廣州市ICU環(huán)境中耐碳青霉烯類鮑曼不動(dòng)桿菌的克隆相關(guān)性

林云萬(wàn)，周 勇，張 旭，李曉寧，趙正陽(yáng)，劉 遠(yuǎn)

(廣州市疾病預(yù)防控制中心，廣東 廣州 510440)

鮑曼不動(dòng)桿菌是引起醫(yī)院感染的重要致病菌，可引起包括敗血癥、肺炎、腦膜炎、心內(nèi)膜炎、創(chuàng)口感染和尿路感染等在內(nèi)的多種醫(yī)院感染。隨著廣譜抗菌藥物的廣泛使用，耐碳青霉烯類鮑曼不動(dòng)桿菌(carbapenem-resistantAcinetobacterbaumannii，CRAB)已經(jīng)在全球流行,給臨床醫(yī)生抗感染治療帶來(lái)嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。重癥監(jiān)護(hù)病房(intensive care unit，ICU)患者多重耐藥菌感染已成為醫(yī)院感染控制工作的重點(diǎn)。由于感染患者或定植者可將病原菌，尤其是多重耐藥菌經(jīng)多個(gè)途徑排出體外，污染其居住或活動(dòng)的周圍環(huán)境。若日常的清潔與消毒不到位，殘留的病原體可以在環(huán)境表面長(zhǎng)期存活，并通過(guò)直接接觸污染的表面或借助醫(yī)務(wù)人員的手，在醫(yī)院內(nèi)傳播[1]。環(huán)境表面是病原體的儲(chǔ)藏庫(kù)，鮑曼不動(dòng)桿菌在醫(yī)院環(huán)境中流行情況和流行方式還不清晰，本研究對(duì)廣州市ICU環(huán)境中分離的CRAB進(jìn)行碳青霉烯酶OXA基因檢測(cè)，并通過(guò)脈沖場(chǎng)凝膠電泳(pulsed-field gel electrophoresis,PFGE)和多位點(diǎn)序列分型(multilocus sequence typing,MLST)技術(shù)對(duì)環(huán)境分離株進(jìn)行克隆相關(guān)性分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來(lái)源 2013年3—7月采集廣州市7所醫(yī)院(醫(yī)院規(guī)模為600～2 200床位)ICU環(huán)境樣本和醫(yī)務(wù)人員手樣本共156份，從其中7所醫(yī)院ICU分離鑒定出39株CRAB。

1.1.2 主要儀器 VITEK 2 Compact微生物分析系統(tǒng)及配套的細(xì)菌鑒定卡、Bio-rad 脈沖場(chǎng)凝膠電泳儀、Bio-rad紫外線投射凝膠成像系統(tǒng)、Bio-rad PCR儀。

1.1.3 主要試劑 PFGE專用瓊脂糖凝膠、限制性內(nèi)切酶ApaI和XbaI、TadDNA聚合酶等生化試劑為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；碳青霉烯酶OXA基因的特異性引物參照文獻(xiàn)[2-3]合成，7個(gè)管家基因gltA、gyrB、gdhB、recA、cpn60、gpi和rpoD的特異性引物采用鮑曼不動(dòng)桿菌MLST數(shù)據(jù)庫(kù)的推薦引物(http://pubmlst.org/abaumannii/info/primers.shtml),均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。藥敏試驗(yàn)所用抗菌藥物為法國(guó)生物梅里埃公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 選取ICU患者或醫(yī)務(wù)人員手接觸頻繁的物體表面，如氣管插管、床欄、儀器按鈕等，將無(wú)菌棉簽蘸取中和劑后采用涂抹法采集樣本；醫(yī)生、護(hù)士手采用涂抹法采集樣本；采用空氣采集器采集ICU大廳和隔離病房空氣樣本于磷酸鹽緩沖液中。

