QuEChERS-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)羊肉中8種抗真菌藥

張 凱, 秦 宇, 卞 華, 曹 慧, 劉天益, 葛 宇*

(1. 上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院, 上海 200093; 2. 上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)技術(shù)研究院, 上海 200233)

抗真菌藥(antifungal drugs)泛指一些能抑制或滅殺真菌的藥物,是治療真菌感染疾病的合成抗菌藥。目前,世界上約有80種抗真菌藥用于臨床治療[1,2],按化學(xué)結(jié)構(gòu)大致分為棘白菌素類、多烯類、嘧啶類、丙烯胺類和唑類,根據(jù)作用部位分為外用藥和內(nèi)服藥。

抗真菌藥的發(fā)展大致可分為3代:第1代,1939年,研究者從微生物青霉菌發(fā)酵代謝產(chǎn)物中分離得到灰黃霉素(griseofulvin),用于抑制皮膚癬菌[3];第2代為咪唑類,主要包括1981年在美國(guó)上市的酮康唑(ketoconazole)口服制劑、克霉唑(clotrimazole)、咪康唑(miconazole)、益康唑(econazole);第3代為三唑類,包括1990～1992年開始在美國(guó)使用的氟康唑(fluconazole)和伊曲康唑及1995～1996年上市的烯丙胺類藥物特比萘芬等。新抗真菌藥的研究和開發(fā)主要集中在降低藥物的毒副作用、對(duì)唑類藥物進(jìn)行優(yōu)化和開發(fā)、篩選新結(jié)構(gòu)和新作用機(jī)制的藥物[4],但目前新發(fā)現(xiàn)的多數(shù)抗真菌藥存在抗真菌普過窄、體內(nèi)活性微弱或細(xì)胞毒性較強(qiáng)的問題[5]。

目前只有10種多烯類、嘧啶類和唑類的抗真菌藥被美國(guó)食品和藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)用于人體全身性真菌治療[6]。有關(guān)抗真菌藥檢測(cè)方法的研究也主要集中于人用藥物,如近年來建立了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定抗真菌藥在乳膏等藥劑中的含量，以及在人體血漿和尿液中的殘留量[7-9]。李力等[10]采用HPLC-MS/MS法測(cè)定了人體血漿中泊沙康唑的含量;彭博等[11]采用HPLC法測(cè)定了復(fù)方克霉唑乳膏中二丙酸倍他米松和克霉唑的含量。關(guān)于食品基質(zhì)中抗真菌藥測(cè)定的研究較少,Othman等[12]建立了測(cè)定牛奶樣品中唑類抗真菌藥的HPLC法。該方法前處理過程復(fù)雜且基質(zhì)干擾較強(qiáng),不適于處理批量樣品，且易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。

研究過程中發(fā)現(xiàn),部分羊肉中存在氟康唑、咪康唑和酮康唑等抗真菌藥的殘留,然而國(guó)內(nèi)外均未開展肉類產(chǎn)品中此類抗生素檢測(cè)方法的研究,已發(fā)布的標(biāo)準(zhǔn)與法規(guī)對(duì)此類化合物也未作涉獵。我國(guó)現(xiàn)行的農(nóng)業(yè)部235號(hào)公告(動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量(MRL))對(duì)抗真菌藥在畜禽養(yǎng)殖過程中的使用限量均未作規(guī)定,只在2015年版中華人民共和國(guó)獸藥典中提及抗真菌藥中的水楊酸及其軟膏制劑可用于獸藥臨床的治療。

本文借鑒化妝品安全技術(shù)規(guī)范(2015版)《液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定化妝品中氟康唑等9種組分的含量》[13],擬利用QuEChERS技術(shù)進(jìn)行快速前處理,建立了超高壓液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)羊肉中8種抗真菌藥殘留的方法。該法可為食品中抗真菌藥檢測(cè)方法的建立提供可靠的技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

