復(fù)合靶指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)研究進(jìn)展

武振寧, 薛書江, 楊詠潔

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 吉林 延吉 133002)

核酸適配體是一類新的、具有高度特異性和親和性的單鏈寡核苷酸(single-stranded DNA (ssDNA)或RNA),可發(fā)生適應(yīng)性折疊形成特殊的三維結(jié)構(gòu)(如發(fā)夾、假結(jié)、凸環(huán)、G-四分體等)[1]。這些特殊的三維結(jié)構(gòu)使核酸適配體具有高度的分子識(shí)別能力,能夠與靶物質(zhì)特異性結(jié)合。這種特異性可與單克隆抗體相媲美,因此,被譽(yù)為“人工單抗”。除了高度的特異性和親和力之外,核酸適配體還具有篩選周期短、易制備、易修飾、熱穩(wěn)定性和重復(fù)性好、無(wú)免疫原性等優(yōu)點(diǎn)[2]?；谏鲜鰞?yōu)良特性,核酸適配體在臨床診斷[3-6]、藥物研發(fā)[7,8]、疾病治療[4,9,10]等領(lǐng)域極具應(yīng)用前景。凡是涉及單抗的應(yīng)用領(lǐng)域,幾乎都可以用核酸適配體來(lái)取代。

核酸適配體的篩選一般是利用指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)技術(shù),從人工合成的隨機(jī)ssDNA或RNA文庫(kù)中,經(jīng)過(guò)反復(fù)的親和性分離、PCR擴(kuò)增,最終篩選獲得高親和力、高特異性的核酸適配體。SELEX技術(shù)是一種體外篩選過(guò)程,因此其靶標(biāo)范圍十分廣泛(>150種),包括重組蛋白質(zhì)、小分子、活細(xì)胞、微生物、組織等[11]。這些靶標(biāo)可以是單一、純化的靶標(biāo),也可以是多重、復(fù)合的靶標(biāo)。而以多重、復(fù)合物為篩選靶標(biāo)的SELEX技術(shù)稱為復(fù)合靶SELEX技術(shù)[12]。但是,目前SELEX技術(shù)多數(shù)局限于單一、純化的可溶性蛋白靶標(biāo)。因?yàn)閱我坏陌袠?biāo)其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、篩選條件可控,因此更容易獲得理想的核酸適配體。然而,針對(duì)單一靶標(biāo)的篩選必須在明確靶標(biāo)結(jié)構(gòu)、特性并獲得其純品后,才可以進(jìn)行。但是蛋白質(zhì)的純化過(guò)程繁瑣,耗時(shí)費(fèi)力,而且很多靶標(biāo)(如血清中的低豐度蛋白質(zhì)或細(xì)胞的膜蛋白)很難純化獲得單一純品。復(fù)合靶SELEX技術(shù)則可以避免靶標(biāo)的純化過(guò)程,能夠保持靶標(biāo)的天然構(gòu)象,并且可以在未明確靶標(biāo)的組成及結(jié)構(gòu)特性的前提下,通過(guò)高通量的盲篩獲得一系列特異性核酸適配體。因此,探索和開(kāi)發(fā)復(fù)合靶SELEX技術(shù)是十分必要的。本文主要介紹以未純化的各種生物樣本為復(fù)合靶的SELEX技術(shù),以期為核酸適配體的篩選提供新思路。

1 完整的細(xì)胞

以完整的細(xì)胞為靶標(biāo)篩選獲得核酸適配體的技術(shù)稱為Cell-SELEX技術(shù)[13]。一般細(xì)胞表面的膜蛋白具有非常重要的生理功能,如細(xì)胞的跨膜受體可以接受胞外信號(hào)分子而激活細(xì)胞信號(hào)通路。因此,很多跨膜蛋白(如G蛋白耦聯(lián)受體、受體激酶、離子通道等)都是非常重要的已開(kāi)發(fā)或尚未開(kāi)發(fā)的生物診斷標(biāo)志物或藥物靶標(biāo)[14-16]。然而,跨膜蛋白一般為兩性分子且不易分離純化,因此很難獲得水溶性的純品。Cell-SELEX則以完整的細(xì)胞為靶標(biāo),在篩選過(guò)程中,既避免了膜蛋白分離純化的繁瑣過(guò)程,又保留了細(xì)胞表面所有分子的天然構(gòu)象和分布,而且在生理?xiàng)l件下進(jìn)行篩選。因此,Cell-SELEX篩選的核酸適配體更有望應(yīng)用于臨床[17]。屈鋒課題組[18]在近期發(fā)表了有關(guān)Cell-SELEX的綜述,對(duì)該技術(shù)的相關(guān)研究進(jìn)行了系統(tǒng)的總結(jié)。

