62株耐碳青霉烯類鮑曼不動(dòng)桿菌的同源性分析

何 磊，邱景富

(重慶醫(yī)科大學(xué)，重慶 400016)

鮑曼不動(dòng)桿菌 (Acinetobacterbaumannii，AB)屬于非發(fā)酵革蘭陰性球桿菌，營(yíng)養(yǎng)要求不高，易存活于各類非生物體表面[1]，在醫(yī)院各類環(huán)境中廣泛存在[2-3]，尤其是各類重癥監(jiān)護(hù)病房(intensive care unit,ICU)。近年多次報(bào)道AB在醫(yī)院內(nèi)引起流行和暴發(fā)[4-6]。AB耐藥形勢(shì)嚴(yán)峻，2015年CHINET中國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)數(shù)據(jù)顯示，AB對(duì)亞胺培南和美羅培南的耐藥率分別為62.00%、70.50%[7]，故耐碳青霉烯類鮑曼不動(dòng)桿菌(carbapenem-resistantAcinetobacterbaumannii,CRAB)給臨床防治帶來(lái)極大困難，需要對(duì)其傳播途徑和同源性進(jìn)行研究。了解傳染源及傳播途徑，采取相應(yīng)的措施有效控制AB醫(yī)院流行和暴發(fā)[8]。本研究采用脈沖場(chǎng)凝膠電泳(pulsed-field gel electrophoresis, PFGE)技術(shù)對(duì)中國(guó)西南某區(qū)縣三級(jí)甲等醫(yī)院某時(shí)段分離的CRAB進(jìn)行同源性分析，結(jié)合臨床資料進(jìn)行流行病學(xué)分析，以期提出更精準(zhǔn)的防控措施。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源 某三甲綜合醫(yī)院2015年8月—2016年11月住院患者各類臨床標(biāo)本分離的62株CRAB，剔除同一患者長(zhǎng)期住院或反復(fù)住院分離的重復(fù)菌株。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922和銅綠假單胞菌ATCC 27853。

1.3 PFGE 試驗(yàn) (1)挑取AB單菌落接種于營(yíng)養(yǎng)平板，37 ℃孵育過(guò)夜，用比濁儀調(diào)整細(xì)菌懸液濃度，使?jié)岫葹?.80～4.20，加入1% Seakem Gold膠，混勻制備膠塊；(2)使用含蛋白酶K細(xì)胞裂解液(CLB)消化2 h，純水清洗膠塊2次，TE(10 mmol/L Tris:1 mmol/L EDTA，pH 8.00)清洗膠塊4次；(3)使用60 U ApaI(TAKARA公司)內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，在37 ℃孵育4 h；(4)在CHEF-DRIII(Bio-Rad Laboratories公司)電泳儀中進(jìn)行脈沖場(chǎng)電泳，電泳參數(shù)為5～20 s，19 h，電泳結(jié)束后，使用GelRed核酸染料染色，在凝膠成像儀中成像并保存。

1.4 PFGE分型標(biāo)準(zhǔn) 利用BioNumeric軟件對(duì)圖進(jìn)行分析，圖譜條帶數(shù)量和大小相同為同一型別，3個(gè)條帶以下有差異為同一型別的不同亞型，4個(gè)條帶以上差異為不同型別。

2 結(jié)果

2.1 菌株來(lái)源 標(biāo)本以痰為主(55份)，其余為血(4份)、支氣管肺泡灌洗液(簡(jiǎn)稱灌洗液，2份)和腦脊液(1份)?；颊咧心信詣e比為1.58∶1，年齡(56±14)歲，診斷為腦卒中(34例)、慢性阻塞性肺疾病(10例)、腦外傷(10例)、多發(fā)傷(5例)、腫瘤(2例)和冠心病(1例)。

