整體柱固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法在線分析大米中15種酰胺類除草劑殘留量

張海超, 艾連峰, 馬育松, 王 敬, 李曉菲

(河北出入境檢驗(yàn)檢疫局, 河北 石家莊 050051)

在近代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中,酰胺類除草劑因其殺草譜廣、效果突出、易降解等優(yōu)點(diǎn),成為目前世界上應(yīng)用較廣泛的除草劑之一[1]。該類除草劑在給人類帶來(lái)了巨大利益的同時(shí),也對(duì)人類造成了潛在的危害。據(jù)研究,酰胺類除草劑具有較高的毒性,在體內(nèi)可降解轉(zhuǎn)化成二烷基醌亞胺,這種物質(zhì)具有致癌作用,使人和動(dòng)物發(fā)生癌癥的風(fēng)險(xiǎn)極大提高[2],因此酰胺類除草劑的殘留問(wèn)題也受到了人們的廣泛關(guān)注。

大米因其豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值被稱為五谷之首,是我國(guó)重要的糧食作物,約占糧食作物栽培面積的四分之一,世界上有一半人口以大米為主食。酰胺類除草劑對(duì)于稻米田雜草的防治具有重要作用,但如果在施藥過(guò)程中存在濫用、亂用的行為,將會(huì)在大米中造成一定量的農(nóng)藥殘留,危害食用者的健康。世界各國(guó)都對(duì)大米中酰胺類除草劑的殘留量制定了嚴(yán)格的限量標(biāo)準(zhǔn),如歐盟規(guī)定大米中甲草胺、敵稗、二甲吩草胺為0.01 mg/kg,敵草胺和氟噻草胺為0.05 mg/kg[3];日本規(guī)定大米中丙草胺為0.03 mg/kg,異丙甲草胺為0.1 mg/kg[4]。我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 2763-2016中對(duì)大米中丙草胺的限量規(guī)定為0.1 mg/kg,丁草胺為0.5 mg/kg,并且在2017年及2018年國(guó)家食品安全監(jiān)督抽檢實(shí)施細(xì)則中丙草胺和丁草胺分別被列為大米必檢的農(nóng)殘檢測(cè)項(xiàng)目。因此,建立大米中酰胺類除草劑殘留快速、靈敏的檢測(cè)方法具有重要意義。

大米中含有較多的淀粉和油脂,由于基質(zhì)的復(fù)雜性,需要對(duì)樣品進(jìn)行前處理以去除雜質(zhì)干擾。文獻(xiàn)報(bào)道中關(guān)于酰胺類除草劑所采用的前處理凈化方式有QuEChERS法[5-8]、固相萃取(SPE)[9-11]、固相微萃取(SPME)[12-14]及近年來(lái)一些新興的方法如磁性固相萃取(MSPE)[15]和懸浮固化液相微萃取(SFO-LPME)[16]等。但是,這些傳統(tǒng)或新興的方法均存在一定缺陷,如QuEChERS法對(duì)于復(fù)雜基質(zhì)去除干擾物質(zhì)的能力依然略顯不足;固相萃取操作繁瑣,有機(jī)溶劑使用量大;磁性固相萃取的表面活性劑涂層易被破壞擴(kuò)散到解吸溶劑中。且這些凈化方式均為離線操作,速度慢,嚴(yán)重影響了檢測(cè)效率。本文所采用的整體柱(monolithic column)是由甲基丙烯酸丁酯為功能單體,通過(guò)混合交聯(lián)劑、致孔劑等原位聚合制備而成的具有疏水作用的連續(xù)棒狀整體,具有很好的多孔性和滲透性。另外,整體柱性質(zhì)穩(wěn)定,具有良好的生物兼容性,可以反復(fù)多次使用,已在食品安全領(lǐng)域得到一些應(yīng)用[17-22]。本實(shí)驗(yàn)將該在線整體柱作為萃取介質(zhì),結(jié)合三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜分析了大米中15種酰胺類除草劑的殘留,該方法簡(jiǎn)便、高效、可靠。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

在線凈化液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(Thermo Fisher公司,美國(guó)),由CTC多功能自動(dòng)進(jìn)樣器(配有200 μL定量環(huán))、兩個(gè)耐壓 125 MPa (1 250 bar)的四元梯度液相泵、多元柱切換裝置和TSQ Quantum Ultra三重四極桿質(zhì)譜儀組成;LC-2010型高效液相色譜儀(Shimadzu公司,日本),配紫外檢測(cè)器;DKZ-2型電熱恒溫振蕩水槽(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司,中國(guó)); Sigma 3K-15型離心機(jī)(Sigma公司,美國(guó)); PT2100型均質(zhì)器(Kinematica公司,瑞士);渦旋混合器(Scientific Industries,美國(guó))。

