneontology.org/cgi-bin/amigo/go.cgi)進(jìn)行功能分類。

    1.2.5 差異表達(dá)蛋白的生物信息學(xué)分析 根據(jù)小球藻NA64數(shù)據(jù)庫和網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫,BLAST鑒定所獲得的差異表達(dá)蛋白。用Agri GO進(jìn)行Gene Ontology(GO)注釋和富集分析[12],用OBAS進(jìn)行京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)代謝通路富集分析[13]。對沒有獲得GO注釋的蛋白,于文獻(xiàn)搜索和蛋白質(zhì)同源物手動(dòng)注釋。因單一工具分類并不能完全詮釋蛋白質(zhì)的功能,研究參照Bevan等[14]的標(biāo)準(zhǔn)對這些蛋白質(zhì)進(jìn)行分類。用STRING v10進(jìn) 行protein-protein interaction(PPI)網(wǎng)絡(luò)互作分析差異表達(dá)蛋白質(zhì)之間的關(guān)系[15],使用Cytoscape 2.8.3對網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行編輯[16]。

    2 結(jié)果

    2.1 沙漠小球藻雙向蛋白質(zhì)電泳分析

    基于前期的宏觀生理指標(biāo)和轉(zhuǎn)錄組組學(xué)的研究結(jié)果,沙漠小球藻在干旱脅迫后0、6、12、18、24和30 d存在較大的差異,其中第18天沙漠小球藻生長情況和油脂的合成明顯的升高。因此,以20%PEG 6000模擬干旱處理沙漠小球藻,選取0、6、12、18、24和30 d 6個(gè)時(shí)間點(diǎn),對干旱脅迫這6個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行全蛋白的提取并使用蛋白樣品進(jìn)行雙向電泳(圖1),在干旱脅迫后0、6、12、18、24和30 d,分別檢測到(1 098±21)、(1 033±19)、(1 036±32)、(1 026±22)、(1 021±16)、(1 030±25)個(gè)蛋白點(diǎn),同一處理的3塊重復(fù)膠之間蛋白點(diǎn)的匹配率高達(dá)90%。

    采用ImageMaster Platinum 7.0軟件分析干旱脅迫0、6、12、18、24和30 d的小球藻蛋白組學(xué)變化,發(fā)現(xiàn)有32個(gè)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異的蛋白點(diǎn)(圖2)。其中豐度上調(diào)的有12個(gè)(點(diǎn)3、4、5、6、7、18、19、20、21、22、24及29),豐度下調(diào)的有12個(gè)( 點(diǎn) 2、10、11、12、13、14、15、16、23、25、31及32),豐度先下調(diào)后上調(diào)的有8個(gè)(點(diǎn)1、8、9、17、26、27、28及 30)。采用 ImageMaster Platinum 7.0軟件對差異表達(dá)的蛋白進(jìn)行分析,差異蛋白相對表達(dá)量按Vol%提取,并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)(圖3)。

    2.2 差異表達(dá)蛋白的鑒定和功能分類

    采用MALDI-TOF-MS對32個(gè)表達(dá)差異的蛋白進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)均具有差異顯著性,其中豐度上調(diào)的有12個(gè),豐度下調(diào)的有12個(gè),豐度先下調(diào)后上調(diào)的8個(gè),通過MASCOT軟件對蛋白進(jìn)行鑒定,獲得29個(gè)蛋白點(diǎn)(表1)。

    圖1 沙漠小球藻蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜

    圖2 不同時(shí)間的干旱脅迫條件下蛋白質(zhì)表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化

    質(zhì)譜分析確定的32個(gè)差異表達(dá)蛋白點(diǎn)的身份,涉及29個(gè)差異蛋白。GO功能分析(圖4)表明,獲得的差異表達(dá)蛋白參與的生物過程主要有應(yīng)激反應(yīng)(Response to stress,GO:0006950)和小分子代謝過程(small molecule metabolic process,GO:004-4281);細(xì)胞組成主要有線粒體(Mitochondrion,GO:0005739)和類囊體(thylakoid,GO:0009579);分子功能主要有離子結(jié)合(GO:0043167)和氧化還原酶活性(Oxidoreductase activity,GO:0016491)。

    KEGG途徑富集分析(圖5)表明,獲得的差異表達(dá)蛋白主要參與光合作用、氧化磷酸化、檸檬酸循環(huán)(TCA循環(huán))等途徑。

    根據(jù)差異表達(dá)蛋白序列在Gene ontology中功能分析的結(jié)果,按參與生物代謝過程被分為7類:物質(zhì)代謝相關(guān)蛋白(13.79%)、能量生成與轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白(10.34%)、光合作用相關(guān)蛋白(10.34%)、抗逆相關(guān)蛋白(6.89%)、轉(zhuǎn)運(yùn)與細(xì)胞結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白(6.89%)、抗氧化相關(guān)蛋白(3.45%)和其他未知功能蛋白(48.28%)(圖6-A)。