QTRAP 6500三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀,配有電噴霧電離(ESI)源、Analyst儀器控制及數(shù)據(jù)處理軟件(美國(guó)AB Sciex公司);超高效液相色譜儀,包括G4200A流動(dòng)相輸送泵、G4226A自動(dòng)進(jìn)樣器、G1316C柱溫箱(美國(guó)Agilent公司); MSZO4S/Z型電子天平(瑞士Mettler Toledo公司); Centrifuge 5804高速離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)、D-91126多管渦旋振蕩器(德國(guó)Heidolph公司)、Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司)甲醇、乙腈(色譜純,美國(guó)Thermo Fisher公司);甲酸(色譜純,美國(guó)ACS公司);醋酸銨(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司); QuEChERS dSPE EMR-Lipid凈化管、MgSO4粉包、50 mL陶瓷均質(zhì)子(美國(guó)Agilent公司);實(shí)驗(yàn)室用水為超純水。

標(biāo)準(zhǔn)品:克霉唑、萘替芬(natifine)、聯(lián)苯芐唑(bifonazole)、咪康唑、酮康唑、益康唑、氟康唑、灰黃霉素,純度均≥98% ,均購(gòu)自德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司。

羊肉樣品均采自上海市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng),其中崇明區(qū)80批次、金山區(qū)30批次、奉賢區(qū)20批次。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取8種抗真菌藥各10.0 mg,用甲醇溶解并定容至100 mL容量瓶中,配制成100.0 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,于-18 ℃保存;分別移取適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,用3.0%(v/v)乙腈水溶液稀釋,配制成1.0 mg/L 混合中間液;使用時(shí)根據(jù)需要用相應(yīng)的空白樣品基質(zhì)提取溶液配制適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 樣品前處理

1.3.1提取

準(zhǔn)確稱取均質(zhì)后的試樣5.00 g(精確至0.01 g),置于50 mL具塞離心管中,加入2.0 mL純水與兩粒陶瓷均質(zhì)子,渦旋2 min至試樣呈灰白色;加入10.0 mL 2.0%(v/v)甲酸乙腈溶液,渦旋5 min,以 9 000 r/min 離心3 min。

1.3.2凈化

取5.0 mL 5 mmol/L 乙酸銨水溶液,移至QuEChERS dSPE EMR-Lipid凈化管中進(jìn)行活化,渦旋2 min;移取離心后的上層提取液5.0 mL,轉(zhuǎn)移至活化好的凈化管中,渦旋2 min,以 9 000 r/min 離心3 min。

1.3.3反萃

將凈化離心后的上層液轉(zhuǎn)移至含有兩粒陶瓷均質(zhì)子的50 mL具塞離心管中,快速倒入MgSO4粉包,渦旋2 min,以 9 000 r/min 離心3 min,取1 mL離心后的溶液過0.22 μm聚四氟乙烯(PTFE)濾膜,供UPLC-MS/MS檢測(cè)。

1.4 分析條件

色譜柱:Atiantis?T3柱(100 mm×2.1 mm, 3 μm);柱溫30 ℃;樣品室溫度15 ℃;流動(dòng)相A: 0.1%(v/v)甲酸水溶液;流動(dòng)相B:乙腈;流速:0.3 mL/min。梯度洗脫程序:0～1 min, 3%B; 1～5 min, 3%B～50%B; 5～6 min, 50%B～95%B; 6～7 min, 95%B; 7～8 min, 95%B～3%B; 8～9 min, 3%B。進(jìn)樣體積:5 μL。

離子源:電噴霧電離源,正離子模式(ESI+);掃描方式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM);離子源溫度(TEM): 350 ℃;電噴霧壓力(IS): 5 500 V;氣簾氣壓力(CUR): 0.28 MPa;霧化氣壓力(GS1): 0.34 MPa;輔助氣壓力(GS2): 0.41 MPa。8種抗真菌藥物的監(jiān)測(cè)離子對(duì)(Q1/Q3)、去簇電壓(DP)、碰撞能量(CE)見表1。

表 1 8種抗真菌藥的質(zhì)譜參數(shù)

* Quantitative ion.