甲基丙烯酸丁酯(butyl methacrylate, BMA)和乙二醇二甲基丙烯酸酯(ethylene dimethacrylate, EDMA)均購(gòu)自阿拉丁試劑公司;正丙醇購(gòu)自天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;偶氮二異丁腈(AIBN)和聚乙二醇400(PEG-400)購(gòu)自天津市大茂化學(xué)試劑廠;色譜純甲酸購(gòu)于北京迪馬科技有限公司;色譜純乙腈、甲醇、丙酮、異丙醇購(gòu)自飛世爾試劑公司;分析純無(wú)水硫酸鈉購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;實(shí)驗(yàn)所用純水均由美國(guó)Milli-Q純化系統(tǒng)(Millipore公司,美國(guó))制得。

標(biāo)準(zhǔn)品:敵草胺(napropamide, CAS號(hào):15299-99-7)、苯噻酰草胺(mefenacet, CAS號(hào):73250-68-7)、二甲吩草胺(dimethenamid, CAS號(hào):87674-68-8)、敵稗(propanil, CAS號(hào):709-98-8)、雙苯酰草胺(diphenamid, CAS號(hào):957-51-7)、吡草胺(metazachlor, CAS號(hào):67129-08-2)、毒草胺(propachlor, CAS號(hào):1918-16-7)、丁草胺(butachlor, CAS號(hào):23184-66-9)、丙草胺(pretilachlor, CAS號(hào):51218-49-6)、吡氟酰草胺(diflufenican, CAS號(hào):83164-33-4)、異丙甲草胺(metolachlor, CAS號(hào):87392-12-9)、乙草胺(acetochlor, CAS號(hào):34256-82-1)、牧草胺(tebutam, CAS號(hào):35256-85-0)、甲草胺(alachlor, CAS號(hào):15972-60-8)、氟噻草胺(flufenacet, CAS號(hào):142459-58-3)標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)于德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司,純度大于97% 。

1.2 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別稱取15種酰胺類除草劑標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg(折合純度后)于10 mL棕色容量瓶中,用甲醇溶解、定容,得到1 g/L 的單標(biāo)儲(chǔ)備液,于4 ℃下避光保存。根據(jù)需要,準(zhǔn)確移取15種除草劑標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,用甲醇稀釋成10 mg/L 混合標(biāo)準(zhǔn)工作液,待用。

1.3 poly(BMA-co-EDMA)整體柱的制備

參照文獻(xiàn)方法[19],將1.0 mmol單體BMA、3.0 mmol交聯(lián)劑EDMA、13.0 mmol正丙醇和2.5 mmol聚乙二醇400、10 mg引發(fā)劑偶氮二異丁腈在室溫下超聲混合、脫氣后灌入不銹鋼柱管(50 mm×2.1 mm)中,兩端密封。實(shí)驗(yàn)在水浴溫度55 ℃、反應(yīng)時(shí)間8 h條件下制備整體柱。反應(yīng)結(jié)束后,將poly(BMA-co-EDMA)整體柱接入LC-2010型高效液相色譜高壓泵,用甲醇沖洗該整體柱以除去未反應(yīng)的單體和致孔劑,得到poly(BMA-co-EDMA)柱,備用。

表 1 在線凈化及色譜分離的梯度洗脫程序

1) A: water; B: acetonitrile; C: acetone-acetonitrile-isopropanol (1∶1∶1, v/v/v). 2) A: 0.5%(v/v) formic acid aqueous solution; B: acetonitrile.

1.4 樣品制備

稱取5 g(精確到0.01 g)粉碎均勻的大米試樣,置于50 mL離心管中,加入10 mL水渦旋混勻浸泡10 min。加入25 mL乙腈和8 g無(wú)水硫酸鈉迅速搖勻,用均質(zhì)器以 10 000 r/min 均質(zhì)1 min后,在5 000 r/min 下離心5 min。準(zhǔn)確移取5.0 mL提取液在40 ℃水浴中氮?dú)饬鞔蹈?。?zhǔn)確加入500 μL甲醇渦旋1 min,再加入500 μL水混勻過(guò)0.22 μm濾膜,進(jìn)樣測(cè)定。