2.2 藥敏結(jié)果 62株CRAB對(duì)頭孢他啶、頭孢吡肟、亞胺培南、美羅培南、環(huán)丙沙星均耐藥，對(duì)氨基糖苷類的慶大霉素和妥布霉素的耐藥率較低，均為69.35%,對(duì)左氧氟沙星的耐藥率(25.81%)最低。見(jiàn)表1。

表1 62株CRAB的藥敏結(jié)果[株數(shù)(%)]Table 1 Antimicrobial susceptibility testing results of 62 strains of CRAB (No. of isolates[%])

2.3 PFGE結(jié)果 62株CRAB分為14個(gè)不同的型別，分別為A～N型，B、D、E、J和M型別僅包含1株菌，其中F型別包含5個(gè)亞型，A、G、H和K型別均有3個(gè)亞型，C和I型各有2個(gè)亞型。見(jiàn)圖1、表2。

M：標(biāo)準(zhǔn)菌株，1和6為I2亞型，2和5為F1亞型，3為H1亞型，4、10、11均為G1亞型，7為K2亞型，8為B型，9為G2亞型

圖1部分菌株P(guān)FGE電泳圖譜
Figure1PFGE electrophoresis map of partial strains

表2 62株CRAB的PFGE分型結(jié)果Table 2 PFGE typing results of 62 CRAB strains

2.4 流行病學(xué)關(guān)聯(lián) 對(duì)主要的克隆株臨床資料進(jìn)行分析，32株菌(占51.61%)來(lái)自ICU，另有12株菌(占19.35%)的分離患者曾入住ICU。3株F2型菌株分離時(shí)間分別為2016年4月3日(首發(fā)菌株且來(lái)源于ICU)、4月10日和4月16日，分布在ICU、神經(jīng)外科和呼吸內(nèi)科，且來(lái)源于非ICU的菌株分離患者均曾入住過(guò)ICU。2015年8月15日—9月7日3株G1型菌株分別來(lái)自消化內(nèi)科和ICU，且3位患者均在ICU住過(guò)，2016年8月10日—11月14日分離4株菌屬于G1型，首發(fā)病例在ICU入住，其余均來(lái)源于呼吸內(nèi)科(其中1株分離的患者入住過(guò)ICU)。4株K3型菌株和3株L型菌株均來(lái)自ICU。見(jiàn)表3。