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

8種目標(biāo)化合物屬咪唑類、三唑類、多烯類等抗真菌藥,化學(xué)結(jié)構(gòu)差異較大,使用等度洗脫較難實(shí)現(xiàn)理想的分離效果。本實(shí)驗(yàn)采用Atiantis?T3色譜柱(100 mm×2.1 mm, 3 μm)對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行梯度洗脫,同時(shí)考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%(v/v)甲酸水、乙腈-0.1%(v/v)甲酸水作為流動(dòng)相時(shí),目標(biāo)物的分離效果和色譜峰形。結(jié)果表明,采用乙腈-0.1%(v/v)甲酸水時(shí),抗真菌藥物的離子化效率較高,目標(biāo)化合物分離效果與峰形良好,質(zhì)譜響應(yīng)最優(yōu)。因此,本實(shí)驗(yàn)采用乙腈-0.1%(v/v)甲酸水溶液作為流動(dòng)相。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

配制1.0 mg/L 8種抗真菌藥的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,采用注射泵直接進(jìn)樣的方式注入質(zhì)譜儀。采用ESI+掃描方式進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜分析,確定母離子[M+H]+,優(yōu)化DP。對(duì)母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描,優(yōu)化CE,選取相對(duì)豐度較高且穩(wěn)定的兩個(gè)特征碎片離子作為定性、定量離子,以滿足歐盟657/2002/EC指令對(duì)禁用藥物定性檢測(cè)的規(guī)定,即滿足1個(gè)母離子和至少2個(gè)子離子共4個(gè)識(shí)別點(diǎn)數(shù)的要求。本實(shí)驗(yàn)8種抗真菌藥的質(zhì)譜參數(shù)見表2。圖1為8種抗真菌藥物在該分析條件下的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖。

表 2 羊肉中8中抗真菌藥的線性方程、相關(guān)系數(shù)(R2)、檢出限、定量限和基質(zhì)效應(yīng)

Y: peak area;X: mass concentration, μg/L.

圖 1 8種抗真菌藥的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖Fig. 1 Chromatograms of the eight antifungal drugs in MRM mode

2.3 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.3.1提取溶劑的優(yōu)化

乙腈極性范圍寬,組織穿透能力強(qiáng),對(duì)糖、脂肪、蛋白質(zhì)類化合物的提取率低,同時(shí)對(duì)多數(shù)目標(biāo)化合物有較好的溶解性和較高的提取效率;乙酸乙酯的極性相對(duì)較弱,毒性較低,二者均是較為理想的提取溶劑。降低提取溶劑的pH值能夠有效破壞基質(zhì)的組織結(jié)構(gòu),使目標(biāo)物質(zhì)從組織結(jié)構(gòu)中游離出來。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)羊肉樣品比較了采用乙酸乙酯、乙腈、含1.0%(v/v)甲酸的乙腈和含1.0%(v/v)甲酸的乙酸乙酯4種提取溶劑時(shí)8種目標(biāo)化合物的提取效率(見圖2)。為展現(xiàn)不同提取溶劑對(duì)目標(biāo)化合物在羊肉基質(zhì)中回收率的影響,8種抗真菌藥所得的回收率均由溶劑曲線校正。結(jié)果表明,乙酸乙酯對(duì)除灰黃霉素、克霉唑和氟康唑以外的其他5種抗生素的提取效率均不理想,采用含1.0%(v/v)甲酸的乙酸乙酯作提取溶劑時(shí)這5種化合物的提取效率仍無明顯改善;乙腈作為提取溶劑時(shí),8種抗真菌藥的平均回收率均低于10.0% ,但采用含1.0%(v/v)甲酸的乙腈溶液作為提取溶劑時(shí),目標(biāo)化合物的平均回收率顯著提升。

為減弱基質(zhì)效應(yīng)(ME)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響,實(shí)驗(yàn)考察了在基質(zhì)匹配曲線的校正下,甲酸在乙腈中的體積分?jǐn)?shù)對(duì)目標(biāo)化合物提取效率的影響(見圖3)。結(jié)果表明,隨著甲酸體積分?jǐn)?shù)的增加,目標(biāo)化合物的回收率均有所增加,當(dāng)采用含2.0%(v/v)甲酸的乙腈溶液提取時(shí),8種抗真菌藥平均回收率為99.9% 。隨著甲酸體積分?jǐn)?shù)的繼續(xù)增加,目標(biāo)化合物的回收率急劇下降,可能是因?yàn)樗岬暮窟^高,導(dǎo)致基質(zhì)發(fā)生膠化。因此,本實(shí)驗(yàn)選用含2.0%(v/v)甲酸的乙腈溶液作為提取溶劑。