1.5 在線凈化固相萃取與HPLC-MS/MS條件

1.5.1在線凈化及HPLC條件

在線凈化程序主要通過(guò)兩個(gè)泵和兩個(gè)六通閥的切換實(shí)現(xiàn)流路在固相萃取柱和色譜柱之間的流動(dòng),完成分析測(cè)定的在線自動(dòng)化。在線固相萃取程序(TFC)分為4個(gè)部分:上樣、淋洗、洗脫和條件化。流動(dòng)相A為水,B為乙腈,C為丙酮-乙腈-異丙醇(1∶1∶1, v/v/v),進(jìn)樣量為50 μL;樣品在上樣溶液水的帶動(dòng)下流經(jīng)poly(BMA-co-EDMA)在線固相萃取柱,目標(biāo)分析物保留在凈化柱上。淋洗時(shí)使用乙腈將吸附在凈化柱上的部分雜質(zhì)沖洗下來(lái)排入廢液,同時(shí)要保證目標(biāo)化合物不被洗脫。在洗脫過(guò)程中,采用乙腈將分析物洗脫,切入至分析柱中進(jìn)行分離分析。最后的條件分為兩部分:在線固相萃取柱的沖洗及平衡,同時(shí),洗脫泵驅(qū)動(dòng)分析流動(dòng)相在分析柱上完成目標(biāo)化合物的分離。

HPLC分離采用Hypersil GOLD柱(150 mm×2.1 mm, 5 μm)為分析柱,分析流動(dòng)相A為0.5%(v/v)的甲酸水溶液,流動(dòng)相B為乙腈。整個(gè)過(guò)程只有洗脫步驟中凈化柱與分析柱連接,在其余步驟中在線固相萃取凈化柱與分析柱均未連接,TFC程序切入廢液。TFC每步的變化采用瞬變模式,HPLC每步的變化除最后一步采用瞬變模式外其他步驟間的改變采用漸變模式,整個(gè)運(yùn)行時(shí)間為10 min。最終建立的在線凈化梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

1.5.2質(zhì)譜條件

電噴霧離子源正離子(ESI+)模式;多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)掃描;電噴霧電壓 3 500 V;離子源溫度200 ℃;毛細(xì)管溫度350 ℃;輔助氣壓力40 unit;鞘氣壓力30 unit;源內(nèi)誘導(dǎo)解離電壓10 V; Q1和Q3單位分辨率0.7 U;定性離子對(duì)、定量離子對(duì)和碰撞能量見(jiàn)表2。

* Quantitative ion pair.

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理?xiàng)l件的選擇和優(yōu)化

本方法所測(cè)定的化合物都是相對(duì)分子質(zhì)量在200～400范圍內(nèi)、具有氨基的化合物,溶于丙酮、甲醇、乙腈等有機(jī)溶劑。大米基質(zhì)的干擾成分主要是淀粉和油脂等,因此為降低提取過(guò)程中帶來(lái)的基質(zhì)干擾,選擇了極性相對(duì)較強(qiáng)的乙腈作為提取溶劑。同時(shí)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在去除水分的步驟中采用氯化鈉進(jìn)行鹽析分層得到的上清溶液在氮吹后有較多的固體殘?jiān)?影響了分析物的復(fù)溶,導(dǎo)致部分化合物(吡氟酰草胺和丁草胺)回收率極低。而采用適量無(wú)水硫酸鈉吸收水分得到的上清溶液在氮吹后固體殘?jiān)@著減少,且不影響提取效率。

同時(shí),定容液的選擇對(duì)化合物在整體柱上的保留情況有著重要的影響,實(shí)驗(yàn)以水為上樣溶液、采用不接分析柱、分流進(jìn)質(zhì)譜的模式考察了以不同比例的甲醇和水為上樣溶液時(shí)目標(biāo)物在整體柱上的保留情況。如圖1所示,在整體柱上保留較弱的4個(gè)化合物毒草胺、雙苯酰草胺、二甲吩草胺和吡草胺在定容液中甲醇體積分?jǐn)?shù)分別為90%、70%、50%時(shí)的色譜圖,發(fā)現(xiàn)化合物隨著定容液中甲醇比例的減小,在整體柱上的保留行為增強(qiáng)。當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí)可保證化合物全部保留在整體柱上,且該定容液可完全溶解目標(biāo)物。