Cell-SELEX技術(shù)篩選的靶標(biāo)通常是某一已知的膜蛋白或特殊的細(xì)胞亞型。若篩選的靶標(biāo)是已知的膜蛋白,一般將該蛋白質(zhì)表達(dá)于細(xì)胞膜的表面,然后以過(guò)表達(dá)該膜蛋白的完整細(xì)胞為靶標(biāo)進(jìn)行篩選,而以不表達(dá)該蛋白質(zhì)的細(xì)胞為消減靶標(biāo)以消除非特異性的核酸適配體。利用該方法成功篩選獲得了轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子βⅢ型受體(TGFβRⅢ)[19]、α整合素V[20]等的特異性核酸適配體。為了提高篩選的成功率,在此基礎(chǔ)上又衍生了hybrid-or crossover-Cell-SELEX即分別以純化的重組蛋白質(zhì)和過(guò)表達(dá)該重組蛋白質(zhì)的細(xì)胞為靶標(biāo),交替進(jìn)行篩選以提高核酸適配體的特異性[21]。利用該方法獲得了轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TfR)[22]、細(xì)胞粘合素-C(TNC)[23]的特異性核酸適配體。

在未明確某一具體靶標(biāo)的情況下,也可以以完整的某個(gè)特殊的細(xì)胞亞型為篩選靶標(biāo),而以與其結(jié)構(gòu)類似的細(xì)胞亞型為消減靶標(biāo),盲篩獲得能夠區(qū)分兩種細(xì)胞亞型的適配體群。目前,利用消減法篩選獲得的核酸適配體能夠特異性識(shí)別結(jié)直腸癌細(xì)胞[24]、鼻咽癌細(xì)胞[16],能區(qū)分T急性淋巴細(xì)胞瘤和B淋巴細(xì)胞瘤[25]、小細(xì)胞肺癌和大細(xì)胞肺癌[26]。在Cell-SELEX篩選過(guò)程中,不管篩選的是哪一類型的靶標(biāo),都要引入消減法以避免非特異性核酸適配體的平行富集。

此外,利用Cell-SELEX技術(shù)不僅能夠篩選到跨膜蛋白的核酸適配體,而且還能夠進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)新的診斷標(biāo)志物。如CD109[16]、B-淋巴細(xì)胞抗原CD20[27]等就是利用篩選到的核酸適配體再結(jié)合質(zhì)譜確定的診斷標(biāo)志物。最近,Mayer等[28]利用熒光激活的細(xì)胞分選SELEX技術(shù)即FACS-SELEX技術(shù),將核酸適配體進(jìn)行熒光標(biāo)記,利用流式細(xì)胞儀將與靶細(xì)胞結(jié)合的核酸適配體進(jìn)行了分離,實(shí)現(xiàn)了核酸適配體的高通量篩選。

2 血清和細(xì)胞溶解物

凝膠電泳技術(shù)與SELEX技術(shù)相結(jié)合是一種有效的核酸適配體篩選工具,非常適合于篩選未純化可溶性的生物樣本(如血清、細(xì)胞溶解物)。常用的凝膠電泳包括:十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、毛細(xì)管電泳(CE)及電泳遷移率實(shí)驗(yàn)(EMSA)。SDS-PAGE是蛋白質(zhì)在變性條件下,根據(jù)蛋白質(zhì)分子量大小對(duì)其進(jìn)行分離;毛細(xì)管電泳是以毛細(xì)管為分離通道,在微升甚至納升水平對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離,分辨率高,所用的蛋白質(zhì)樣品量極低,是一種高效的分離、分析方法;EMSA最初用于DNA/RNA結(jié)合蛋白質(zhì)和其相關(guān)的DNA/RNA結(jié)合序列互作研究,現(xiàn)在也可以用于研究核酸適配體及其結(jié)合蛋白質(zhì)互作。在非變性條件下,核酸-蛋白質(zhì)復(fù)合物比游離的核酸移動(dòng)速率慢,從而可以將結(jié)合的和游離的核酸分離。