1.2.2 細(xì)菌鑒定和藥敏試驗(yàn) 細(xì)菌培養(yǎng)按照臨床微生物學(xué)檢驗(yàn)規(guī)定的常規(guī)試驗(yàn)操作進(jìn)行，使用梅里埃VITEK 2全自動(dòng)微生物分析儀鑒定出鮑曼/醋酸鈣不動(dòng)桿菌復(fù)合體，并通過(guò)16S-23S rRNA間區(qū)擴(kuò)增片段的比對(duì)，進(jìn)一步鑒定出鮑曼不動(dòng)桿菌。采用K-B法檢測(cè)鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)常見(jiàn)藥物的敏感性，藥敏結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)2015年標(biāo)準(zhǔn)。大腸埃希菌ATCC 25922為質(zhì)控菌株。對(duì)亞胺培南耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌可判定為CRAB。

1.2.3 碳青霉烯酶OXA基因檢測(cè) 采用煮沸法提取細(xì)菌DNA，應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)檢測(cè)OXA基因，具體操作參照試劑盒說(shuō)明，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)100V恒壓、1%瓊脂糖凝膠電泳后觀察擴(kuò)增條帶。

1.2.4 PFGE分型 菌懸浮液經(jīng)瓊脂糖凝膠包被、蛋白酶K消化和限制性內(nèi)切酶ApaI酶切后，用1%瓊脂糖凝膠、電壓6 V/cm進(jìn)行電泳，EB染色后成像。PFGE結(jié)果按美國(guó)疾病控制與預(yù)防中心Tenover等[4]推薦的方法判讀，圖譜完全一致定為同一型，有1～3個(gè)條帶不同者為同一型的不同亞型，差異3個(gè)條帶以上者為另一型。

1.2.5 MLST PCR反應(yīng)體系參照試劑盒說(shuō)明。純化后的PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序，利用DNA star軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列校正、拼接。測(cè)序結(jié)果提交至Genbank,將7個(gè)管家基因序列與鮑曼不動(dòng)桿菌MLST數(shù)據(jù)庫(kù)上相應(yīng)的等位基因進(jìn)行比對(duì)分析，獲得每個(gè)等位基因的數(shù)值，然后將每株細(xì)菌按照gltA、gyrB、gdhB、recA、cpn60、gpi和rpoD的順序排列成等位基因譜，對(duì)每株細(xì)菌進(jìn)行序列分型。

2 結(jié)果

2.1 CRAB來(lái)源 7所醫(yī)院ICU環(huán)境和醫(yī)務(wù)人員標(biāo)本分離CRAB情況見(jiàn)表1。

2.2 藥敏結(jié)果 39株環(huán)境分離的CRAB均表現(xiàn)為多重耐藥，耐藥情況見(jiàn)表2。

2.3 碳青霉烯酶基因檢測(cè)結(jié)果 39株(100%)CRAB均攜帶OXA-51基因，37株(94.9%)攜帶OXA-23基因,OXA-24、OXA-58基因均未檢出。

2.4 PFGE分型結(jié)果 運(yùn)用PFGE方法對(duì)39株CRAB的克隆多態(tài)性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示其中38株CRAB可分為5個(gè)型，包括A型28株，B型4株，C、D、E型各2株，另有1株為偶發(fā)株。見(jiàn)圖1。

表1 7所醫(yī)院ICU醫(yī)務(wù)人員和環(huán)境標(biāo)本CRAB分離情況Table 1 Isolation of CRAB from health care workers and environmental specimens in ICUs of 7 hospitals

2.5 MLST結(jié)果 7個(gè)管家基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果經(jīng)測(cè)序比對(duì)后顯示，39株CRAB的gltA等位基因位點(diǎn)相同，為1；gyrB、gdhB、recA、cpn60、rpoD各有2個(gè)等位基因位點(diǎn)，分別為3和15、3和2、2和28、2和61、3和32；每個(gè)ST型的gpi各有1個(gè)等位基因位點(diǎn)，分別為96、154、59、16、153、107、97、140。39株CRAB分為8個(gè)ST型，其中ST195共19株，占48.7%；ST829共5株，占12.8%；ST365和ST136各有4株，ST457共3株，ST229共2株，ST208和ST17各1株。見(jiàn)表3。