    圖3 差異蛋白的相對表達(dá)量

    2.3 差異表達(dá)蛋白質(zhì)的互作網(wǎng)絡(luò)分析

    PPI分析結(jié)果(圖6-B)顯示,部分表達(dá)差異蛋白構(gòu)成一個(gè)結(jié)構(gòu)復(fù)雜的多中心互作網(wǎng)絡(luò),該網(wǎng)絡(luò)含19個(gè)蛋白質(zhì)節(jié)點(diǎn),有19種互作關(guān)系,各差異表達(dá)蛋白質(zhì)間通過多條通路進(jìn)行調(diào)節(jié)。在PPI網(wǎng)絡(luò)中,相互作用較強(qiáng)的蛋白質(zhì)主要為光合作用、物質(zhì)代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)與細(xì)胞結(jié)構(gòu)、能量生成與轉(zhuǎn)化、物質(zhì)代謝及抗逆等相關(guān)的蛋白。

    圖4 差異表達(dá)蛋白的GO分析

    3 討論

    本研究采用蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究干旱脅迫下沙漠小球藻蛋白表達(dá)特點(diǎn)。對獲得的29個(gè)差異表達(dá)蛋白分析表明,干旱脅迫影響了沙漠小球藻的多個(gè)生物學(xué)過程,其中光合作用、物質(zhì)代謝和能量合成受到的影響最大,此外抗逆、抗氧化和轉(zhuǎn)運(yùn)過程也受到影響。

    3.1 光合作用相關(guān)蛋白

    葉綠體是光合作用的重要場所,捕光葉綠素a/b結(jié)合蛋白(點(diǎn)1)是高等植物和藻類中類囊體膜上接收太陽能最終同化CO2的一類蛋白,其通常與葉綠素和葉黃素形成捕光色素蛋白復(fù)合體[17]。綠色植物中大部分的葉綠素分子都被光系統(tǒng)I(PSI)和光系統(tǒng)II(PSII)上的天然捕光色素復(fù)合體結(jié)合,其中光系統(tǒng)II捕光色素復(fù)合體的含量最為豐富。有研究表明,捕光葉綠素a/b結(jié)合蛋白不僅可以行使光能傳遞、轉(zhuǎn)化和分配的功能,其在適應(yīng)環(huán)境脅迫中也起到了重要的作用[18-19],并且其表達(dá)受ABA信號調(diào)控[20]。Fan等[21]通過雙向電泳技術(shù)研究了耐鹽植物海蓬子在高鹽條件下的蛋白組學(xué)差異,結(jié)果發(fā)現(xiàn)位于PSI和PSII上的捕光葉綠素a/b結(jié)合蛋白的表達(dá)量均明顯上調(diào)。NADPH:醌還原酶(點(diǎn)11)能夠還原多種電子受體,具有NADPH的底物特異性。本研究中發(fā)現(xiàn)干旱脅迫下一個(gè)捕光葉綠素a/b結(jié)合蛋白的表達(dá)上調(diào),說明脅迫條件一定程度上提高了光合系統(tǒng)的光合能力,促進(jìn)機(jī)體的物質(zhì)代謝,從而來抵抗干旱脅迫。干旱、高鹽等脅迫會(huì)導(dǎo)致植物機(jī)體受到損傷,高等植物和藻類能通過多種途徑減少這種損傷。光捕獲復(fù)合物的調(diào)節(jié)就是一種有效的光保護(hù)途徑。NADPH:醌還原酶(點(diǎn)11)能夠還原多種電子受體,具有NADPH的底物特異性。核酮糖-1,5-二磷酸羧化/加氧酶(點(diǎn)31)不僅能在光合作用中固定CO2,還能催化二磷酸核酮糖加氧反應(yīng)[22]。Agrawal等[23]發(fā)現(xiàn)水稻幼苗在臭氧脅迫下,核酮糖-1,5-二磷酸羧化/加氧酶表達(dá)受到抑制。本研究中發(fā)現(xiàn)干旱脅迫下該蛋白的表達(dá)量下調(diào),其抗旱機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

    表1 沙漠小球藻響應(yīng)干旱脅迫差異表達(dá)蛋白點(diǎn)的MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜鑒定結(jié)果