2.1 血清

血清由于取材容易、創(chuàng)傷小,是目前最為理想的臨床診斷標(biāo)本。血清中蘊(yùn)藏著十分豐富的診療信息,是用于發(fā)現(xiàn)疾病診斷標(biāo)志物或治療靶標(biāo)的最佳樣本。但由于血清的組成過(guò)于復(fù)雜,一些有價(jià)值的、潛在的診斷標(biāo)志物常因豐度低而被高豐度蛋白質(zhì)所掩蓋,因此以血清為靶標(biāo)的核酸適配體篩選鮮有人探索。直至2015年,邵寧生等[29]首次利用消減-EMSA-SELEX技術(shù),以肝癌患者的甲胎蛋白(AFP)陰性血清為篩選靶標(biāo),以正常健康人的血清為消減靶標(biāo),根據(jù)游離的ssDNA和結(jié)合的ssDNA在電場(chǎng)中的遷移率不同,利用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳將二者進(jìn)行分離,經(jīng)過(guò)5輪重復(fù)篩選,將最后一輪的ssDNA與血清蛋白質(zhì)的復(fù)合物進(jìn)行質(zhì)譜鑒定,最終確定vasorin為肝癌患者候選的血清診斷標(biāo)志物。該研究表明,利用消減-EMSA-SELEX技術(shù)能夠篩選到用于鑒別正常人與癌癥患者血清的核酸適配體,并可以進(jìn)一步用于確定疾病的診斷標(biāo)志物。2017年,栗坤等[30]以瓊脂糖微珠為固相載體,將血清固定于瓊珠的表面,以肺癌患者血清為正篩靶標(biāo),以健康人的血清為消減靶標(biāo),利用靶替換的消減SELEX技術(shù)即每輪都進(jìn)行陰性與陽(yáng)性篩選,最終經(jīng)過(guò)10輪篩選獲得6條核酸適配體序列。該方法雖然也實(shí)現(xiàn)了血清核酸適配體的篩選,但需要將血清蛋白質(zhì)固定于微珠上,而微珠的表面積有限,很可能會(huì)遺漏一些潛在的、有價(jià)值的診斷標(biāo)志物。

本課題組目前也在利用消減-EMSA-SELEX技術(shù)篩選能夠鑒別布魯氏菌感染與免疫的血清核酸適配體。篩選過(guò)程中發(fā)現(xiàn),ssDNA與血清直接孵育后會(huì)導(dǎo)致部分ssDNA降解,回收率降低。為了克服這一局限性,可以考慮將ssDNA文庫(kù)進(jìn)行修飾或加入DNA酶抑制劑,以避免ssDNA的降解。另外,由于篩選的核酸適配體多為短鏈寡核苷酸(<80 nt),而市面上很少有專門用于回收短鏈寡核苷酸的試劑盒,醇沉法的ssDNA回收率又很低。因此,如何提高ssDNA的回收率也是亟待解決的問(wèn)題。

2.2 細(xì)胞溶解物

對(duì)于已知靶蛋白質(zhì)的核酸適配體篩選,常規(guī)方法是先利用某種培養(yǎng)的細(xì)胞對(duì)靶蛋白質(zhì)進(jìn)行過(guò)表達(dá),然后從該細(xì)胞溶解物中純化靶蛋白質(zhì),之后再以純化的重組蛋白質(zhì)為靶標(biāo)篩選核酸適配體。然而,從細(xì)胞溶解物中純化蛋白質(zhì)操作繁瑣、耗時(shí),且具有一定挑戰(zhàn)性。為了避開(kāi)這一難題,Kanoatov等[31]以DNA錯(cuò)配修復(fù)蛋白質(zhì)MutS為篩選靶標(biāo),將其重組表達(dá)后并未純化,而是直接以表達(dá)MutS的細(xì)胞溶解物為靶標(biāo)進(jìn)行正篩,再以不表達(dá)該蛋白質(zhì)的細(xì)胞溶解物為消減靶標(biāo)進(jìn)行反篩,僅需5輪篩選即獲得了MutS的核酸適配體。該研究表明,以未純化的細(xì)胞溶解物為靶標(biāo),不需要對(duì)重組蛋白質(zhì)進(jìn)行純化,也可以實(shí)現(xiàn)核酸適配體的篩選。但是,該方法必須在靶蛋白質(zhì)已知的情況下,實(shí)施核酸適配體的篩選。另外,Javaherian等[32]利用上述方法篩選獲得的核酸適配體作為親和試劑,開(kāi)發(fā)了一種基于核酸適配體的細(xì)胞蛋白質(zhì)分離方法(AptaPIC),用于分離、純化細(xì)胞溶解物中的蛋白質(zhì)。