表3 主要CRAB克隆菌株的基本信息Table 3 Basic information of the main CRAB cloned strains

3 討論

菌株同源性分析常用的方法有多位點(diǎn)序列分析(MLST)、多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列分析(MLVA)和PFGE等，其中PFGE以其重復(fù)性好、分辨力強(qiáng)被譽(yù)為細(xì)菌分子分型技術(shù)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，在識(shí)別和追蹤感染暴發(fā)或流行中廣泛應(yīng)用[17-18]。本研究菌株P(guān)FGE結(jié)果顯示，62株菌分為14個(gè)不同的型別，其中5個(gè)型別只包含1株菌，存在散發(fā)菌株，與多數(shù)研究[19-24](來(lái)自臨床的標(biāo)本且未區(qū)分社區(qū)和醫(yī)院感染，較少提及散發(fā)菌株)結(jié)果不同，但仍有部分報(bào)道提示存在散發(fā)菌株，馬真[25]對(duì)138株AB進(jìn)行同源性分析發(fā)現(xiàn),24株散發(fā)菌株;周嬌嬌[26]在55株AB中發(fā)現(xiàn)3株散發(fā)菌株。本研究追蹤了B、D、E、J和M型菌株分離患者3個(gè)月內(nèi)的住院史，5名患者都在不同級(jí)別的醫(yī)院住院，提示分離的AB多為外部帶入，與林家福[27]分子流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果一致，四川北部地區(qū)有2所醫(yī)院存在相同基因型的CRAB。本研究調(diào)查的醫(yī)院為區(qū)縣級(jí)醫(yī)院，在分級(jí)診療的政策背景下作為大型綜合醫(yī)院和基層醫(yī)院的結(jié)合點(diǎn)，要接收下級(jí)醫(yī)院轉(zhuǎn)診的患者，同時(shí)也要接收上級(jí)醫(yī)院轉(zhuǎn)回的患者，導(dǎo)致散發(fā)菌株較多。AB已成為一個(gè)全球化的病原體并且在不斷進(jìn)化[28]，雖存在外部輸入的可能，但14個(gè)PFGE型別中存在多個(gè)克隆菌株且分布于多個(gè)科室，提示醫(yī)院傳播仍是AB流行傳播的主要形式。3株F2亞型菌株分離間隔時(shí)間不超過(guò)1周，2例非ICU病例在入住ICU期間與首發(fā)ICU病例同在一個(gè)四人間進(jìn)行治療；3株K3型中的2例患者分離時(shí)間僅間隔1 d且床位相鄰，另外1例患者的分離時(shí)間與首發(fā)病例相距近1個(gè)月，但其住院時(shí)間較長(zhǎng)，與前2名患者均曾相鄰，故F2型和K3型發(fā)生醫(yī)院感染暴發(fā)可能性大。G1型菌株存在兩次疑似暴發(fā)，第1次疑似暴發(fā)首發(fā)病例為入住過(guò)ICU的消化內(nèi)科CRAB血流感染患者，僅有1例ICU患者與消化內(nèi)科患者在ICU的同一四人間相對(duì)的床位入住，另1例患者入住ICU時(shí)，其他患者已轉(zhuǎn)出ICU，且所在床位與消化內(nèi)科患者并未在同一四人間；第2次疑似暴發(fā)首發(fā)病例為ICU病例，其余3例患者來(lái)自呼吸內(nèi)科，其中1例呼吸內(nèi)科患者入住過(guò)ICU且與首發(fā)病例在ICU有共同入住時(shí)間，但床位相距較遠(yuǎn)，另2例呼吸內(nèi)科患者均未入住ICU，住院時(shí)間也無(wú)交集，床位也不相鄰。L型3株分離間隔時(shí)間均超過(guò)1個(gè)月，住院時(shí)間無(wú)交叉，無(wú)床位聚集，不能確定為暴發(fā)。G1型和L型疑似暴發(fā)的病例并未全部在短時(shí)間內(nèi)形成病例聚集，床單元聚集趨勢(shì)不明顯，CRAB醫(yī)院傳播明確，一部分亞型菌株形成暴發(fā)，另一部分亞型菌株長(zhǎng)期存在于科室造成所住患者感染。所有暴發(fā)的首發(fā)病例均來(lái)自于ICU或者與ICU有關(guān)。存在潛在傳染源的科室應(yīng)對(duì)物體表面進(jìn)行徹底消毒，特別是醫(yī)務(wù)人員頻繁接觸的物體表面，如床欄桿、床旁桌、病床隔簾、門(mén)把手、護(hù)理站臺(tái)面、病歷夾、電話按鍵、電腦鍵盤(pán)、鼠標(biāo)、呼吸機(jī)操作面板、監(jiān)護(hù)儀面板、微量注射泵、輸液泵等。物體表面與AB流行和暴發(fā)有較強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性[29-30]，在床位不緊張時(shí)實(shí)行輪換制度，對(duì)空置的病區(qū)進(jìn)行消毒，經(jīng)過(guò)監(jiān)測(cè)合格后再重新開(kāi)放。對(duì)于新發(fā)現(xiàn)的CRAB，一定要采取隔離措施。研究[31]表明，有效的消毒隔離措施對(duì)控制醫(yī)院流行和暴發(fā)有重要作用。醫(yī)務(wù)人員的手也可能成為AB的傳播媒介[32]，應(yīng)加強(qiáng)手衛(wèi)生，有效控制其醫(yī)院傳播。本研究屬于回顧性研究，無(wú)法對(duì)當(dāng)時(shí)的環(huán)境或可疑物品進(jìn)行采樣，不能對(duì)其更詳細(xì)的傳播途徑進(jìn)行闡述，在今后研究中需要改進(jìn)。

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