    圖5 差異表達(dá)蛋白的KEGG分析

    3.2 物質(zhì)代謝和抗逆相關(guān)蛋白

    核酮糖磷酸異構(gòu)酶(點(diǎn)8)是參與碳水化合物代謝和其他有機(jī)復(fù)合物生成的一類重要酶。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH,點(diǎn)20)不僅催化二羥丙酮磷酸(DHAP)轉(zhuǎn)化為3-磷酸甘油酸,也催化3-磷酸甘油醛(GAP)轉(zhuǎn)化為1,3-二磷酸甘油酸;是生物體內(nèi)糖酵解和糖異生過程中的關(guān)鍵酶[24],也是維持生命基本活動(dòng)的酶之一。同時(shí),GAPDH還具有抵抗外界逆境脅迫的功能,Khanna等[25]研究干旱脅迫下鷹嘴豆GAPDH等基因的表達(dá),結(jié)果表明干旱脅迫下GAPDH表達(dá)的轉(zhuǎn)錄水平明顯提高;Ahsan等[26]運(yùn)用雙向電泳技術(shù)研究了砷脅迫下水稻葉片的蛋白組學(xué)變化,發(fā)現(xiàn)砷脅迫下GAPDH的表達(dá)量上調(diào)2倍以上。本研究中發(fā)現(xiàn)此蛋白表達(dá)量上調(diào),說明GAPDH可使植物體內(nèi)新陳代謝加快,從而提供更多的能量抵御外界脅迫環(huán)境。烏頭酸水合酶(點(diǎn)21、22)參與三羧酸循環(huán),可催化檸檬酸和異檸檬酸之間的相互轉(zhuǎn)化。

    脅迫環(huán)境下,富含甘氨酸RNA結(jié)合蛋白2(GRP2,點(diǎn)17)是一種植物首先參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的響應(yīng)蛋白。研究發(fā)現(xiàn)GRPs的表達(dá)可受干旱、高鹽、植物激素等因素的誘導(dǎo)[27-28]。本研究中GRP2在干旱脅迫下先下調(diào)后上調(diào)表達(dá),說明干旱脅迫誘導(dǎo)該蛋白的表達(dá)。熱休克蛋白60(HSP60,點(diǎn)29)屬于熱休克蛋白家族,其作為分子伴侶廣泛分布于線粒體中,主要參與蛋白質(zhì)折疊、移位和降解等過程,對抑制細(xì)胞凋亡也有重要作用。該蛋白在細(xì)胞處于應(yīng)激條件時(shí)(如熱休克、高鹽及干旱等)表達(dá)量明顯提高[29-31]。Sato等[32]在研究水稻抗寒性時(shí)發(fā)現(xiàn)該蛋白的上調(diào)表達(dá)。本研究中干旱脅迫下該蛋白的表達(dá)量上調(diào),可能是因?yàn)槠渑c變性蛋白質(zhì)結(jié)合形成聚合體從而而減少對小球藻的傷害。

    干旱脅迫條件下,核酮糖磷酸異構(gòu)酶這類基礎(chǔ)代謝有關(guān)酶的表達(dá)量先下調(diào)后上調(diào),甘油醛-3-磷酸脫氫酶、烏頭酸水合酶的表達(dá)量上調(diào)。說明脅迫條件下小球藻的新陳代謝速度加快,將儲(chǔ)備的能量及時(shí)轉(zhuǎn)化為各種細(xì)胞活動(dòng)所需的動(dòng)力,從而使機(jī)體正常生長以抵御外界脅迫。

    圖6 沙漠小球藻差異蛋白的功能分類(A)與蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)圖(B)

    3.3 能量生成與轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白

    ATP合成酶廣泛分布于線粒體內(nèi)膜、葉綠體類囊體和細(xì)胞核中,參與氧化磷酸化和光合磷酸化反應(yīng),在跨膜質(zhì)子動(dòng)力勢的推動(dòng)下催化合成ATP,是生物體能量代謝的關(guān)鍵酶,又稱三磷酸腺苷合成酶[33]。本研究鑒定的蛋白點(diǎn)5為ATP合成酶相關(guān)蛋白,其表達(dá)量在干旱脅迫下上調(diào),為各類代謝活動(dòng)提供能量。ATP依賴的鋅金屬蛋白酶FTSH5(點(diǎn)28)具有ATP酶活性、蛋白水解活性和分子伴侶活性,還與熱激、高鹽、病害等脅迫響應(yīng)有關(guān)[34]。Zhang等[35]從磷酸化蛋白組水平探究了干旱脅迫對兩種小麥的影響,結(jié)果表明干旱脅迫下兩種小麥的ATP依賴的鋅金屬蛋白酶FTSH 5表達(dá)均下調(diào)。Das等[36]在研究大豆葉片對干旱脅迫及熱激的響應(yīng)時(shí)發(fā)現(xiàn)該蛋白在2種脅迫下的表達(dá)均下調(diào)。本研究中也發(fā)現(xiàn)此蛋白表達(dá)量先下調(diào)后上調(diào),但對于其在沙漠小球藻中油脂積累機(jī)制中的作用有待進(jìn)一步的探究和驗(yàn)證。分子伴侶TCP-1/cpn60(點(diǎn)30)主要在ATP水解時(shí)幫助蛋白質(zhì)的折疊和組裝,本研究中干旱脅迫能誘導(dǎo)分子伴侶TCP-1/cpn60表達(dá)量先下調(diào)后上調(diào)可能是因?yàn)槠鋮⑴c了小球藻干旱脅迫相關(guān)蛋白的折疊與組裝,并與小球藻干旱脅迫相關(guān)蛋白的合成密切相關(guān)。