針對(duì)復(fù)雜生物樣本(如細(xì)胞溶解物、血清),在未明確靶蛋白質(zhì)的前提下,利用二維凝膠電泳(2DE)-SELEX技術(shù)結(jié)合Western-blot (WB)技術(shù),可以實(shí)現(xiàn)核酸適配體的高通量篩選。2DE可以將復(fù)合靶蛋白質(zhì)完全分離,然后利用WB技術(shù)將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上,之后實(shí)施核酸適配體篩選。Savory等[33]利用該方法以鼠的肝組織提取物為靶標(biāo),以未知蛋白質(zhì)(pI為4.5,相對(duì)分子質(zhì)量為35 kDa)為靶點(diǎn),經(jīng)4輪篩選即獲得靶蛋白質(zhì)的特異性核酸適配體。同時(shí),利用適配體的印跡試驗(yàn)分析了適配體與靶蛋白質(zhì)(pI為4.5,相對(duì)分子質(zhì)量為35 kDa)結(jié)合的特異性和親和性。利用2DE-SELEX技術(shù)篩選的核酸適配體,可進(jìn)一步用于蛋白質(zhì)組學(xué)分析及生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)。然而,蛋白質(zhì)在經(jīng)2DE分離及電轉(zhuǎn)至膜上的過(guò)程中很可能發(fā)生變性,蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)可能被破壞。另外,2DE及WB方法操作過(guò)程繁瑣、耗時(shí),而且試驗(yàn)的準(zhǔn)確性及重復(fù)性差。若整個(gè)操作過(guò)程可以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化,則能夠彌補(bǔ)其不足之處。最近,全自動(dòng)電泳儀系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)電泳和電轉(zhuǎn)印的自動(dòng)化,整個(gè)過(guò)程只需1 h[34]。這些自動(dòng)化系統(tǒng)可以改善2DE-SELEX技術(shù)的準(zhǔn)確性及重復(fù)性問(wèn)題。另外,利用2DE-SELEX技術(shù)并結(jié)合質(zhì)譜,可以用于同時(shí)發(fā)現(xiàn)多個(gè)生物標(biāo)志物及對(duì)應(yīng)核酸適配體的研究,是一種高效的篩選生物標(biāo)志物及對(duì)應(yīng)核酸適配體的新戰(zhàn)略。

3 組織

以組織為靶標(biāo)的SELEX技術(shù)包括體內(nèi)的In vivo-SELEX技術(shù)和體外的組織切片-SELEX技術(shù)[35]。