圖 2 不同提取溶劑對(duì)羊肉樣品中8種抗真菌藥回收率的影響Fig. 2 Effects of different extraction solvents on the recoveries of the eight antifungal drugs in mutton samples

圖 3 甲酸在乙腈中的體積分?jǐn)?shù)對(duì)羊肉樣品中8種抗真菌藥回收率的影響Fig. 3 Effect of volume fractions of formic acid in acetonitrile on the recoveries of the eight antifungal drugs in mutton samples

2.3.2提取方式及時(shí)間的優(yōu)化

超聲波具有極端的物理特性,能促使基質(zhì)組織破壁變形;渦旋有利于提取溶劑與基質(zhì)的充分混合,有助于目標(biāo)化合物的溶解。實(shí)驗(yàn)考察了超聲波提取(5、10、20 min)和渦旋提取(1、2、5 min)對(duì)提取效率的影響。結(jié)果表明,超聲提取5 min和渦旋提取2 min均可獲得較好回收率,但考慮到批量處理樣品的可操作性,最終選擇渦旋提取2 min。

2.4 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.4.1基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)是指基質(zhì)成分和目標(biāo)化合物在進(jìn)行離子化時(shí)相互競(jìng)爭(zhēng)而導(dǎo)致目標(biāo)化合物信號(hào)強(qiáng)度有不同程度的增強(qiáng)或減弱的現(xiàn)象，包括基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)和基質(zhì)抑制效應(yīng)。盡管樣品經(jīng)過沉淀蛋白、分散固相萃取后取得了良好的凈化效果,但仍無法完全消除基質(zhì)效應(yīng),而基質(zhì)效應(yīng)的存在會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響。因此,在建立LC-MS/MS檢測(cè)方法時(shí)應(yīng)對(duì)基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行評(píng)價(jià),并采取消除措施,以保證結(jié)果的準(zhǔn)確、可靠。

基質(zhì)效應(yīng)可采用(基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率/溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率-1)×100%進(jìn)行評(píng)價(jià)(見表2),負(fù)值表示存在基質(zhì)抑制效應(yīng),正值表示存在基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng),絕對(duì)值越大則基質(zhì)效應(yīng)越強(qiáng)[14]。由表2可知,羊肉對(duì)8種抗真菌藥物均存在很強(qiáng)的基質(zhì)抑制效應(yīng),為了減弱基質(zhì)效應(yīng)對(duì)檢測(cè)的影響,實(shí)驗(yàn)采用基質(zhì)匹配曲線來確定方法的檢出限。

2.4.2線性范圍與檢出限

按1.2節(jié)描述配制6個(gè)水平的基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,在選定的色譜條件和質(zhì)譜參數(shù)下進(jìn)行檢測(cè)。以目標(biāo)化合物定量離子的峰面積(Y)為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度(X, μg/L)為橫坐標(biāo)繪制工作曲線,8種抗真菌藥的線性范圍為0.2～50 μg/kg,相關(guān)系數(shù)≥0.997 8,線性關(guān)系良好。以定量離子信噪比(S/N)為3和10計(jì)算樣品的檢出限(LOD)和定量限(LOQ),結(jié)果見表3。

2.5 回收率與精密度

按1.3節(jié)樣品前處理方法,向空白基質(zhì)中分別加入低、中、高3個(gè)水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行加標(biāo)回收率的測(cè)定(n=6)。結(jié)果表明,羊肉中8種抗真菌藥的平均加標(biāo)回收率為70.3% ～118.4% , RSD為0.4% ～4.3%(見表3)。

2.6 實(shí)際樣品檢測(cè)

應(yīng)用所建方法對(duì)上海市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)的羊肉產(chǎn)品(130批次)進(jìn)行分析檢測(cè),其中,5批次樣品檢出氟康唑,含量分別為3.12、5.38、7.59、7.89和8.66 μg/kg,其余樣品均未檢出目標(biāo)化合物。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定羊肉中8種抗真菌藥的分析方法。該方法靈敏高效,回收率優(yōu)良,重復(fù)性穩(wěn)定,適用于羊肉樣品抗真菌藥物的檢測(cè),可為此類化合物檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的建立提供技術(shù)支持。