    3.4 轉(zhuǎn)運(yùn)與細(xì)胞結(jié)構(gòu)、抗氧化相關(guān)蛋白

    ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白底物結(jié)合蛋白(點(diǎn)3)通過水解ATP產(chǎn)生的能量對溶質(zhì)中各種生物分子(如氨基酸、蛋白質(zhì)、糖等)進(jìn)行跨膜運(yùn)輸[37]。干旱脅迫條件下,該蛋白的表達(dá)上調(diào),組織中的糖類、蛋白質(zhì)的運(yùn)輸可能受到抑制,其抗旱機(jī)制還有待于進(jìn)一步的研究。外膜蛋白/肽聚糖結(jié)合(脂)蛋白(點(diǎn)4)具有為外膜提供通透性,維持外膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的作用。小球藻可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外滲透壓,從而抵御干旱脅迫。

    硫氧還蛋白過氧化物酶PMP20(點(diǎn)13)在進(jìn)化中高度保守,從低等原核生物到高等生物人類中均有表達(dá)。該蛋白具有過氧化物酶和分子伴侶的雙重性能,不僅可以參與細(xì)胞內(nèi)抗氧化物代謝,還可以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[38]。研究發(fā)現(xiàn),其在不同物種中都可以發(fā)揮抗逆特性來維持體內(nèi)氧化還原平衡。本研究中干旱脅迫條件下其表達(dá)量下調(diào),其作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

    除以上具有已知信息的蛋白外,2-DE中檢測的差異蛋白中有53.13%的未知功能蛋白,主要因?yàn)樾∏蛟宀粚儆谀J街参?,其蛋白?shù)據(jù)庫還不完善。而其中必定蘊(yùn)藏著和抗旱脅迫相關(guān)的蛋白和基因,這將是以后具有研究價(jià)值的方向。

    3.5 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)呈現(xiàn)的整體調(diào)控機(jī)制

    在PPI調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中,具有19個(gè)蛋白節(jié)點(diǎn)。干旱脅迫下差異表達(dá)的蛋白中,光合作用有關(guān)蛋白、能量生成與轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白和抗逆相關(guān)的蛋白普遍上調(diào)。說明干旱脅迫影響了葉綠體、線粒體,其干旱的核心是葉綠體結(jié)構(gòu)和光合作用的維持。此外,其他的細(xì)胞器和細(xì)胞質(zhì)的蛋白也發(fā)生了變化,這些蛋白的變化說明沙漠小球藻可以通過細(xì)胞中各細(xì)胞器的協(xié)同變化以應(yīng)對干旱脅迫。

    3.6 干旱脅迫下沙漠小球藻蛋白質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄組的結(jié)果比較

    本課題組此前已對干旱和鹽脅迫下沙漠小球藻開展了轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究,兩者都顯示脅迫18天比第0天脅迫得到的差異表達(dá)基因/蛋白數(shù)量更多,基因/蛋白在功能分類上差異較大。蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)現(xiàn),大量的蛋白質(zhì)定位在葉綠體中,轉(zhuǎn)錄研究也發(fā)現(xiàn)了光合作用相關(guān)基因。在GO分析中,細(xì)胞組分的結(jié)果也發(fā)現(xiàn)基因在葉綠體中明顯富集。蛋白質(zhì)組學(xué)研究結(jié)果顯示物質(zhì)代謝相關(guān)蛋白、能量生成與轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白和光合作用相關(guān)蛋白數(shù)目最多,轉(zhuǎn)錄組結(jié)果中次生代謝物的生物合成、生物過程調(diào)節(jié)、代謝過程和油脂的合成富集最多。兩種方法在研究結(jié)果上的差異反映研究水平不同,合二者獲得的數(shù)據(jù),從不同水平、不同角度為沙漠小球藻抗逆機(jī)制的研究提供依據(jù)。

    4 結(jié)論

    干旱脅迫影響沙漠小球藻部分蛋白的表達(dá),共獲得29個(gè)差異表達(dá)蛋白,主要涉及光合作用、物質(zhì)代謝和抗逆、能量生成與轉(zhuǎn)化等相關(guān)蛋白。沙漠小球藻能夠通過改變不同功能蛋白的表達(dá)來維持光合作和脂質(zhì)代謝的過程,以適應(yīng)干旱脅迫。

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