3.1 In vivo-SELEX

In vivo-SELEX是以活的動(dòng)物體內(nèi)的腫瘤組織為靶標(biāo)篩選特異性核酸適配體[32]。整個(gè)篩選過(guò)程與傳統(tǒng)的SELEX技術(shù)很相似,不同之處就在于利用活體動(dòng)物而不是純化的蛋白質(zhì)進(jìn)行篩選。整個(gè)過(guò)程的關(guān)鍵在于直接將ssDNA文庫(kù)注射入動(dòng)物體內(nèi),ssDNA通過(guò)血液循環(huán)流入靶組織并與之結(jié)合,手術(shù)切除靶組織后收集結(jié)合的ssDNA。Mi等[36]建立了結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移小鼠模型進(jìn)行In vivo-SELEX篩選。由于是體內(nèi)篩選,研究者將文庫(kù)進(jìn)行了修飾(2′-氟代嘧啶),將修飾的RNA文庫(kù)通過(guò)尾靜脈注射入小鼠體內(nèi),在注射20～30 min之后,收集含有轉(zhuǎn)移瘤的肝組織、提取RNA適配體、PCR擴(kuò)增。重復(fù)以上操作步驟,經(jīng)過(guò)14輪篩選最終獲得高親和力的P68核酸適配體。P68為治療結(jié)直腸癌藥物的候選靶標(biāo),是RNA解螺旋酶,在結(jié)直腸癌中上調(diào)表達(dá)。該研究表明,利用In vivo-SELEX技術(shù),未經(jīng)純化過(guò)程也能夠獲得組織特異性核酸適配體。同樣的,DHX9的核酸適配體也是利用該方法成功篩選獲得[37]。此外,Cheng等[38]利用In vivo-SELEX技術(shù)經(jīng)過(guò)22輪篩選,獲得能夠穿透野生型小鼠血腦屏障的RNA適配體。同時(shí),利用原位雜交技術(shù)確定了該核酸適配體的組織分布情況,其分布于大腦皮層、海馬、小腦和紋狀體。以上研究表明,In vivo-SELEX技術(shù)可以免去體外SELEX技術(shù)很多繁瑣步驟(如細(xì)胞的分離、收集等過(guò)程),能夠生成組織特異性的核酸適配體。然而,In vivo-SELEX技術(shù)由于需要將大量的寡核苷酸文庫(kù)注入動(dòng)物體內(nèi),目前只能用于小動(dòng)物模型。對(duì)于大動(dòng)物模型則很難實(shí)施,因?yàn)樾枰罅康墓押塑账嵛膸?kù)和更長(zhǎng)時(shí)間的血液循環(huán)。

3.2 組織切片-SELEX技術(shù)

組織切片一般用于常規(guī)的病理診斷,病理組織被切割至幾微米厚,并固定于載玻片上。組織切片-SELEX技術(shù)是以固定在載玻片上的組織薄片為靶標(biāo),寡核苷酸文庫(kù)直接與組織孵育、洗脫,收集結(jié)合寡核苷酸、PCR擴(kuò)增,如此反復(fù),最終篩選獲得特異性核酸適配體[39]。目前,利用該技術(shù)已成功篩選獲得能夠識(shí)別各種臨床組織標(biāo)本的核酸適配體,包括卵巢癌腫瘤組織[15]、乳腺癌組織[40]等。該技術(shù)主要有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn):一、篩選的核酸適配體更具代表性、更具有臨床應(yīng)用價(jià)值,因?yàn)樗且耘R床組織標(biāo)本為靶標(biāo)而不是以培養(yǎng)的細(xì)胞系為靶標(biāo);二、以組織切片為靶標(biāo),可以篩選獲得針對(duì)組織中各組分的核酸適配體,包括胞內(nèi)蛋白質(zhì)、細(xì)胞膜組分及胞外基質(zhì),尤其是胞內(nèi)蛋白質(zhì)(如溶酶體、凋亡因子、轉(zhuǎn)錄因子等);三、獲得的核酸適配體可以作為一個(gè)新的分子檢測(cè)探針用于病理診斷。

4 小結(jié)

SELEX技術(shù)一般是以單一、純化的蛋白質(zhì)靶標(biāo)為“誘餌”,然而,對(duì)于生物樣本中的一些低豐度蛋白質(zhì)、膜蛋白及未知的蛋白質(zhì),無(wú)法獲得單一純品,因此按常規(guī)方法無(wú)法篩選獲得核酸適配體。復(fù)合靶SELEX技術(shù)則無(wú)需純化蛋白質(zhì),在保持生物樣本天然構(gòu)象和活性的前提下,甚至可以在未知靶標(biāo)結(jié)構(gòu)和組成的前提下,實(shí)施核酸適配體的篩選。然而,以未純化的生物樣本為靶標(biāo)篩選核酸適配體時(shí),由于該類復(fù)合靶標(biāo)成分復(fù)雜、結(jié)構(gòu)多樣,導(dǎo)致篩選的核酸適配體特異性不強(qiáng),很難應(yīng)用于臨床。因此,目前復(fù)合靶SELEX技術(shù)最具挑戰(zhàn)性的就是核酸適配體能否與其靶標(biāo)特異性結(jié)合。