圖1 39株CRAB的PFGE聚類分析結(jié)果Figure 1 PFGE cluster analysis of 39 strains of CRAB

表2 39株CRAB環(huán)境株對(duì)抗菌藥物的耐藥率(%)Table 2 Antimicrobial resistance rates of 39 CRAB strains from environment(%)

表3 39株CRAB等位基因型及ST型分型結(jié)果Table 3 Allele types and sequence types of 39 strains of CRAB

3 討論

鮑曼不動(dòng)桿菌生存能力強(qiáng)，可在環(huán)境表面長(zhǎng)期定植，是ICU醫(yī)院獲得性感染的主要致病菌。侯鐵英等[5]發(fā)現(xiàn)，鮑曼不動(dòng)桿菌在感染患者和環(huán)境間存在相互傳播。對(duì)ICU環(huán)境中CRAB進(jìn)行分子分型研究，有利于我們了解其流行情況和流行方式，從而指導(dǎo)我們對(duì)CRAB感染的預(yù)防和控制。

碳青霉烯類抗生素對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌有較好的抗菌活性，是治療其重癥感染的首選藥物。鮑曼不動(dòng)桿菌一旦對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥，將給臨床抗感染治療帶來(lái)嚴(yán)峻挑戰(zhàn)[6]。中國(guó)耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)顯示，2004—2014年鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)碳青霉烯類耐藥率從13.3%上升至70.5%，泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌檢出率從 11.1%上升至 60.4%[7]。本研究中收集的CRAB來(lái)源于ICU環(huán)境，所有菌株均表現(xiàn)為多重耐藥，部分甚至出現(xiàn)泛耐藥，與國(guó)內(nèi)報(bào)道[8]的臨床分離株耐藥情況基本一致。

鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥主要是由于產(chǎn)碳青霉烯酶、主動(dòng)外排系統(tǒng)、膜孔蛋白的缺失和青霉素結(jié)合蛋白的改變等，其中最主要的原因?yàn)楫a(chǎn)碳青霉烯酶。碳青霉烯酶包括Ambler分類的A、B和D類，不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌以D類酶(OXA型)為主，根據(jù)氨基酸序列的同源性可將鮑曼不動(dòng)桿菌的D類苯唑西林酶分為OXA-23、OXA-24、OXA-51和OXA-58[9]。OXA-23是全球流行最廣泛的碳青霉烯酶,且產(chǎn)OXA-23的鮑曼不動(dòng)桿菌是引起醫(yī)院感染暴發(fā)的主要病原菌[10]。國(guó)內(nèi)報(bào)道較多的也為D類的OXA-23。OXA-51型基因被認(rèn)為是鮑曼不動(dòng)桿菌天然固有的碳青霉烯酶基因，OXA-51型碳青霉烯酶除了水解青霉素，也能水解碳青霉烯類抗生素，但作用非常弱。在鮑曼不動(dòng)桿菌鑒定時(shí)，PCR檢測(cè)OXA-51基因作為一種新方法可以縮短鑒定時(shí)間[11]。本組39株CRAB，100%攜帶OXA-51基因，94.9%攜帶OXA-23基因，未發(fā)現(xiàn)OXA-24和OXA-58基因。可見(jiàn)，廣州地區(qū)ICU環(huán)境中的CRAB可能主要是由OXA-23基因編碼產(chǎn)生的碳青霉烯酶引起。

PFGE技術(shù)被認(rèn)為是細(xì)菌分子流行病學(xué)分析的“金標(biāo)準(zhǔn)”。通過(guò)該方法可將38株CRAB分為5個(gè)克隆(90%以上的相似性),另有一株為偶發(fā)菌株。其中A克隆有28株菌，來(lái)自5所三級(jí)甲等醫(yī)院ICU，此5所醫(yī)院分布于海珠、天河、白云三個(gè)區(qū)，區(qū)域跨度大，皆處于人口稠密地段，提示廣州地區(qū)ICU 環(huán)境可能存在較大范圍的A克隆CRAB定植；此5所醫(yī)院ICU采樣時(shí)間分布在4～7月，其中，4月份采樣的E醫(yī)院有2株，5月份的F、G和H醫(yī)院分別有8、5和5株，7月份的J醫(yī)院有8株，整體上CRAB分離株數(shù)量呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，此時(shí)間段廣州氣候由潮濕多雨過(guò)渡到干燥炎熱，A克隆CRAB在ICU環(huán)境中的定植是否與氣候變化存在聯(lián)系，有待進(jìn)一步研究。此外，B克隆4株菌來(lái)自越秀區(qū)的另一所醫(yī)院，說(shuō)明廣州地區(qū)ICU環(huán)境主要流行A克隆CRAB外，也存在小范圍的其他克隆群的定植情況。