2.2 質(zhì)譜條件的選擇和優(yōu)化

用蠕動(dòng)泵以10 μL/min 流速向質(zhì)譜系統(tǒng)分別注入各化合物1 mg/L 標(biāo)準(zhǔn)溶液,確定其最佳質(zhì)譜條件。各化合物的標(biāo)準(zhǔn)溶液和HPLC的流動(dòng)相混合進(jìn)入ESI電離源,在正離子掃描模式下進(jìn)行一級(jí)全掃描質(zhì)譜分析,大部分化合物為[M+H]+峰。甲草胺、乙草胺和丁草胺分子離子峰響應(yīng)極低,但這3個(gè)化合物的部分碎片甲草胺m/z238.1、乙草胺m/z224.0和丁草胺m/z238.1卻出現(xiàn)極高的響應(yīng)且較為穩(wěn)定,分析原因可能是這3種化合物在離子化過(guò)程中極不穩(wěn)定出現(xiàn)斷裂。導(dǎo)致甲草胺出現(xiàn)[C13H16ClNO+H]+峰、乙草胺出現(xiàn)[C12H14ClNO+H]+峰、丁草胺出現(xiàn)[C13H16ClNO+H]+峰。選擇甲草胺m/z238.1、乙草胺m/z224.0、丁草胺m/z238.1作為母離子,有效解決了甲草胺和乙草胺這對(duì)同分異構(gòu)體的色譜分離問(wèn)題,同時(shí)甲草胺和丁草胺在表1色譜條件下也可達(dá)到有效的分離。其全掃描質(zhì)譜圖和母離子可能的裂解示意圖見(jiàn)圖2。

2.3 在線凈化條件的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)采用不接分析柱、分流進(jìn)質(zhì)譜、反相洗脫優(yōu)化每一步過(guò)程。首先選定水作為上樣溶液,發(fā)現(xiàn)可對(duì)所有目標(biāo)化合物實(shí)現(xiàn)保留。淋洗和洗脫溶液比較了甲醇和乙腈,最后均選用具有較好洗脫能力的乙腈溶液,可保證化合物更快進(jìn)入分析柱。在洗脫時(shí)需將目標(biāo)化合物從在線固相萃取柱轉(zhuǎn)移至分析柱,與分析柱流動(dòng)相合并切入質(zhì)譜,見(jiàn)表1第3步，因此洗脫流動(dòng)相流速不能過(guò)高,在柱壓允許情況下選定為0.2 mL/min,在該流速下約88 s可保證目標(biāo)物全部洗脫且不會(huì)對(duì)色譜峰形造成溶劑效應(yīng)。在確定好洗脫時(shí)間后,對(duì)淋洗時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化,淋洗時(shí)間過(guò)短會(huì)導(dǎo)致過(guò)多廢液切入質(zhì)譜,過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致目標(biāo)物切入廢液。通過(guò)不斷優(yōu)化確定淋洗時(shí)間為32 s,見(jiàn)表1第2步。切入質(zhì)譜時(shí)間為最大限度地保證更少的雜質(zhì)、更多的目標(biāo)物切入質(zhì)譜,優(yōu)化后的在線凈化過(guò)程所得的色譜圖見(jiàn)圖3。最后再用強(qiáng)淋洗溶劑丙酮-乙腈-異丙醇(1∶1∶1, v/v/v)洗掉在線凈化柱上的強(qiáng)保留雜質(zhì),并以在線凈化流動(dòng)相A初始化在線凈化柱,以備下一個(gè)樣品的分析,最后建立了表1的梯度條件。

圖 1 不同定容液對(duì)4種除草劑在整體柱上保留的影響Fig. 1 Effect of different methanol volume ratios on the retention of the four herbicides on monolith column

2.4 色譜條件的優(yōu)化

分析柱是將由在線凈化柱洗脫下的分析物進(jìn)行分離。實(shí)驗(yàn)選用甲酸水溶液和乙腈作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫,發(fā)現(xiàn)甲酸含量對(duì)部分化合物靈敏度有著很大的影響,為得到最優(yōu)的分析條件,實(shí)驗(yàn)對(duì)不同濃度的甲酸溶液進(jìn)行了比較。最后選用0.5%(v/v)甲酸溶液為水相,乙腈為有機(jī)相,采用梯度洗脫條件時(shí),所有化合物的峰形較好,靈敏度較高(如圖4)。

2.5 基質(zhì)效應(yīng)、線性范圍、檢出限和定量限

根據(jù)分析物的靈敏度,分別采用大米的空白基質(zhì)溶液和甲醇-水(1∶1, v/v)配制成質(zhì)量濃度為0.5、1、2、5、10、20、50、100 μg/L 的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,依次進(jìn)樣測(cè)定,進(jìn)樣量50 μL。以各組分的峰面積對(duì)其質(zhì)量濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,將基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率k1與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率k2進(jìn)行比較,根據(jù)如下公式計(jì)算基質(zhì)效應(yīng):ME=k1/k2。結(jié)果顯示,ME在0.54～1.24之間,個(gè)別化合物存在一定的基質(zhì)效應(yīng)，因此選用大米基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)工作液以保證定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。各組分在相應(yīng)的線性范圍內(nèi)，峰面積與質(zhì)量濃度成良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(r)大于0.998(見(jiàn)表3)。在空白大米基質(zhì)中添加不同質(zhì)量濃度的待測(cè)物,計(jì)算方法的檢出限(LOD,S/N=3)和定量限(LOQ,S/N=10),分別為0.20～2.0 μg/kg 和0.50～5.0 μg/kg(見(jiàn)表3)。

圖 2 甲草胺、乙草胺和丁草胺全掃描質(zhì)譜圖及母離子產(chǎn)生的方式Fig. 2 Full scan mass spectra and proposed dissociation mode of alachlor, acetochlor and butachlor

圖 3 優(yōu)化后的15種除草劑在線凈化條件色譜圖(不接分析柱)Fig. 3 Chromatogram of the 15 amide herbicides under optimized on-line cleanup conditions (not connected to the analytical column)

圖 4 15種酰胺類除草劑的標(biāo)準(zhǔn)MRM色譜圖Fig. 4 MRM chromatograms of mixture of the 15 amide herbicide standards

表 3 15種除草劑的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

y: peak area;x: mass concentration, μg/L.

表 4 空白大米中15種酰胺類除草劑的加標(biāo)回收率和精密度(n=6)

* Spiked levels are 5, 10, 50 and 100 μg/kg for propanil.

2.6 方法的回收率和精密度

采用標(biāo)準(zhǔn)加入法進(jìn)行試驗(yàn)。取已制備均勻的空白樣品,準(zhǔn)確加入15種除草劑的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,添加濃度分別為2、5、10和50 μg/kg(敵稗為5、10、50和100 μg/kg)的樣品各6份,按上述優(yōu)化后的方法進(jìn)行分析。采用大米空白基質(zhì)溶液配制系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,外標(biāo)法進(jìn)行定量分析,計(jì)算平均回收率和精密度(見(jiàn)表4)。結(jié)果表明,所有農(nóng)藥的回收率均在75.5% ～121.3%之間,精密度也均小于15% ,符合國(guó)內(nèi)外相關(guān)要求。

2.7 實(shí)驗(yàn)方法與傳統(tǒng)方法對(duì)比

大米基質(zhì)中酰胺類除草劑的傳統(tǒng)凈化方式多采用離線固相萃取。本文與傳統(tǒng)測(cè)定方法在預(yù)處理過(guò)程中有機(jī)試劑用量、耗時(shí)長(zhǎng)短、萃取柱可重復(fù)利用3方面進(jìn)行了對(duì)比。由表5可知,本前處理方法消耗試劑量更少,耗時(shí)更短,成本更低。且在線整體柱不需要實(shí)驗(yàn)人員對(duì)固相萃取柱進(jìn)行活化、上樣、洗脫等操作,減少了人為操作誤差。同時(shí)在線固相萃取方式也并未增加儀器測(cè)定時(shí)長(zhǎng),10 min可完成一次樣品分析。

表 5 本實(shí)驗(yàn)方法與文獻(xiàn)方法的分析結(jié)果對(duì)比

2.8 實(shí)際樣品測(cè)定

應(yīng)用該在線凈化分析測(cè)定方法對(duì)送檢的13份大米樣品進(jìn)行分析,其中1份檢出乙草胺,含量為4.5 μg/kg。

3 結(jié)論

本方法以甲基丙烯酸丁酯為單體,乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑構(gòu)筑了疏水在線整體柱,構(gòu)建了整體柱在線固相萃取與三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定大米中15種酰胺類除草劑的檢測(cè)手段。該整體柱制備簡(jiǎn)單,可重復(fù)多次使用,大大降低了成本和對(duì)環(huán)境的污染。與傳統(tǒng)凈化方式相比,在線凈化技術(shù)簡(jiǎn)化了前處理過(guò)程,操作簡(jiǎn)單、快速,提高了工作效率。該方法快速,準(zhǔn)確,成本低,可用于大米中15種酰胺類除草劑的檢測(cè)。