1998年Maiden等[12]提出的MLST技術(shù)，能較好的發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的變異信息，國(guó)際上已有大型公共數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站可供結(jié)果比對(duì)。39株CRAB共分為8個(gè)ST型，其中ST195占48.7%，為主要流行型別，該型分布于5間醫(yī)院的ICU環(huán)境中，主要定植于床單元的高頻接觸物品表面。此外，通過(guò)克隆復(fù)合體的分析發(fā)現(xiàn)，除了ST229外，其余7個(gè)ST型均屬于同一個(gè)克隆復(fù)合體CC92。CC92是世界上分布最廣泛的鮑曼不動(dòng)桿菌克隆復(fù)合體，其祖先為ST92。目前，諸如ST195、ST208、ST75等ST92的單基因變異型(SLVs)已成為我國(guó)某些地方特有的基因型[13-14]。有文獻(xiàn)[15-16]報(bào)道,廣州市醫(yī)院臨床分離的鮑曼不動(dòng)桿菌ST型主要為ST195、ST136和ST208，與本研究7所醫(yī)院ICU環(huán)境中分離的耐碳青霉烯鮑曼不動(dòng)桿菌ST型的主要分布具有相似性。

在我國(guó)，許多流行病學(xué)研究已經(jīng)證實(shí)CC92克隆復(fù)合體高頻率攜帶OXA-23基因[14-15]。最近有文獻(xiàn)[17]報(bào)道，廣州某2所醫(yī)院ICU存在ST195(CC92)菌株的感染傳播，菌株皆攜帶OXA-23基因。本研究中,ICU環(huán)境中CRAB的主要型別ST195均攜帶OXA-23基因，與前面的臨床分離株結(jié)果相同。同時(shí)，PFGE分型的主要型別A克隆也均攜帶OXA-23基因。

本研究同時(shí)應(yīng)用PFGE和MLST方法對(duì)CRAB菌株進(jìn)行了分子分型，均得到了一個(gè)主要的流行克隆，分別為克隆A和ST195。ST195菌株絕大部分屬于克隆A，而MLST將克隆A分成5個(gè)ST型。J醫(yī)院的8株CRAB皆屬于A克隆，而通過(guò)MLST技術(shù)可分成ST365、ST195和ST457，究其原因，可能是CRAB在繁殖或進(jìn)化過(guò)程中發(fā)生堿基突變、重組等變異，該變異正好發(fā)生在用于MLST分型的7個(gè)管家基因中的某一個(gè)或幾個(gè)基因的某些位點(diǎn)。PFGE通過(guò)脈沖場(chǎng)凝膠電泳分離大的酶切DNA片段，比較指紋圖譜來(lái)確定細(xì)菌的分型,主要用于短期內(nèi)、較小范圍的菌株分析，如醫(yī)院感染暴發(fā)時(shí)耐藥菌的同源性分析，而MLST通過(guò)直接測(cè)定多個(gè)管家基因的核苷酸序列來(lái)確定細(xì)菌的ST型，較好地反映出進(jìn)化和族群生物學(xué)變異，兩種分型方法在原理和主要目的方面均存在較大差異，故分型結(jié)果可能會(huì)存在較大不同。

綜上所述，廣州市醫(yī)院ICU環(huán)境中存在攜帶OXA-23基因的CRAB克隆傳播，應(yīng)加強(qiáng)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)，采取有效的消毒隔離措施，減少由CRAB引起的醫(yī)院感染。

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